劉杰++劉福頌+王芳+邢曉博+樊光紅++朱玉召++張克傳++孫芳芳

[摘要] 目的 研究中國人家族性肥厚型心肌?。℉CM）的致病基因，分析基因型與臨床表型的關系。 方法 以2016年青島市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科1例住院患者為先證者的HCM家系，在此HCM家系中進行了包括心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白C（MYBPC3）在內(nèi)的30個HCM相關的致病基因的編碼區(qū)及側(cè)翼區(qū)進行了檢測，利用靶向外顯子捕獲測序的方法對HCM先證者的30個與遺傳性心肌病相關的基因進行全外顯子擴增和高通量測序，進一步通過Sanger測序法在家系內(nèi)及200名健康志愿者中進行驗證。家系調(diào)查資料包括臨床表現(xiàn)、體格檢查、心電圖及超聲心動圖。 結(jié)果 該家系共6人，有血緣關系的4例研究對象中，3例攜帶MYBPC3基因c.G772A雜合錯義突變，該突變位點位于MYBPC3基因第6號外顯子上，并使258位的谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘），該家系先證者攜帶MYBPC3突變，中年發(fā)病，臨床表型溫和，超聲示室間隔明顯增厚（厚度為18.3 mm）。 結(jié)論 MYBPC3基因c.G772A雜合錯義突變可能是該HCM家系的致病突變，其攜帶者臨床表型溫和，有的無臨床表現(xiàn)，提示其他因素如其他基因、年齡、環(huán)境等因素參與了HCM的發(fā)展過程。

[關鍵詞] 肌球蛋白結(jié)合蛋白C；肥厚型心肌??；突變

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（b）-0065-04

Research on the mutation of cardiac myosin binding protein C gene c.G772A in familial hypertrophic cardiomyopathy

LIU Jie*▲ LIU Fusong*▲ WANG Fang XING Xiaobo FAN Guanghong ZHU Yuzhao ZHANG Kechuan SUN Fangfang

Department of Cardiology， the Third People′s Hospital of Qingdao， Shandong Province， Qingdao 266000， China

[Abstract] Objective To study the pathogenic gene of Chinese familial hypertrophic cardiomyopathy （HCM）， and to analyze the relationship between genotype and clinical phenotype. Methods One inpatient treated in Department of Cardiology， the Third People′s Hospital of Qingdao in 2016 was taken as the HCM family of proband， in which， the coding region and flanking region of 30 virulence gene related to HCM including cardiac myosin binding protein C （MYBPC3） were detected， and the 30 genes related to hereditary cardiomyopathy of HCM proband were identified by whole exons amplification and high-throughput sequencing through targeted exon trapping sequencing， and the identified mutation was further detected through bi-directional Sanger sequencing in the family members and 200 healthy volunteers. Pedigree analysis included clinical manifestation， physical examination， ECG and echocardiogram. Results Among 4 blood-related members in the six members of family， 3 members had MYBPC3 gene c.G772A hybrid missense mutation. The mutation was existed in the 6th exon of MYBPC3 gene， which made a 258-bit glutamic acid （E） into a lysine （K）. The proband of the family carried on MYBPC3 mutation， who was attacked in the middle-age， clinical phenotype was mild， and the ultrasound showed that the interventricular septum was significantly thickened （the thickness was 18.3 mm）. Conclusion MYBPC3 gene c.G772A hybrid missense mutation may be the pathogenic mutations of this HCM family. Some carriers have mild clinical phenotype， and some have no clinical manifestation， which suggests that other factors such as other genes， age， environment also participate in the development process of HCM.endprint

[Key words] Cardiac myosin binding protein-C； Hypertrophic cardiomyopathy； Mutation

肥厚型心肌?。℉CM）是最常見的常染色體顯性遺傳的的心肌疾病，以勞力性呼吸困難、胸痛、暈厥、猝死、心力衰竭為臨床癥狀，是導致青少年或運動員猝死的主要原因[1-2]，其發(fā)病率在普通人群中約為1/500[3]。其中50%具有明顯的家族聚集性，稱之為家族性HCM（FHCM）。肌球蛋白結(jié)合蛋白C（CMYBPC3）基因突變是導致HCM最常見的原因之一[4-5]。因HCM呈常染色體顯性遺傳，且雜合致病變異攜帶者其子女遺傳該變異的可能性為50%，故對HCM患者及其家系成員的早期基因診斷和排查具有重要意義。本研究對一個漢族HCM家系進行了全面的致病基因檢測，發(fā)現(xiàn)受檢者攜帶MYBPC3基因p.E258K雜合錯義突變，探討其基因型與表型的關系，指導臨床診治。

