丁小強，陳麗麗，白春清，袁美蘭，趙利

(江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013)

美拉德反應對魚蛋白酶解物抗氧化活性的影響

丁小強，陳麗麗，白春清，袁美蘭，趙利*

(江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013)

文章以魚糜漂洗液回收蛋白酶解物為原料，分別與葡萄糖、D-果糖、蔗糖、乳糖反應制備美拉德反應產(chǎn)物，探討美拉德反應對酶解物抗氧化活性的影響。以DPPH自由基清除率為指標，選出葡萄糖作為美拉德反應的最適糖，通過響應面優(yōu)化試驗得出最佳反應條件：加熱溫度為126.92 ℃、反應初始pH為10.39、反應時間為3.89 h、葡萄糖濃度為3 g/dL。在此條件下，羥基自由基清除能力從34.83%增加到61.82%，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力也有所提高。因此，美拉德反應可以提高魚糜漂洗液回收蛋白酶解物的抗氧化能力。

美拉德反應；魚蛋白酶解物；DPPH自由基清除率；抗氧化能力

魚糜是我國水產(chǎn)制品加工中重要的中間原料，在魚糜生產(chǎn)加工中會產(chǎn)生大量富含蛋白的廢水，蛋白質(zhì)的含量高達0.9%～2.8%，約占魚肉蛋白的30%～40%[1]。魚糜漂洗液回收蛋白中氨基酸種類齊全，比例均衡，符合 FAO/WHO 推薦的理想蛋白質(zhì)模式，是理想的優(yōu)質(zhì)蛋白[2]。目前，關于從魚糜漂洗液中回收蛋白的方法報道較多[3-5]，可是對回收蛋白進行深加工的研究報道較少，因此有效開發(fā)利用其回收蛋白資源，是一項非常有意義的研究。

有研究表明，一些合成類抗氧化劑可能具有致癌性，很多國家較少添加到食品加工中[6]。而一些天然抗氧化性物質(zhì)又常因穩(wěn)定性差、成本高、風味差等因素，不能廣泛使用在工業(yè)生產(chǎn)中[7]。自20世紀80年代以來，對美拉德反應產(chǎn)物抗氧化性能方面的研究已經(jīng)比較廣泛，但對回收蛋白酶解物美拉德反應的抗氧化性卻少有報道。

本文以回收蛋白酶解物和不同糖進行美拉德反應并制備其產(chǎn)物，以DPPH自由基清除率為指標，在溫度、pH值、糖濃度、加熱時間4個單因素試驗的基礎之上，運用響應面分析法對回收蛋白酶解物美拉德反應工藝進行優(yōu)化，同時比較反應前后的抗氧化性質(zhì)，旨在為魚糜漂洗液回收蛋白的深加工利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漂洗液回收蛋白 實驗室自制；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma 公司；堿性蛋白酶(Alcalase) 北京諾維信生物技術有限責任公司；鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑 均為分析純。

1.2 儀器與設備

12-H型絞肉機 上海標本模型廠；水熱合成反應釜 西安常儀儀器設備有限公司；85-1型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；TDL-5A型離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA224S-CW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜漂洗液中蛋白的回收

新鮮魚肉絞碎→加水攪拌10 min→四層紗布過濾→調(diào)節(jié)漂洗液pH為5.5→5000 r/min離心5 min→回收蛋白。

1.3.2 美拉德反應中糖種類的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、糖濃度為1 g/dL、加熱溫度為90 ℃、反應時間為3 h、反應初始pH值為8時，分別選用果糖、葡萄糖、乳糖以及蔗糖與酶解物進行美拉德反應。

1.3.3 美拉德反應的單因素試驗

1.3.3.1 初始pH的選擇

選擇葡萄糖進行進一步美拉德反應試驗。在酶解物濃度為3 g/dL、糖濃度為1 g/dL、加熱溫度為90 ℃的反應條件下，分別調(diào)整反應初始pH值為8，9，10，11，12，反應3 h后測定DPPH自由基清除率，確定最適初始pH值。

1.3.3.2 反應時間的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、糖濃度為1 g/dL、加熱溫度為90 ℃、反應初始pH值為11的反應條件下，分別調(diào)整反應時間為1，2，3，4，5 h，反應后測定DPPH自由基清除率，確定最適反應時間。

