宋寒冰++++++趙峰++++++葛圓圓2++++++楊丹++++++于英君

[摘要] 本文基于對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病因和治療機制的基礎(chǔ)研究的不斷探索，深入分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型所選動物以鼠、兔為主，其他動物如狗、豬、雞等應(yīng)用較少。常用造模方法主要有自發(fā)性模型、手術(shù)造模以及其他方法等，不同動物及不同方法有著較為嚴(yán)格的區(qū)別，因此在選擇模型時應(yīng)根據(jù)研究需要綜合考慮。

[關(guān)鍵詞] 膝關(guān)節(jié)；骨關(guān)節(jié)炎；動物模型

[中圖分類號] R684.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0046-04

Research status of establishment of animal model of knee osteoarthritis

SONG Hanbing1 ZHAO Feng2 GE Yuanyuan2 YANG Dan2 YU Yingjun3▲

1.The Third Department of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Graduate School， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.School of Basic Medicine， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China

[Abstract] Based on the continuous exploration on the fundamental researches of etiology and treatment mechanism of knee osteoarthritis， this paper takes in-depth analysis and finds that the animals used for establishing animal models with osteoarthritis at present are mainly rats and rabbits， the application of other animals， such as dogs， pigs， chickens and others， is less. The commonly model replicating methods are spontaneous models， operation models， and other methods， different animals and different methods have relatively strict distinction， so the choice of models should be based on the need of study.

[Key words] Knee joint； Osteoarthritis； Animal model

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是在骨科臨床中常見的一種以關(guān)節(jié)退行性改變?yōu)橹鞯募膊。欣夏耆巳憾喟l(fā)，主要癥狀為膝關(guān)節(jié)增生樣腫脹、關(guān)節(jié)內(nèi)翻畸形、屈伸活動受限，負(fù)重行走尤其上下樓梯時疼痛明顯加重，關(guān)節(jié)磨糙音、彈響，部分患者會出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔積液[1]。目前，對于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床和基礎(chǔ)研究越來越廣泛，但是膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的病因和治療機制的基礎(chǔ)研究尚不豐富，有待于進(jìn)一步的探索。在試驗過程中，能夠制造最為接近人的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的病因及轉(zhuǎn)歸的動物模型則尤其重要。

經(jīng)過造模方法的不斷深入研究，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的造模方法較多，利用兔和大鼠來造模的方式是最為常見的，動物模型一般有自發(fā)性模型、誘發(fā)性模型、手術(shù)方法造模等。為了能夠更順利地完成膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)動物實驗，在目前文獻(xiàn)研究報道的基礎(chǔ)上，本文總結(jié)了動物模型的常見建立方法，以利于研究者能夠更順利地運用膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動物模型來進(jìn)行實驗研究。

1 鼠類模型的制作

1.1 喂養(yǎng)造模

Silberberg等[2]給以含高脂肪、高動物油脂的飼料喂養(yǎng)C57BL小鼠，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)率較高，脂肪酸Omega-3代替必需脂肪酸Omega-6可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨纖維的退行性改變。

1.2 自發(fā)性模型

許多動物可以因自身關(guān)節(jié)軟骨退變形成骨關(guān)節(jié)炎，這種骨關(guān)節(jié)炎甚至不需任何干預(yù)。由Silberberg等[3]經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)C57黑鼠和STRPort小鼠具有可以自我發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎的特征，主要累及脛內(nèi)側(cè)軟骨，雄性STRPort小鼠病變較重，發(fā)生率較高[4]。激素水平影響可以產(chǎn)生自發(fā)性模型，研究發(fā)現(xiàn)性激素可以干預(yù)雌性STRPort小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1與白介素-4表達(dá)，此效應(yīng)可以保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，降低關(guān)節(jié)軟骨炎的發(fā)生率[5]。另外，Yamamoto等[6]通過對栗鼠行走方式進(jìn)行干預(yù)，使其以特殊的步態(tài)行走，發(fā)現(xiàn)當(dāng)栗鼠以這種步態(tài)行走一段時間后，栗鼠踝關(guān)節(jié)軟骨的邊緣會出現(xiàn)不同程度的增生、關(guān)節(jié)面龜裂等形態(tài)變化，光鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，栗鼠關(guān)節(jié)產(chǎn)生類似于人類骨關(guān)節(jié)炎病理變化的改變，如軟骨細(xì)胞數(shù)目減少、排列紊亂等。這些改變可以進(jìn)行類似骨關(guān)節(jié)病遺傳學(xué)及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退行性改變方面的研究[7]。