1 對象與方法

1.1 對象

研究對象為一中國北方地區(qū)漢族HCM家系（圖1），先證者為2016年青島市第三人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）心內(nèi)科住院患者1例，共3代6人參與本研究。HCM診斷標準符合2011年美國心臟病學會基金會（ACCF）/美國心臟協(xié)會（AHA）HCM診斷和治療指南的診斷標準，即臨床上不能解釋的、無心室腔擴張的左心室肥厚（超聲心動圖示左室厚度≥15 mm），且無其他導致心室肥厚的心臟疾病或系統(tǒng)性疾病[6]。同時滿足2014年歐洲心臟病學會HCM診斷與治療指南的診斷標準[7]。對照組200例健康志愿者。本研究經(jīng)過我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象已簽署知情同意書。

圖1 攜帶MYBPC3 c.G772A（E258K）突變的家系圖譜

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 臨床資料包括體格檢查、心電圖、二維及多普勒超聲心動圖檢查、冠脈CTA及冠狀動脈造影。

1.2.2 基因組DNA提取 采集HCM患者及正常對照者外周靜脈血5 mL，置于含有EDTA的抗凝管中備用，采用吸附法DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN公司，Hilden，Germany）提取血液樣本中的DNA，經(jīng)過瓊脂糖電泳鑒定樣本DNA質(zhì)量合格后置于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 基因分析 用3.0 μg DNA作為起始，根據(jù)Agilent's SureSelect XT target enrichment system的實驗流程來制備文庫，再使用設計好的探針（諾心安panel Bestnovo公司，Beijing，China）對目標區(qū)域完成捕獲，利用靶向外顯子捕獲測序技術(shù)對30個與遺傳性心肌病相關的基因按照Illumina-SolexaHiSeq2000程序裝置進行第2代測序（next generation sequencing，NGS），測序儀器為MiSeq System（Illumina公司，San Diego，California）。運用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq程序來分析測序結(jié)果，明確突變位點，進一步通過一代測序（Sanger測序法）在家系主要成員及200名健康志愿者中進行驗證。

1.2.4 生物信息分析 突變通過檢索千人基因組數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫，均無人群頻率報道。

2 結(jié)果

2.1 基因突變分析

本研究對HCM家系先證者進行了30個HCM相關基因的外顯子編碼區(qū)及側(cè)翼區(qū)的篩查（圖2）。在HGVS標準基礎上與參考基因組NCBI Genome（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）比對，并綜合考慮人群頻率數(shù)據(jù)庫Exome Aggregation Consortium（http：//exac.broadinstitute.org/）/1000 Genomes Project和致病性數(shù)據(jù)庫ClinVar（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）/OMIM（http：//www.omim.org），由我們的遺傳咨詢團隊評估得出。該HCM家系中3例患者攜帶心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因（MYBPC3）c.G772A雜合突變，使258位的谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘）。該突變點為高度保守序列。MYBPC3基因6外顯子的剪切位點突變E258K可能是該HCM家系的致病突變。在200名健康對照中未發(fā)現(xiàn)該突變位點。

圖2 MBPC3基因的E258K突變測序結(jié)果

2.2 先證者臨床表現(xiàn)

先證者（Ⅱ-1）為75歲女性，確診為HCM，患者病史及輔助檢查：“高血壓”病史10余年，活動時胸悶、憋氣、心悸10年，加重半年，心臟彩超報告顯示室間隔基低段增厚，最厚處為16 mm，左室后壁9.6 mm，射血分數(shù)（EF）74%，左室流出道平均壓差35 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），診斷為肥厚性梗阻型心肌病。冠狀動脈CTA報告顯示左右冠狀動脈顯影良好，冠狀動脈起始處見點狀鈣化，但管腔未見明顯狹窄。動態(tài)心電圖示竇性心律，短陣室性心動過速、室性早搏、房性早搏。經(jīng)給予美托洛爾、纈沙坦等藥物，癥狀緩解。

2.3 家系臨床資料分析

先證者有一兒一女，經(jīng)檢測均攜帶該致病基因。女兒50歲，為HCM患者，高血壓4年，發(fā)作性心悸、胸痛7年，心臟超聲見室間隔增厚，基地段增厚明顯為18 mm，左室后壁8.9 mm，左室流出道平均壓差7 mmHg，冠脈造影見回旋支散在斑塊，遠端閉塞，右冠未見明顯狹窄。動態(tài)心電圖示室性早搏、陣發(fā)性心房顫動。兒子為攜帶者，心臟超聲檢查未見明顯異常，無胸悶、心悸、胸痛等臨床癥狀。其外孫未攜帶該致病基因，先證者的丈夫已故。該HCM家系6人中2人被診斷HCM，1人為基因突變攜帶者。家系成員中突變攜帶者的臨床資料見表1。endprint

