侯衛(wèi)華，李從洋，孟祥超，于兵兵，劉艷峰，張 萌，王建業(yè)，段尚林，胡學信(中國人民解放軍第152中心醫(yī)院病理科，河南 平頂山 467000)

甲狀腺乳頭狀癌組織中CK34βE12、MC的表達和BRAF基因突變的意義

侯衛(wèi)華，李從洋，孟祥超，于兵兵，劉艷峰，張 萌，王建業(yè)，段尚林，胡學信
(中國人民解放軍第152中心醫(yī)院病理科，河南 平頂山 467000)

目的探討高分子量角蛋白CK34βE12、間皮細胞(MC)表達和BRAF基因突變在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中的臨床意義。方法采用免疫組化Envision兩步法檢測88例PTC和88例甲狀腺良性病變(BTL)中CK34βE12、MC的表達；采用PCR及DNA測序法檢測36例PTC和36例BTL中BRAF基因突變狀況，分析其與PTC臨床病理特征的關系。結果88例PTC組織中CK34βE12、MC陽性率分別為96.6%、95.5%，高于BTL組織中的13.6%、6.8%(P<0.05)。CK34βE12、MC在PTC組織中表達的敏感性分別為96.6%、95.5%，特異性分別為86.4%、93.2%。36例PTC組織中BRAF突變率為63.9%，高于BTL組織中的0.0%(P<0.05)。BRAF突變與腫瘤淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。結論檢測CK34βE12、MC在PTC與BTL鑒別診斷中具有重要實用價值；BRAF突變對確診PTC具有重要臨床意義，且可能是預測PTC侵襲轉移能力的指標。

甲狀腺腫瘤；乳頭狀癌；免疫組化；高分子角蛋白；間皮細胞；BRAF基因

甲狀腺乳頭狀癌(papilary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤,病理診斷主要依據(jù)典型的細胞核特征及復雜的乳頭狀結構，而有時一些甲狀腺良性病變(benign thyroid lesions，BTL)亦可呈乳頭狀或假乳頭狀增生，當細胞核的特征不典型時鑒別診斷常會存在一定困難；包裹性濾泡型乳頭狀癌當細胞核的特征不明顯時與濾泡性腺瘤鑒別更有一定難度，因此，借助有效的免疫標志物及分子檢測對其確診將有重要臨床意義。本研究旨在通過檢測PTC組織中高分子量角蛋白CK34βE12、間皮細胞(mesothelial cell，MC)的表達和BRAF基因突變的狀況，探討這些指標在PTC和BTL鑒別診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2016年6月中國人民解放軍第152中心醫(yī)院病理科甲狀腺手術存檔標本176例，其中PTC 88例、BTL 88例。88例PTC患者年齡19～70歲，中位年齡42歲，<40歲者36例，≥40歲者52例；男23例，女65例。PTC單發(fā)癌結節(jié)46例，多發(fā)癌結節(jié)42例；結節(jié)直徑<1 cm者35例，≥1 cm者53例。29例合并中央?yún)^(qū)和(或)頸部淋巴結轉移癌，59例無淋巴結轉移癌。88例BTL多取自上述標本的癌旁BTL或健側葉BTL組織(結節(jié)性甲狀腺腫48例，橋本氏甲狀腺炎20例)及濾泡性腺瘤20例，患者年齡22～71歲，中位年齡47歲；男23例，女65例。對其中2015年1月至2016年6月的PTC和BTL各36例存檔蠟塊進行BRAF基因檢測。36例PTC患者中位年齡45(21～69)歲，其中<40歲者16例，≥40歲者20例；男12例，女24例；PTC單發(fā)癌結節(jié)19例，多發(fā)癌結節(jié)17例；結節(jié)直徑<1 cm者14例，≥1 cm者22例；14例合并中央?yún)^(qū)和(或)頸部淋巴結轉移癌，22例無淋巴結轉移癌。36例BTL患者年齡20～69歲，中位年齡44歲；男10例，女28例。