1.3.3.3 糖濃度的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、加熱溫度為90 ℃、反應初始pH值為11的反應條件下，分別調(diào)整糖濃度為1，2，3，4，5 g/dL，反應3 h后測定DPPH自由基清除率，確定最適糖濃度。

1.3.3.4 加熱溫度的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、反應初始pH值為11、糖濃度為3 g/dL的反應條件下，分別調(diào)整加熱溫度為80，90，100，110，120，130，140 ℃，反應3 h后測定DPPH自由基清除率，確定最適加熱溫度。

1.3.4 響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，運用 Box-Behnken 的中心組合[8]，以DPPH自由基清除率為響應值，選用時間、溫度和pH 3個要素進行三因素三水平的響應面分析試驗，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 響應面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照 Tang Chuanhe等[9]的方法，并稍作修改。將適當稀釋的樣品2.0 mL及4.0 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液加入同一試管中均勻混合，室溫避光條件下靜置30 min后于517 nm波長處測定其吸光度值(At)?？瞻孜舛戎?Ac)以蒸餾水代替樣品，對照空白吸光度值(Ab)以乙醇代替DPPH乙醇溶液。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(At-Ab)/Ac]×100。

1.3.6 還原力的測定

還原力的測定參照 Gu Fenglin等[10]的方法。取適當稀釋的樣品2 mL，依次加入2 mL 0.2 mol/LpH 6.6的磷酸鹽緩沖液和及2 mL 1%(W/V)的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50 ℃下保溫20 min，快速冷卻，加入2 mL 10%(W/V)三氯乙酸溶液混勻，于3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，依次加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵混勻，靜置10 min后于波長700 nm處測定其吸光度值。以吸光度值表示樣品的還原能力，吸光度越大，樣品的還原能力越強。

1.3.7 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除能力的測定參照沈晗等[11]的方法，并稍作修改。取1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液于具塞試管中，依次加入2 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.40)和1 mL蒸餾水，充分混勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，混勻后加入1 mL 0.01%的H2O2，37 ℃水浴保溫60 min，于波長536 nm處測定吸光值(A損)，樣品管及未損傷管分別以樣品溶液、蒸餾水代替損傷管中的H2O2，同等操作下分別測得吸光值(A樣)、(A未)。羥基自由基清除率計算公式如下：

1.3.8 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基清除能力的測定參照Roberta Re等[12]的方法。將20 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液與352 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀水溶液混合，室溫避光放置12～16 h,使用前用無水乙醇稀釋該混合液，使其在30 ℃時734 nm處的吸光值為0.7±0.02，取5 mL該溶液與50 μL樣品液混合，30 ℃水浴6 min后測定吸光度值(A)，同等條件下測得空白樣品吸光度值(A0)，ABTS自由基清除率計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 糖種類的選擇

4種糖與酶解物進行美拉德反應后的抗氧化效果見圖1。

圖1 不同糖種類對反應產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of different types of sugar on antioxidant activity of reaction product

由圖1可知，葡萄糖與酶解物發(fā)生反應后，其對DPPH自由基的清除能力及還原力均為最強，因此本實驗選用最佳效果的葡萄糖與回收蛋白酶解物進行美拉德反應條件優(yōu)化。

2.2 美拉德反應的單因素試驗

2.2.1 初始pH的影響

圖2 不同初始反應pH對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different initial reaction pH on DPPH radical scavenging activity

由圖2可知，美拉德產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率隨初始pH值的增大呈先升后降的趨勢。在pH值為11時，對DPPH自由基的清除率達到最大值。這主要是因為在高pH值環(huán)境下有利于羰氨縮合，使吡嗪類及糠醛類產(chǎn)物增加；同時高pH值有助于糠醛類物質(zhì)重排成還原酮類產(chǎn)物，引起褐變，而美拉德產(chǎn)物的抗氧化性與其褐變程度密切相關[13]。因此，本實驗選擇最佳反應pH為11。

2.2.2 反應時間的影響

反應時間對DPPH自由基清除率的影響見圖3。

圖3 不同加熱時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different heating time on DPPH radical scavenging activity