3 討論

HCM是一種由基因突變導致的家族遺傳性疾病，帶突變的mRNA和蛋白質(zhì)表達在肥厚性心肌病患者的心肌中，表達出功能缺陷的蛋白質(zhì)組裝入肌小節(jié)被認為是HCM的主要發(fā)病機制。因為大多數(shù)起病緩慢，癥狀輕，往往表現(xiàn)為亞臨床癥狀而難以被識別，心源性猝死可能為第一臨床表現(xiàn)，突變的MBPC3基因是最常見的HCM原因之一，往往成年發(fā)病，而且有溫和的表型[8]。被MYBPC3編碼的蛋白由11個球狀域、8個與IgI同源和3個纖維蛋白Ⅲ組成[9]，僅在心肌中表達，其磷酸化可調(diào)節(jié)心肌收縮。MYBPC是肌節(jié)蛋白的成分，既有結(jié)構(gòu)作用，又有調(diào)節(jié)作用。通過結(jié)合肌球蛋白重鏈和肌細胞骨架蛋白，MYBPC3促成了肌節(jié)的結(jié)構(gòu)完整性，也可以調(diào)節(jié)心肌對腎上腺激素的收縮反應[10-14]。MYBPC3 E258K基因突變導致HCM的可能機制：①降低了cMYBP-C的C1C2區(qū)域和肌球蛋白的S2區(qū)域之間的相互作用強度。②cMYBP-C的磷酸化狀態(tài)及其消失，都通過相同的方式加速抽動的過程。③很有可能通過增強cMyBP-C和細肌絲之間的相互作用來降低抽動的強度[15]。

該家系HCM先證者攜帶的MYBPC3：p.E258K het變異，其在千人基因組數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫均無人群頻率報道，ExAC數(shù)據(jù)庫的人群頻率為0.000 039 03，為罕見變異。該變異曾被多個研究報道，被認為是HCM的致病變異[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶MYBPC3p.E258K het變異的患者其心肌組織中的肌球蛋白結(jié)合蛋白C含量下降了24%，由于單倍劑量不足而致病[19]。MYBPC3基因所致的HCM，其臨床表型的出現(xiàn)具有年齡相關性，傾向于晚發(fā)型（>40歲），可呈不完全外顯。該患者攜帶的MYBPC3：p.E258K het變異，從既往的家系研究來看，也表現(xiàn)為不完全外顯，部分患者為家系篩查時發(fā)現(xiàn)存在心肌肥厚，有些攜帶者則并無明顯心臟超聲異常[16-17]。因此，在進行家系的臨床篩查時，尤其是年輕攜帶者，建議制訂長期隨訪計劃。

家系中各成員病情進展程度不一致，心肌肥厚程度與臨床癥狀基本與年齡成正相關，但先證者兒子為突變基因的攜帶者，尚未發(fā)病，提示HCM臨床表型同時受致病基因和其他因素（如種族、生活方式、修飾基因的基因多態(tài)性等）的影響，反映該病的臨床異質(zhì)性。同時，經(jīng)冠脈造影或CTA檢查，該家系的2例HCM患者合并了冠脈病變：先證者為冠脈起始部的鈣化，其女兒為冠脈的回旋支鈣化并遠端的閉塞。HCM同時合并冠心病使病情復雜，給診斷及治療帶來困擾。

HCM的臨床表型是多變的，研究顯示MYBPC3基因突變的HCM疾病發(fā)作常推遲到中年甚至老年，疾病的外顯率也通常是隨著年齡而增加的，而且有相對較為良性的預后[15]。但延遲的心臟改變和溫和的臨床進程可能會阻礙其遺傳特性的識別，因此對家族其他成員的篩查能起到預警、早期識別作用，特別是對下一代測序更有助于破譯肥厚性心肌病的遺傳和表型的異質(zhì)性，應給予基因檢測，并進行長期的定時隨訪檢查[20]。

[參考文獻]

[1] Stroumpoulis KI，Pantazopoulos IN，Xanthos TT. Hypertrophic cardiomyopathy and sudden cardiac death [J]. World J Cardiol，2010，2（9）：289-298.

