張雅為，高 鋒，劉耀川，朱江巍，魏 澍，王 軍，趙 培，趙曉彤，顧貴波

(1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110164；2.遼寧農業(yè)職業(yè)技術學院，遼寧營口 115009；3.遼寧省重大動物疫病應急中心，遼寧沈陽 110161)

阜新某雞場大腸埃希菌四環(huán)素類藥物敏感性試驗及耐藥基因檢測

張雅為1，高 鋒2，劉耀川3，朱江巍3，魏 澍1，王 軍1，趙 培1，趙曉彤1，顧貴波1

(1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110164；2.遼寧農業(yè)職業(yè)技術學院，遼寧營口 115009；3.遼寧省重大動物疫病應急中心，遼寧沈陽 110161)

大腸埃希菌能夠引起雞大腸桿菌病，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。檢測阜新某雞場分離的33株雞源大腸埃希菌對6種臨床常用的四環(huán)素類藥物的敏感性，并對四環(huán)素耐藥基因進行檢測。結果表明，大腸埃希菌分離株對土霉素和脫氧土霉素高度耐藥；對四環(huán)素和多西環(huán)素中度耐藥；對金霉素和強力霉素敏感。在33株大腸埃希菌分離株中檢測出tetB、tetC、tetM、tetK、tetL 5種四環(huán)素耐藥基因，未檢出tetA基因，tetK檢出率最高。

雞大腸埃希菌；四環(huán)素類；耐藥；基因

大腸埃希菌為雞大腸桿菌病的主要致病菌，該菌在飼料、飲水及飼養(yǎng)環(huán)境中廣泛分布，極易造成集約化養(yǎng)雞場中雞大腸桿菌病大規(guī)模暴發(fā)。病雞主要以大腸埃希菌敗血癥為主[1-2]，其他癥狀包括肉芽腫、輸卵管炎癥、腹膜炎等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失[3-4]。四環(huán)素類藥物作為臨床常用的廣譜抗生素，常用于治療大腸埃希菌引起的多種疾病。該類藥物主要通過抑制細菌具體蛋白合成而發(fā)揮抑菌作用。但隨著該類藥物的長期使用，多種細菌包括大腸埃希菌已對其產生不同程度的耐藥性。目前已發(fā)現多種四環(huán)素類藥物的耐藥基因，大致可分為三類，即外排泵類耐藥基因、核糖體保護基因及滅活酶基因。病原菌在耐藥基因的介導下可對一種或多種四環(huán)素類藥物產生不同程度的耐受，給疾病治療及預防帶來困難[5-8]。

本試驗對阜新某雞場分離的大腸埃希菌分離株進行四環(huán)素類藥物敏感性試驗，分析該場大腸埃希菌對四環(huán)素類藥物的耐藥情況。并根據藥敏試驗結果，設計四環(huán)素類藥物耐藥基因特異性引物，篩查大腸埃希菌分離株對四環(huán)素類藥物產生耐藥性的分子機制，為該場雞大腸桿菌病治療及耐藥性機理篩查奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 33株大腸埃希菌分離株于阜新某雞場病死雞的肝臟中分離，大腸埃希菌分離株經麥康凱鑒別培養(yǎng)基及腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管鑒定，于遼寧省動物疫病預防控制中心保存。大腸埃希菌標準株ATCC25922，遼寧省動物疫病預防控制中心提供。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯(NB)、MH(B)培養(yǎng)基、酵母提取物、麥康凱瓊脂、MH(A)瓊脂，北京奧博星生物技術有限公司產品；GoldenView染色液，天根生化科技(北京)有限公司產品；DNA標準DL 2 000、DNA標準DL 5 000、瓊脂糖，寶生物工程(大連)有限公司產品；2×TaqPCR Master Mix、ddH2O，北京全式金生物技術有限公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒，博邁德生物科技有限公司產品。

1.1.3 藥物標準品 四環(huán)素(純度86.4%)、土霉素(純度93.3%)、多西環(huán)素(純度76.3%)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產品；金霉素(純度73.3%)、強力霉素(純度82.3%)、脫氧土霉素(純度86.6%)，北京中海生物科技有限公司產品。

1.1.4 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式不銹鋼高壓蒸汽滅菌消毒器、無菌潔凈工作臺、微量可調節(jié)加樣器(Eppendorf)、電動移液器(Thermo)、梯度PCR擴增儀(T100 Thermal Cycler BIO-RAD)、數碼凝膠成像與分析系統(tǒng)(Gel Dox XR+ Bio-Rad)等，遼寧省動物疫病預防控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)測定 根據美國臨床實驗室標準委員會(Clinical Laboratory Standards Institute， CLSI)2013版推薦的方法，采用微量肉湯稀釋法測定6種四環(huán)素類藥物對33株大腸埃希菌分離株的最小抑菌濃度。

1.2.1.1 凍存菌的活化 將保存于-20 ℃的33株雞大腸埃希菌分離株甘油菌，以劃線培養(yǎng)的方式接種于無菌的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，并于37℃倒置過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，挑取培養(yǎng)基中的典型的有紅色金屬光澤的圓形菌落，接種于無菌的NB肉湯培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD 600 nm=0.6～0.8之間后可用于試驗。