由圖3可知，當反應時間從1 h延長到3 h時，美拉德產(chǎn)物對DPPH自由基清除率增加幅度較大，而3～5 h內(nèi)，對DPPH自由基清除率趨于平緩。因此，本實驗選擇最佳反應時間為3 h。

2.2.3 糖濃度的影響

DPPH自由基清除率與葡萄糖濃度的關系見圖4。

圖4 不同葡萄糖濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of different glucose concentration on DPPH radical scavenging activity

由圖4可知，美拉德產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率隨著葡萄糖濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后平緩的趨勢。當葡萄糖濃度從1 g/dL增加到3 g/dL時，美拉德產(chǎn)物對DPPH自由基清除率增加幅度較大；當葡萄糖濃度超過3 g/dL時，美拉德產(chǎn)物對DPPH自由基清除率趨于平緩。這可能是酶解物提供氨基的數(shù)量有限造成的，為了節(jié)約葡萄糖，本實驗選擇最佳葡萄糖濃度為3 g/dL。

2.2.4 溫度的影響

加熱溫度對DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 不同加熱溫度對 DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of different heating temperatures on DPPH radical scavenging activity

隨著加熱溫度的不斷升高，美拉德產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率先增大后趨于平緩；當加熱溫度從80 ℃升至120 ℃時，對DPPH自由基清除率快速上升；當加熱溫度大于120 ℃時，DPPH自由基清除率趨于平緩。這可能是由于高溫有利于具有抗氧化作用的類黑精、還原酮及含N，S的雜環(huán)化合物的生成。因此，本實驗選擇最佳加熱溫度為120 ℃。

2.3 美拉德反應條件的響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面試驗及方差分析

綜合單因素試驗結果，選擇pH值、時間、溫度為變量，以DPPH自由基清除率為指標，使用 Box-Benhnken 試驗設計的基本思路，實施三因素三水平的響應面試驗，見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

使用Design-Expert 7.0 軟件處理，得出各項回歸系數(shù)，形成DPPH自由基清除率及三因素的數(shù)學回歸模型：DPPH自由基清除率=79.93+11.50X1+7.50X2-7.97X3+0.81X1X2-3.54X1X3+1.23X2X3-8.02X12-5.39X22-8.40X32。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

注：P<0.05，表示差異顯著；P<0.01，表示差異極顯著。

由表3可知，DPPH自由基清除率的回歸模型具有高度顯著性；且失擬項P=0.6312>0.05，不顯著，由于失擬項用來表現(xiàn)預測值與真實值不相符的概率[14]，因此此模型合理；RAdj2為0.973，表明此模型能反映約97.3%實際值，所以此模型可以用來分析和預測回收蛋白酶解物與葡萄糖美拉德反應中各要素對DPPH自由基清除率的影響。分析均方可知，三要素對DPPH自由基清除率的影響次序是加熱時間>初始pH值>加熱溫度。

2.3.2 最佳工藝條件及驗證

經(jīng)響應面分析得出美拉德反應最佳工藝條件，即溫度126.92 ℃、pH值10.39、時間3.89 h、糖添加量3 g/dL，此時DPPH自由基清除率為90.0716%。為了檢驗此模型的正確性，選用堿性蛋白酶酶解溫度為127 ℃、酶解pH值為10.4、糖添加量為3 g/dL、加熱時間為3.9 h的前提下進行反應，得出實際DPPH自由基清除率為88.56%。模型預測值與真實值基本相同，表明模型可靠有用。

2.4 酶解物美拉德反應前后抗氧化性的比較

2.4.1 還原力的比較

圖6 美拉德反應前后酶解物的還原力對照Fig.6 Reducing power of hydrolysates before and after Maillard reaction

由圖6可知，酶解物在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，吸光值逐漸增加；而美拉德產(chǎn)物在濃度1～4 mg/mL范圍內(nèi)，吸光值顯著增加，當濃度達到4 mg/mL時，吸光值達到較高值，之后隨著濃度繼續(xù)增加而趨于平緩。相同濃度下，美拉德產(chǎn)物的吸光值顯著性高于相應的酶解物，表明酶解物經(jīng)過美拉德反應之后，還原力顯著提高。這是因為美拉德產(chǎn)物可以作為一個較強的供電子體，表現(xiàn)強還原力[15]。