1.2主要試劑與設備免疫組化所用一抗[CK34βE12(34βE12)、MC(HBME-1)]和Envision檢測試劑盒購于福州邁新生物技術有限公司。DNA提取試劑盒和BRAF基因(DNA測序法)檢測試劑盒購于北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司。檢測設備采用ABI 3130 DNA測序儀及ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.3方法免疫組化法：所有標本均經(jīng)質量分數(shù)4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3 μm，免疫組化采用Envision二步法，按說明書步驟進行操作，使用陽性對照片作陽性對照，TBS液代替一抗作陰性對照，研究標本與對照片進行同步染色。結果判斷：CK34βE12陽性位于細胞質，MC位于細胞膜。陽性是指細胞質或細胞膜上呈淺黃色至棕褐色。綜合判斷染色強度評分和高倍鏡下陽性細胞百分比評分。按染色強度評分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按陽性細胞百分比評分：顯微鏡下隨機取5個高倍視野，計算陽性細胞的平均百分比，≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。計算染色強度得分和陽性細胞百分比得分之和，其中0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

PCR和DNA測序法：鏡下選取富含腫瘤成分的石蠟包埋組織塊，每例組織塊連續(xù)切6張10 μm厚的組織片，直接封裝于EP管中，二甲苯脫蠟、蛋白酶消化，按DNA提取試劑盒要求提取樣本DNA，將待測樣本、BRAF陰性及陽性質控品依次加樣，完成配置反應體系，應用PCR對樣本DNA-BRAF基因的第15外顯子進行擴增，然后置于全自動基因分析儀內進行測序。結果分析采用Chromas軟件，清除不穩(wěn)定序列后，與野生型序列比較，600(T1799A)位密碼子GTG變成GAG( T→A)時為突變，即密碼子600的錯義突變(V600E)。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，率的比較用χ2檢驗(必要時連續(xù)校正)或Fisher確切概率法，同時按照臨床流行病學診斷試驗研究評價計算方法，計算不同免疫標志物敏感性和特異性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1CK34βE12、MC的表達CK34βE12、MC在PTC組織中的陽性率分別為96.6%、95.5%，兩者均以中等強度至強陽性為主，而在BTL組織中的陽性率分別為13.6%、6.8%，主要為弱陽性，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。CK34βE12、MC在PTC組織中的表達分別與結節(jié)性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、濾泡性腺瘤比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。PTC組織中CK34βE12、MC的陽性表達與患者的性別、年齡、結節(jié)直徑、結節(jié)數(shù)目及淋巴結有無轉移無關(P均>0.05)。見圖1,表1、2。

圖1 PTC組織中CK34βE12(A,×200)和MC(B,×400)的表達

表1 PTC和BTL組織中CK34βE12、MC的表達

注：表中統(tǒng)計量為各標本與PTC比較的統(tǒng)計量

表2 CK34βE12、MC的表達與PTC臨床病理參數(shù)的關系

2.2CK34βE12、MC表達的敏感性和特異性CK34βE12和MC在PTC中表達的敏感性分別為96.6%(85/88)、95.5%(84/88)，特異性分別為86.4%(76/88)、93.2%(82/88)。

2.3PTC和BTL組織中BRAF(V600E)突變情況PTC組織中63.9%(23/36)的病例第15外顯子的第1 799位點存在T→突變，全部為雜合性突變，而BTL無一例發(fā)生突變，突變率為0.0%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PTC組織中BRAF突變與有無淋巴結癌轉移有關(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、結節(jié)數(shù)目和直徑無關(P均>0.05)。見表3。

表3 BRAF基因突變與PTC臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

單克隆抗體CK34βE12是一組包括角蛋白1、5、10和14的中間絲結構蛋白，相對分子質量為40 000～68 000，是上皮細胞的主要細胞骨架成分，這些中間絲被當作張力絲通過橋粒與相鄰細胞固定在一起，使得上皮具有伸展性和穩(wěn)定性。甲醛溶液固定石蠟包埋組織的免疫反應，需要抗原修復，陽性定位于細胞質。國外文獻[1-2]報道，CK34βE12在PTC組織中呈強陽性表達，有助于鑒別PTC和甲狀腺腺瘤等，且在BTL組織中不表達或灶性弱表達。Liberman等[3]報道CK34βE12表達于91%的PTC，并將其解釋為CK1上的抗原決定簇的存在，或是存在一種不能被CK5、CK10、CK14抗體所識別的抗原決定簇。我們的研究結果顯示CK34βE12在PTC組織中的陽性率96.6%，而在BTL組織為13.6%，差異有統(tǒng)計學意義，具有較高敏感性和特異性，可作為甲狀腺良、惡性病變鑒別診斷中的參考指標。