[2] Maron BJ，Haas TS，Ahluwalia A，et al. Demographics and Epidemiology of Sudden Deaths in Young Competitive Athletes：From the United States National Registry [J]. Am J Med，2016，129（11）：1170-1177.

[3] Sen-Chowdhry S，Jacoby D，Moon JC，et al. Update on hypertrophic cardiomyopathy and a guide to the guidelines [J]. Nat Rev Cardiol，2016，13（11）：651-675.

[4] Carrier L，Mearini G，Stathopoulou K，et al. Cardiac myosin-binding protein C（MYBPC3）in cardiac pathophysiology [J]. Gene，2015，573（2）：188-197.

[5] Mohamed IA，Krishnamoorthy NT，Nasrallah GK，et al. The Role of Cardiac Myosin Binding Protein C3 in Hypertrophic Cardiomyopathy- Progress and Novel Therapeutic Opportunities [J]. J Cell Physiol，2017，232（7）：1650-1659.

[6] Gersh BJ，Maron BJ，Bonow RO，et al. 2011 ACCF/AHA Guideline for the Diagnosis and Treatment of Hypertrophic Cardiomyopathy：a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines [J]. J Am Coll Cardiol，2011， 58（25）：e212-e260.

[7] Elliott PM，Anastasakis A，Borger MA，et al. 2014 ESC Guidelines on diagnosis and management of hypertrophic cardiomyopathy：the Task Force for the Diagnosis and Management of Hypertrophic Cardiomyopathy of the European Society of Cardiology（ESC）[J]. Eur Heart J，2014，35（39）：2733-2779.endprint

[8] Maron BJ，Casey SA，Hauser RG，et al. Clinical course of hypertrophic cardiomyopathy with survival to advanced age [J]. J Am Coll Cardiol，2003，42（5）：882-888.

[9] Flashman E，Redwood C，Moolman-Smook J，et al. Cardiac myosin binding protein C：its role in physiology and disease [J]. Circ Res，2004，94（10）：1279-1289.

[10] Yamamoto K，Moos C. The C-proteins of rabbit red，white，and cardiac muscles [J]. J BiolChem，1983，258（13）：8395-8401.

[11] Vaughan KT，Weber FE，Einheber S，et al. Molecular cloning of chicken myosin-binding protein（MyBP）H（85-kDa protein）reveals extensive homology with MyBP-C（C-protein）with conserved immunoglobulin C2 and fibronectin type Ⅲ motifs [J]. J BiolChem，1993，268（5）：3670-3676.

[12] Gilbert R，Kelly MG，Mikawa T，et al. The carboxyl terminus of myosin binding protein C（MyBP-C，C-protein）specifies incorporation into the A-band of striated muscle [J]. J Cell Sci，1996，109（Pt 1）：101-111.

[13] Weisberg A，Winegrad S. Alteration of myosin cross bridges by phosphorylation of myosin-binding protein C in cardiac muscle [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1996， 93（17）：8999-9003.

[14] Hartzell HC. Effects of phosphorylated and unphosphorylated C-protein on cardiac actomyosin ATPase [J]. J MolBiol，1985，186（1）：185-195.

[15] De Lange WJ，Grimes AC，Hegge LF. E258K HCM-causing mutation in cardiac MyBP-C reduces contractile force and accelerates twitch kinetics by disrupting the cMyBP-C and myosin S2 interaction [J]. J Gen Physiol，2013，142（3）：241-255.

[16] Niimura H，Bachinski LL，Sangwatanaroj S，et al. Mutations in the gene for cardiac myosin-binding protein C and late-onset familial hypertrophic cardiomyopathy [J]. N Engl J Med，1998，338（18）：1248-1257.

[17] Song L，Zou Y，Wang J，et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy [J]. Clin Chim Acta，2005，351（1/2）：209-216.

[18] Page SP，Kounas S，Syrris P，et al. Cardiac myosin binding protein-C mutations in families withhypertrophic cardiomyopathy：disease expression in relation to age，gender，and long term outcome [J]. Circ Cardiovasc Genet，2012，5（2）：156-166.

[19] Marston S，Copeland O，Jacques A，et al. Evidence from human myectomy samples that MYBPC3mutations cause hy？鄄pertrophic cardiomyopathy through haploinsufficiency [J]. Circ Res，2009，105（3）：219-222.

[20] Cecconi M，Parodi MI，F(xiàn)ormisano F，et al. Targeted next-generation sequencing helps to decipher the genetic and phenotypic heterogeneity of hypertrophic cardiomyopathy [J]. Int J Mol Med，2016，38（4）：1111-1124.

（收稿日期：2017-06-23 本文編輯：張瑜杰）endprint