李軍明++++++楊麗萍++++++王臣玉++++++趙琪++++++鄭清++++++孫成銘

[摘要] 目的 探討不同濃度的葡萄糖對Pichia pastoris組成型表達重組人C-反應(yīng)蛋白（rhCRP）的影響并篩選出最優(yōu)葡萄糖碳源。 方法 分別以濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（w/v）的葡萄糖作為碳源，利用畢赤酵母菌株組成型表達rhCRP。取不同表達時間的培養(yǎng)基上清進行Western blot檢測及灰度比較分析。 結(jié)果 畢赤酵母菌株X-33（pGAPZαA/rhCRP）以葡萄糖作碳源組成型表達rhCRP時，1.0%（w/v）的葡萄糖為最優(yōu)碳源。 結(jié)論 葡萄糖碳源的濃度可影響Pichia pastoris組成型表達rhCRP的水平。本研究結(jié)果將為rhCRP的進一步優(yōu)化表達及大規(guī)模生產(chǎn)提供有力的實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] C-反應(yīng)蛋白；葡萄糖；碳源；組成型表達；Pichia pastoris

[中圖分類號] Q819 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0018-04

Influence of glucose carbon source on the constitutive expression of recombinant human C-reactive protein

LI Junming YANG Liping WANG Chenyu ZHAO Qi ZHENG Qing SUN Chengming▲

Department of Clinical Laboratory， Yantai Yuhuangding Hospital， Shandong Province， Yantai 264000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of different concentrations of glucose on the constitutive expression of recombinant human C-reactive protein （rhCRP） in Pichia pastoris， and to screen out the optimum concentration of the glucose carbon source. Methods The different concentrations [0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， 2.5%， 3.0% and 3.5% （w/v）] of glucose were used to constitutively express rhCRP in Pichia pastoris. Samples were taken from individual tubes of the cultures at the desired time points and the expression of rhCRP in the culture supernatant was analyzed by Western blot and gray scale. Results When rhCRP was constitutively expressed in Pichia pastoris X-33 using glucose as carbon source， 1.0% glucose （w/v） was selected as the best carbon source. Conclusion The concentration of glucose carbon source plays an important role in the constitutive expression of rhCRP in Pichia pastoris. The results of this study will provide a strong experimental basis for further optimized expression and large-scale production of rhCRP.

[Key words] C-reactive protein； Glucose； Carbon source； Constitutive expression； Pichia pastoris

C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）是一種系統(tǒng)發(fā)育上十分古老、結(jié)構(gòu)上高度保守的典型的急性時相反應(yīng)蛋白[1]。人們對它的研究已有80余年的歷史，發(fā)現(xiàn)其生物作用似乎相當復雜，它不僅是靈敏的炎癥指標[2-4]，而且是心血管疾病最強有力的風險預測因子[5-8]。從患者血清或腹水中直接分離純化得到人CRP是困難的[9]，目前主要通過外源表達系統(tǒng)獲來得重組人CRP（recombinant human C-reactive protein，rhCRP）[10-13]。然而，提高rhCRP的表達水平仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。碳源是影響Pichia pastoris組成型表達外源蛋白的重要因素之一[14]。本文著重研究了不同濃度的葡萄糖對工程菌株組成型表達rhCRP的影響，旨在篩選出最優(yōu)濃度葡萄糖碳源，以優(yōu)化CRP的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株與主要試劑 畢赤酵母X-33、Zeocin抗生素、質(zhì)粒提取及DNA凝膠回收試劑盒購自Invitrogen公司，限制性核酸內(nèi)切酶、E.coli JM109購自TaKaRa公司，表達載體pGAPZαA/rhCRP為前期構(gòu)建凍存樣本。葡萄糖、PVDF膜、抗His-Tag-HRP單克隆抗體及膜型TMB顯色液為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。endprint

1.1.2 主要培養(yǎng)基 LB、LS-LB、YPD、YPDS培養(yǎng)基，均參照Invitrogen公司提供的配方；BMY培養(yǎng)基[1%胰蛋白胨、2%酵母提取物、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、1.34%酵母氮堿、4×10-5%生物素]。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP的準備與提取 前期已根據(jù)GenBank（X56214.1）數(shù)據(jù)庫中公布的編碼人CRP的基因序列及組成型載體pGAPZαA上酶切位點的特性設(shè)計并成功克隆出重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP[15]。通過熱擊法將經(jīng)測序鑒定的重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)細胞JM109，然后涂布于含Zeocin 25 μg/mL的LS-LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)。取陽性單克隆菌落進行接種，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP，用XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切進行鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化與表達鑒定 將經(jīng)Bsp HI線性化的重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP用電擊法轉(zhuǎn)化到酵母菌X-33中，并涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板上，于30℃培養(yǎng)2～3 d后取單克隆菌落于純化平板上進行再次篩選。挑選大而圓的單克隆，接種到5 mL YPD液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)30 h后取樣。將樣品10 000 r/min離心5 min后取適量上清進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，以HRP標記的抗組氨酸抗體為抗體，并用膜型TMB顯色液進行顯色后分析Western blot結(jié)果。