MC是間皮細胞表面的一種酸性多聚糖蛋白，主要為透明質酸，最初發(fā)現(xiàn)其主要表達于間皮源性腫瘤，隨著對其用途研究的深入，近年來國內外文獻[4-7]均有將其用于甲狀腺良、惡性疾病鑒別診斷的報道。MC陽性染色主要定位于細胞膜，在PTC中以中等強度至強陽性為主，陽性率為98.9%，而在BTL中主要為弱陽性，陽性率為6.8%。研究結果證實MC在PTC組織中陽性率明顯高于BTL，且具有較高敏感性和特異性，對于PTC和BTL鑒別診斷具有重要參考價值。

BRAF是RAF基因家族中的癌基因之一，編碼絲/蘇氨酸的一種特異性激酶，參與調控細胞增殖分化和凋亡。BRAF基因位于7p34，編碼783氨基酸的蛋白，相對分子質量為94 000～95 000。近年來發(fā)現(xiàn)結直腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌及惡性黑色素瘤等多種惡性腫瘤均可存在BRAF基因突變。研究[8-11]認為，在PTC及合并PTC的甲狀腺未分化癌中，BRAF突變與PTC的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，因此，有學者認為未分化癌是PTC發(fā)生去分化而來。BRAF突變主要發(fā)生于第15外顯子的第1 799位點上，此處的腺嘌呤變成胸腺嘧啶(T1799A)，導致編碼的第600位氨基酸由谷氨酸被纈氨酸(V600E)替代，致BRAF激酶活性增強，V600E突變模擬T598和S601磷酸化作用，導致BRAF蛋白活化，從而促使甲狀腺細胞不斷增殖形成腫瘤。本研究結果顯示，PTC組織中BRAF突變率為63.9%，而在BTL中均未檢測到BRAF突變，與文獻[4,9-12]研究結果相同，因此，可以確定BRAF突變是PTC的重要遺傳學事件，對PTC的確診亦有著重要意義。在本研究中BRAF突變與PTC局部侵襲能力及淋巴結轉移顯著相關，因此，BRAF突變是PTC預后差的重要提示因素[10-14]。

綜上所述，PTC組織中CK34βE12、MC彌漫表達，以及BRAF突變可作PTC和BTL鑒別診斷的重要輔助手段，BRAF突變還可作為評價PTC生物學行為的重要指標。當遇見不典型病例或鑒別診斷有困難時，檢測上述指標具有重要參考價值，有助提高正確診斷率。

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SignificanceofCK34βE12,MCExpressionandBRAFGeneMutationinthePapilaryThyroidCarcinoma

HOU Weihua,LI Congyang,MENG Xiangchao,YU Bingbing,LIU Yanfeng,ZHANG Meng, WANG Jianye,DUAN Shanglin,HU Xuexin
(DepartmentofPathology,the152HospitalofPLA,Pingdingshan467000,China)

ObjectiveTo explore the significance of CK34βE12,mesothelial cell (MC) expressions and BRAF gene mutation in the papilary thyroid carcinoma.MethodsThe expressions of CK34βE12 and MC protein in the 88 cases of PTC tissues and the 88 cases of benign thyroid lesions (BTL) were detected by immunohistochemical Envi sion method; The mutation status of BRAF protein in the 36 cases of PTC tissues and the 36 cases of BTL tissues were detected by PCR and DNA sequencing,the relationship between them and the clinical pathological characteristics were analyzed.ResultsThe positive rate of CK34βE12 and MC in the PTC was respectively 96.6% and 95.5%,and was respectively 13.6% and 6.8% in the BTL,the difference was statistically significant (P<0.05).The sensitivity of MC and CK34βE12 in the PTC was 96.6% and 95.5% respectively,and the specificity was 86.4% and 93.2% respectively.The BRAF mutation rate in the PTC was 63.9%,and was 0.0% in the BTL,the difference was statistically significant (P<0.05).The BRAF mutation was closely related with lymph node metastasis (P<0.05).ConclusionThe detection of CK34βE12 and MC has the important practical value in the differential diagnosis of PTC and BTL; the BRAF mutations has the important clinical significance in the diagnosis of PTC,and may be a index to forecast invasion and metastasis in the PTC.

thyroid neoplasms; papillary carcinoma; immunohistochemistry; high molecular weight keratin; mesothelial cell; BRAF gene

侯衛(wèi)華(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤病理研究。E-mail：hou.wh@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.004

R736.1;R730.23

A

1673-5412(2017)05-0377-05

2016-12-01)