1.3 基因技術(shù)模型

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷創(chuàng)新，骨關(guān)節(jié)炎動物模型可以通過基因技術(shù)來實現(xiàn)，目前主要是Col9a1和Col2a1基因部分縮短、缺失或者基因的突變、銅轉(zhuǎn)運基因缺陷、Col11a1基因的1-bp處缺失、MMP-13基因的過度表達(dá)以及組織特異性BMP-1a型受體缺乏等，以及下列基因的敲除，這些基因包括ADAM-15基因、MMP-14基因、白介素-6基因、Mig-6基因、a-1整合素基因、纖維調(diào)節(jié)素和基膜聚糖基因雙鏈、纖維調(diào)節(jié)素和二聚糖基因單鏈或者雙鏈等。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡的基因被剔除，軟骨細(xì)胞退變，破壞速度會加速[8]。Arita等[9]發(fā)現(xiàn)并制造轉(zhuǎn)基因小鼠模型，表達(dá)人突變Ⅱ型前膠原基因，電鏡下發(fā)現(xiàn)相比于正常組，軟骨示Ⅱ型膠原纖維的密度減少，此等變化與因該基因突變而造成的全身骨關(guān)節(jié)炎患者相似。endprint

雖然轉(zhuǎn)基因小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型對于研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的特殊基因或蛋白質(zhì)的作用十分重要，然而骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制是基因的異常，并不能反映臨床上因勞累、環(huán)境因素等造成的關(guān)節(jié)炎，另外，進(jìn)行基因改造后的實驗動物是否具有其他可引起關(guān)節(jié)改變的病理變化尚不明確，因此轉(zhuǎn)基因能否作為評價骨關(guān)節(jié)炎治療方法的普通模型還存在爭議。

1.4 關(guān)節(jié)固定

如果將大鼠關(guān)節(jié)較長時間固定，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。如果固定于關(guān)節(jié)伸直位時施加壓力可以加大關(guān)節(jié)面壓力和磨損，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)炎發(fā)生的進(jìn)程。另有學(xué)者通過采用過屈位和過伸位將模型進(jìn)行固定，發(fā)現(xiàn)兩者均能得到滿意的動物模型，但過屈位造模方法優(yōu)于過伸位所造的模型[10]。

1.5 關(guān)節(jié)注射

盧鋒等[11]將白陶土的生理鹽水懸浮液和弗式佐劑注射液分別注射于大鼠后肢踝趾關(guān)節(jié)，用來觀察鹽酸氨基葡萄糖抑制骨關(guān)節(jié)炎的病變程度，結(jié)果顯示鹽酸氨基葡萄糖對骨性關(guān)節(jié)炎存在保護(hù)作用，具有輔助性療效。Hagmann等[12]對雄性Wistar大鼠的膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸鈉，建立膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，該方法比較簡便。