2.4.2 DPPH自由基清除能力的比較

圖7 美拉德反應前后酶解物的DPPH自由基清除能力對比Fig.7 DPPH radical scavenging activity of hydrolysates before and after Maillard reaction

由圖7可知，酶解物在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)，具有一定的DPPH清除能力，但比較弱，且隨濃度的增加，變化不明顯；而美拉德產(chǎn)物在濃度0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH清除能力顯著增加，在濃度為0.6 mg/mL時達到較高水平，之后隨著濃度繼續(xù)增大趨于平緩，且顯著性高于相應酶解物的清除率，這表明酶解物經(jīng)過美拉德反應之后DPPH清除能力顯著提高。

2.4.3 ABTS自由基清除能力的比較

不同濃度的酶解物和美拉德產(chǎn)物對ABTS自由基清除能力效果見圖8。

圖8 美拉德反應前后酶解物的ABTS清除能力對比Fig.8 ABTS scavenging activity of hydrolysates before and after Maillard reaction

由圖8可知，隨著樣品濃度的增加，兩者對ABTS清除能力都隨之增大，且增長趨勢相似。相同濃度下，美拉德產(chǎn)物的 ABTS 自由基清除率高于酶解物。這可能是由于美拉德產(chǎn)物中具有芳香特性的雜環(huán)化合物電子過剩，有利于自由基親電加成，從而起到清除自由基作用[16]。

2.4.4 羥基自由基清除能力的比較

物質(zhì)對羥基自由基清除能力大小可以作為反映其抗氧化作用的重要指標，見圖9。

圖9 美拉德反應前后酶解物的羥基自由基清除能力對比Fig.9 Hydroxyl radical scavenging activity of hydrolysates before and after Maillard reaction

酶解物清除羥自由基能力較低，經(jīng)過美拉德反應后，羥基自由基清除能力顯著提高，約為反應前的2倍。這表明酶解物經(jīng)過美拉德反應，提高了酶解物的抗氧化能力。

3 結論

選用4種糖與魚糜漂洗液回收蛋白酶解物進行美拉德反應，以還原力及DPPH自由基清除率為指標，得出葡萄糖為最適糖。

葡萄糖與回收蛋白酶解物美拉德反應的最適條件為：溫度126.92 ℃、pH值10.39、時間3.89 h、糖濃度3 g/dL。

回收蛋白酶解物美拉德反應后還原力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力增加較為明顯，這表明回收蛋白酶解物美拉德產(chǎn)物可以作為一種具備優(yōu)良抗氧化性的食品添加劑，為回收蛋白開發(fā)使用開拓了新路徑。

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EffectofMaillardReactiononAntioxidantActivityofFishProteinHydrolysates

DING Xiao-qiang, CHEN Li-li, BAI Chun-qing, YUAN Mei-lan, ZHAO Li*

(College of Life Science，Jiangxi Science and Technology Normal University，National Freshwater Fish Processing Technology Research and Development Branch，Nanchang 330013,China)

Enzymatic hydrolyzates of proteins are recovered from surimi washings as raw materials, Maillard reaction products (MRPs) are prepared by the reaction with four different varieties of sugar (glucose,D-fructose, sucrose and lactose), the impacts of Maillard reaction on antioxidant activity are studied in this research. Glucose is identified as the most suitable sugar based on DPPH radical scavenging activity, according to response surface, the optimal Maillard reaction conditions are obtained as follows: heating temperature is 126.92 ℃, initial reaction pH is 10.39, reaction time is 3.89 h and glucose concentration is 3 g/dL.Under the optimal reaction conditions, hydroxyl radical scavenging activity is increased from 34.83% to 61.82%, DPPH radical scavenging activity, ABTS scavenging activity and reducing power are enhanced.It indicates that the antioxidant activities of recovered fish protein hydrolysates from surimi washings are improved by Maillard reaction.

Maillard reaction;fish protein hydrolysates;DPPH radical scavenging activity;antioxidant activity

TS254.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.006

1000-9973(2017)11-0029-06

2017-05-15 *通訊作者

江西省高等學?？萍悸涞赜媱濏椖?KJLD12009)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助(贛財教指2013-258)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(國科辦農(nóng)[2014]42號)

丁小強(1989-)，男，江西新余人，碩士，研究方向：食品化學；

趙利(1967-)，女，教授，博士，研究方向：食品化學。