1.2.3 利用不同濃度葡萄糖碳源進行rhCRP的優(yōu)化表達 將陽性單克隆菌株接種至裝有80 mL YPD培養(yǎng)基的2 L搖瓶中，30℃振蕩過夜培養(yǎng)后，將其分別分裝到7個容積為50 mL的離心管中，每管10 mL。于1500 r/min常溫離心5 min，輕棄上清后向7個管中依次加入葡萄糖濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（w/v）的BMY新鮮液體培養(yǎng)基各10 mL。輕搖重懸菌體后至于30℃搖床中220 r/min振蕩培養(yǎng)6 d。在16、24、48、72、96、120、144 h時從上述7管中依次取樣，并每24小時向7個濃度梯度的培養(yǎng)管中分別補充葡萄糖碳源至設(shè)定濃度。將樣品于10 000 r/min離心5 min后保留上清以進行Western blot分析，并用Quantity One軟件進行灰度比較及綜合分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP的酶切鑒定

用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切提取的4管重組質(zhì)粒pGAPZαA/rhCRP，電泳后可見約為681 bp的目的條帶和3491 bp的pGAPZαA載體條帶（圖1），片段大小位置與預期相符。酶切鑒定與預期結(jié)果一致。

2.2 酵母轉(zhuǎn)化后的初步表達鑒定

Western blot鑒定結(jié)果顯示，挑選的陽性單克隆菌株表達出了大小約23 kD的目的條帶（圖2），符合預期結(jié)果。

2.3 不同濃度葡萄糖碳源對Pichia pastoris組成型表達rhCRP的影響

如圖3a、3b所示，24 h和48 h的樣本W(wǎng)estern blot檢測結(jié)果顯示，最佳葡萄糖碳源濃度為1.0%（w/v）；如圖3c、3d所示，96 h和120 h的檢測結(jié)果顯示，最佳葡萄糖碳源濃度為0.5%（w/v）。

對0.5%和1.0%（w/v）濃度的葡萄糖作碳源時rhCRP在7個不同時間的表達情況進行了進一步分析，結(jié)果表明，最佳葡萄糖碳源濃度為1.0%（w/v）。

1～7：濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（w/v）的葡萄糖作碳源時，Pichia pastoris X-33/pGAPZαA/rhCRP表達24 h（a）、48 h（b）、96 h（c）和120 h（d）時的培養(yǎng)基上清液經(jīng)Western blot檢測結(jié)果

M：蛋白Marker；D、G：分別表示濃度為0.5%、1.0%（w/v）的葡萄糖作碳源時，Pichia pastoris X-33/pGAPZαA/rhCRP表達16、24、48、72、96、120、144 h時的培養(yǎng)基上清液經(jīng)Western blot檢測鑒定（a）及灰度比較分析（b）結(jié)果

3 討論

目前，人們已利用多種外源表達系統(tǒng)成功表達了rhCRP[10-13]，但將其應(yīng)用到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時，都存在一定的弊端。提高rhCRP產(chǎn)量仍然是一個亟需解決的難題。Pichia pastoris的組成型表達系統(tǒng)是具有強啟動子的非常優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，已成功用于多種重組蛋白的生產(chǎn)[16]。該系統(tǒng)可以利用信號肽分泌表達目的蛋白，可大大簡化后期的蛋白純化工藝[17-18]。更重要的是，該組成型表達系統(tǒng)不僅可以避免使用有毒、易燃、儲存及運輸成本高的甲醇，而且可以利用葡萄糖等多種經(jīng)濟安全物質(zhì)作為碳源，將更利于其在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

大量研究發(fā)現(xiàn)，碳源的種類與濃度是影響畢赤酵母組成型表達外源蛋白產(chǎn)量的重要因素之一[19-20]。除了實驗沒有更好的辦法可以確定利于目的蛋白表達的最優(yōu)碳源[21]。本研究選取了經(jīng)濟的葡萄糖作為碳源，研究不同濃度的葡萄糖碳源對rhCRP表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h和48 h時1.0%（w/v）的葡萄糖為最佳濃度，然而有意思的是96 h和120 h的檢測結(jié)果顯示最佳葡萄糖碳源濃度為0.5%（w/v）。于是，本研究對葡萄糖碳源濃度分別為0.5%和1.0%（w/v）時，rhCRP在不同時間（16、24、48、72、96、120、144 h）的表達情況進行了進一步分析，結(jié)果顯示，以0.5%（w/v）葡萄糖作為碳源時，72 h時rhCRP的表達量接近最大值，之后隨著時間的延長表達量變化不明顯；而以1.0%（w/v）葡萄糖作為碳源時，48 h時rhCRP的表達量已接近最大值，之后隨著時間的延長表達量變化不明顯。顯然，短的培養(yǎng)時間不僅可以提高生產(chǎn)效率，而且可以減少了雜蛋白的產(chǎn)生，利于后期蛋白純化操作。所以，葡萄糖碳源的最佳濃度為1.0%（w/v）。本研究結(jié)果將為rhCRP的進一步優(yōu)化表達及大規(guī)模生產(chǎn)提供有力的實驗依據(jù)。endprint

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（收稿日期：2017-07-16 本文編輯：程 銘）endprint