1.6 Hulth法造模

在動物實驗中，早期曾有關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)方法，但關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)方法容易導(dǎo)致創(chuàng)傷性滑膜炎對實驗的干擾，因此目前較為常用的手術(shù)方法為Hulth法，采用Hulth法制作鼠類動物模型，首先將膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)副韌帶離斷，然后把內(nèi)側(cè)半月板和前后交叉韌帶依次切除，飼養(yǎng)8周后即可成功制作出所需要的動物模型。例如有學(xué)者報道，將4～5個月齡大鼠以上述方法制得模型[13]。有學(xué)者[14]選擇豚鼠作為實驗動物進(jìn)行研究，方法主要是切斷豚鼠的臀大肌和深面臀小肌、臀中肌，來對髖關(guān)節(jié)的平衡維持能力、穩(wěn)定能力以及負(fù)重能力進(jìn)行干預(yù)性破壞。12周之后，研究人員發(fā)現(xiàn)其膝關(guān)節(jié)的軟骨面出現(xiàn)水平裂隙及軟骨剝脫等早期骨關(guān)節(jié)炎的典型表現(xiàn)，軟骨細(xì)胞形成灶巢樣增生、雙柱狀病理改變，可以見到新骨的形成。豚鼠關(guān)節(jié)軟骨表面在24周之后，可以觀察到破潰更加嚴(yán)重，呈絨毛樣外觀，裂隙加深，軟骨下骨常常呈象牙狀裸露。這種造模通常不會造成創(chuàng)傷性滑膜炎，因此可以作為骨關(guān)節(jié)炎早期病理變化的較好模型。

1.7 誘發(fā)性模型

寒冷刺激誘發(fā)模型、藥物誘發(fā)模型是誘發(fā)性模型的兩種主要類型，其中藥物誘發(fā)模型主要的造模方式是藥物的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，常用的藥物主要有雌激素、蛋白水解酶、腎上腺皮質(zhì)激素、尿激酶、腫瘤壞死因子、白介素等，由于這些藥物影響了膝關(guān)節(jié)軟骨的代謝，直接對關(guān)節(jié)軟骨造成了破壞，因而誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎。

寒冷刺激可以誘發(fā)關(guān)節(jié)液成分的改變，進(jìn)一步改變滑膜通透性，對關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)環(huán)境造成破壞，可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。此外，寒冷刺激可以造成關(guān)節(jié)軟骨的直接損傷，研究發(fā)現(xiàn)，局部凍瘡6個月后可發(fā)現(xiàn)誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨微小的損傷，12個月后可以觀察到關(guān)節(jié)更加顯著的損傷[15]，因此可以說明，關(guān)節(jié)損傷后常在受傷的數(shù)月后或數(shù)年后發(fā)生關(guān)節(jié)疼痛，尤其是在冬季容易加重。林木南等[16]在研究中指出，寒冷刺激可以使細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞顯著簇集，可見細(xì)胞核縮、核溶、甚至細(xì)胞消失等現(xiàn)象，基質(zhì)染色不均、淡染，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)明顯疏松，膠原纖維顯著減少，新生毛細(xì)血管出現(xiàn)在軟骨中，軟骨退化現(xiàn)象十分顯著。

關(guān)節(jié)軟骨及其附近的內(nèi)環(huán)境十分脆弱，即使只是每日多次注射10%鹽水，就算是生理鹽水也可以誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎。因而得知，關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的改變影響了關(guān)節(jié)軟骨代謝，兩者關(guān)系十分密切，這種微創(chuàng)非特異性造模方法也可以作為較理想的造模方法用于研究藥物對膝關(guān)節(jié)病的治療。

1.8 其他方法造模

劉安軍等[17]根據(jù)長期低溫環(huán)境可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的理論，采用冷水（溫度約為4℃）對小鼠冷凍刺激方式進(jìn)行膝關(guān)節(jié)造模。在造模后的第30天，觀察小鼠的膝關(guān)節(jié)的狀態(tài)并對其腫脹程度評分，提取膝關(guān)節(jié)軟骨組織作標(biāo)本，檢測其血清中透明質(zhì)酸水平以及腫瘤壞死因子含量。第30天時發(fā)現(xiàn)模型組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）遠(yuǎn)高于正常組，最高可達(dá)3.8，對模型小鼠進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，可見小鼠典型的骨關(guān)節(jié)炎病變，模型組血清中透明質(zhì)酸、腫瘤壞死因子-α的含量顯著升高，出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎典型的病理改變，而且其血清中腫瘤壞死因子和透明質(zhì)酸的含量都可見明顯升高，說明冷水刺激可導(dǎo)致小鼠骨關(guān)節(jié)炎，這種造模方法可作為具有地域特異性的骨關(guān)節(jié)炎模型。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小鼠在行卵巢切除術(shù)后會出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)軟骨退變，而且代表軟骨變化的CTX2Ⅱ和代表骨吸收的CTX2Ⅰ顯著升高[18]。這表明，關(guān)節(jié)變化與CTX2Ⅱ和CTX2Ⅰ的水平呈明顯相關(guān)性，這說明了卵巢分泌的一類激素可以對關(guān)節(jié)軟骨起到一定的保護(hù)作用，并且得出卵巢切除術(shù)可用于激素水平及年齡相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎動物模型。

2 兔模型的制作

2.1 Hulth法造模

兔模型也多以Hulth法為主，兔Hulth法[19]為兔經(jīng)典手術(shù)干預(yù)造模方法，其方法大致為：以耳緣靜脈麻醉法麻醉實驗兔，實驗組是將兔的膝關(guān)節(jié)皮下組織切開，將內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶切斷，把內(nèi)側(cè)半月板一同完整切除，術(shù)后常規(guī)處理，固定但不制動傷肢，1周后每天驅(qū)趕兔子行走2次，共30 min，連續(xù)4周。當(dāng)實驗兔因手術(shù)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)正常力線破壞時，關(guān)節(jié)負(fù)重面減少，局部受力更加集中，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨磨損程度增加，加重了其退行性變的速度，促使關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變。3個月后對實驗兔受損關(guān)節(jié)的觀察顯示，軟骨出現(xiàn)裂隙、破壞[20]。

對實驗兔采用Hulth造模法進(jìn)行實驗時，骨關(guān)節(jié)常常會出現(xiàn)類似骨關(guān)節(jié)炎中晚期的改變，病變較重，因此學(xué)者往往對其進(jìn)行改良，例如李炳輝等[21]應(yīng)用改良Hulth法進(jìn)行實驗造模，其主要步驟為將實驗兔下肢內(nèi)側(cè)副韌帶、內(nèi)側(cè)半月板以及前交叉韌帶切斷，在Hulth法操作中保留后交叉韌帶，自術(shù)后1周每天驅(qū)趕實驗兔行走30 min，并持續(xù)16周。16周后可同樣發(fā)現(xiàn)實驗兔的膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙不同程度的變窄，關(guān)節(jié)面明顯不平，邊緣骨贅形成，細(xì)胞檢測可見軟骨胞膜破損，細(xì)胞核固縮。相對于傳統(tǒng)Hulth法，改良后創(chuàng)傷較小，操作簡單，一定程度上維持了膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，更有利于造模成功。endprint

2.2 其他造模方法

除了Hulth法之外，李釗等[22]使用小針刀在20只實驗大兔脛骨平臺、雙側(cè)股骨髁軟骨表面上刻痕，每一側(cè)刻痕均為4～5道，刻痕不超過軟骨層，不能損傷半月板，術(shù)后第2天開始每天驅(qū)趕動物活動半小時。由于小針刀閉合刻痕對關(guān)節(jié)滑膜影響小，故該方法不會出現(xiàn)滑膜炎等。該方法5周后發(fā)現(xiàn)造模組關(guān)節(jié)軟骨具有典型的骨關(guān)節(jié)炎病理改變。

Okazaki等[23]通過將實驗兔下肢關(guān)節(jié)伸直位制動持續(xù)14 d后，兔關(guān)節(jié)的軟骨可以見到早期退變改變，制動28 d后可見到關(guān)節(jié)軟骨退變程度達(dá)中度，42 d后則可達(dá)重度退變，同時發(fā)現(xiàn)p53 mRNA參與該過程的發(fā)生。一份實驗[24]以成年新西蘭大白兔為實驗動物，將其左后肢膝關(guān)節(jié)固定于伸直位，造模6周后對比其左右后肢關(guān)節(jié)軟骨及滑膜發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在制動后1周即開始發(fā)生凋亡，6周時無論從微觀或宏觀角度，實驗兔手術(shù)關(guān)節(jié)均符合呈典型的骨關(guān)節(jié)炎病理改變特征。

3 其他動物模型的制作

相比于上述實驗動物，因?qū)嶒瀯游飩惱硪?，其他模型在實踐中應(yīng)用相對較少，僅僅在某些特殊方法時才考慮應(yīng)用。有學(xué)者嘗試以關(guān)節(jié)鏡切除豬雙膝外側(cè)部分半月板，術(shù)后12周時大體觀察結(jié)果表現(xiàn)為局限性軟骨表面纖維化，伴股骨髁間切跡骨贅形成；組織學(xué)檢測表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞數(shù)量和蛋白多糖含量減少、成簇排列細(xì)胞數(shù)量增加，說明已產(chǎn)生退行性變；核磁檢查表現(xiàn)為軟骨厚度變薄、軟骨信號強度改變[25]。因此以關(guān)節(jié)鏡行半月板部分切除能有效建立豬雙膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動物模型，但因關(guān)節(jié)鏡設(shè)備限制，關(guān)節(jié)鏡造模僅在大型動物中可以應(yīng)用。

易彩霞[26]嘗試以豬為實驗對象進(jìn)行造模，其方法為取外側(cè)入路進(jìn)入豬左膝關(guān)節(jié)腔，將其前交叉韌帶切斷后并完全將外側(cè)半月板切除。右側(cè)膝關(guān)節(jié)不予處理作為空白對照側(cè)。以手術(shù)方式建立以豬為實驗對象的活體骨關(guān)節(jié)炎動物模型，觀察關(guān)節(jié)軟骨退變的不同階段和T1ρ和T2mapping成像變化。然后分析膠原含量（軟骨番紅O染色和Van Gieson染色后所測OD值）、T2值、T1ρ值蛋白多糖（PG）含量，并分析它們之間的相關(guān)關(guān)系。此方法由于幾乎完全不同于以前的任何研究方法，與臨床的實際情況更加接近，其結(jié)論為：退變的軟骨T2值、T1ρ值的改變與退變軟骨中蛋白多糖含量和膠原含量的改變相關(guān)。在檢測蛋白多糖含量時，與T2mapping比較，T1ρ成像更為敏感；而在檢測膠原含量的過程中，T2mapping更敏感。

因?qū)嶒炌藐P(guān)節(jié)內(nèi)劃痕可造成滑膜損傷，因此為了避免這一點，Marijnissen等[27]提出一種新的關(guān)節(jié)刻痕造模方法，以狗為實驗動物，在不損傷軟骨下骨的前提下，在狗的膝關(guān)節(jié)軟骨上用圓絞刀人為造成軟骨劃痕，術(shù)后將對側(cè)肢體限制活動，并以術(shù)肢負(fù)重活動，每周3 d，每天4 h，持續(xù)20周。造模后發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨局部可出現(xiàn)明顯變性的軟骨細(xì)胞、基質(zhì)中異染物質(zhì)消失等類似人類臨床中膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的病理改變，且關(guān)節(jié)炎癥相對輕微，因此這種方法可作為一個觀察骨關(guān)節(jié)炎早期表現(xiàn)及治療效果的理想模型。另外，劉媛等[28]以雞為實驗動物，對其膝關(guān)節(jié)進(jìn)行冰水浴，每天冰浴2 h，共進(jìn)行30 d，然后利用電鏡掃描進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)軟骨表面出現(xiàn)波浪狀低平的病理性結(jié)構(gòu)，拱形結(jié)構(gòu)明顯消失，表面部分出現(xiàn)斷裂，出現(xiàn)軟骨細(xì)胞及膠原纖維裸露等退行性改變。

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（收稿日期：2017-06-21 本文編輯：張瑜杰）endprint