1.2.1.2 四環(huán)素類藥物的配制 根據CLSI推薦方法及藥物標準品的有效成分含量，用相應的溶劑對藥物進行配置。將藥物配制成終濃度為1 280 μg/mL的原藥液，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 MIC測定 測定藥物MIC時，將培養(yǎng)的菌液用M-H肉湯進行1 000倍稀釋，將菌液稀釋成濃度為1×105CFU/mL的工作菌液。同時采用倍比稀釋法將抗菌藥物進行稀釋，使藥液的濃度范圍在0.25 μg/mL～128 μg/mL之間。將100 μL菌液及100 μL藥液加入96孔U型底細胞培養(yǎng)板中，37℃過夜培養(yǎng)。以能夠抑制細菌生長的最小濃度為該藥物的MIC，每個分離株重復3個平行，以大腸埃希菌標準株ATCC25922為質控菌。

1.2.2 四環(huán)素類耐藥基因篩查

1.2.2.1 大腸埃希菌分離株基因組DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟，對大腸埃希菌分離株基因組DNA進行提取。大腸埃希菌分離株活化、培養(yǎng)方法參考步驟1.2.1.1。提取的基因組DNA經15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.2.2.2 四環(huán)素類耐藥基因引物合成 根據NCBI中GenBank已公布的四環(huán)素耐藥基因序列，使用Primer軟件設計特異性引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。具體的基因名稱、引物序列等信息見表1。

1.2.2.3 耐藥基因PCR擴增 耐藥基因PCR反應體系見表2。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s，47 ℃～56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；最終72℃ 7 min后于4℃保存。PCR擴增反應結束后，取5 μL PCR擴增產物，用15 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表1 四環(huán)素耐藥基因引物序列Table 1 The primer sequences of tetracycline resistance genes

表2 四環(huán)素耐藥基因PCR反應體系Table 2 PCR reaction system of tetracycline resistance genes

2 結果

2.1 大腸埃希菌分離株藥物敏感性試驗

33株雞大腸埃希菌分離株對受試的6種四環(huán)素類藥物的敏感性試驗結果見表3。

由表3可知，33株雞大腸埃希菌分離株對受試的6種四環(huán)素類藥物已產生不同程度的耐藥性，其中對土霉素及脫氧土霉素耐藥率最高，分別為90.9%及84.8%；對四環(huán)素和多西環(huán)素耐藥率相對較高，分別為63.6%和30.3%；對金霉素和強力霉素較為敏感，耐藥率分別為18.2%和12.1%。

2.2 大腸埃希菌分離株基因組DNA提取結果

使用細菌基因組DNA提取試劑盒，提取33株雞大腸埃希菌分離株的基因組DNA，提取的基因組DNA經15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，部分提取結果見圖1。

2.3 四環(huán)素耐藥基因篩查結果

以大腸埃希菌分離株基因組DNA為模板，6種四環(huán)素類耐藥基因引物對分離株耐藥基因攜帶情況進行篩查，檢測出攜帶tetB、tetC、tetL、tetK、tetM基因，未檢出tetA基因(圖2)。

表3 大腸埃希菌分離株藥物敏感性試驗結果Table 3 Drug sensitivity test results of E.coli isolates

M.DNA標準DL 5 000;1～8.部分大腸埃希菌分離株基因組DNAM.DNA Marker DL 5 000;1-8.Genomic DNA of E.coli isolates圖1 部分大腸埃希菌基因組DNA電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of genomic DNA of E.coli isolates

四環(huán)素類耐藥基因篩查結果表明，在33株大腸埃希菌分離株中，共檢出6株tetB陽性菌株、5株tetC陽性菌株、5株tetM陽性菌株、11株tetK陽性菌株、9株tetL陽性菌株，未檢出tetA陽性株。tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL的檢出率分別為0(0/36)、16.7%(6/36)、13.9%(5/36)、13.9%(5/36)、30.6%(11/36)、25%(9/36)。tetK為該場雞大腸埃希菌主要四環(huán)素耐藥基因。

33株大腸埃希菌分離株中最多攜帶3種篩查的耐藥基因，攜帶0～3種耐藥基因的菌株分別占21.2%(7/33)、54.5%(18/33)、18.2%(6/33)、6.1%(2/33)，攜帶1種耐藥基因的菌株占比最多，其次為未攜帶耐藥基因的菌株，同時攜帶3種耐藥基因的分離株占比最少。

3 討論

雞大腸桿菌病給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失。四環(huán)素類藥物作為其治療藥物之一，已廣泛使用于臨床疾病治療。由于藥物的長期使用，多種病原菌在選擇壓力的作用下已對其逐漸產生耐藥性，給疾病治療及預防帶來困難。本試驗結果表明，受試場雞大腸埃希菌分離株對臨床常用的四環(huán)素類抗菌藥物已產生不同程度的耐藥性。其中對土霉素及脫氧土霉素高度耐藥，對四環(huán)素及多西環(huán)素耐藥率相對較高，對金霉素和強力霉素較為敏感。與其他地區(qū)報道的耐藥情況不盡相同，如張揚等[9]報道江西地區(qū)雞源大腸埃希菌分離株對四環(huán)素及多西環(huán)素耐藥率較高，分別為84%和75%,劉香敏等[2]報道山東地區(qū)雞源大腸埃希菌對四環(huán)素較為敏感，李海花等[10]報道天津地區(qū)禽大腸埃希菌對金霉素耐藥性較高。

M.DNA標準DL 2 000;1、4、7、10、13、16.陰性對照；2、5、8、11、14、17.tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL陽性對照；3、6、9、12、15、18.tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL篩查結果M.DNA Marker DL 2 000;1,4,7,10,13,16.Negative control；2,5,8,11,14,17.tetA,tetB,tetC,tetM,tetK,tetL positive control；3,6,9,12,15,18.tetA,tetB,tetC,tetM,tetK,tetL screening result圖2 四環(huán)素類耐藥基因篩查電泳結果Fig.2 Electrophoresis of tetracycline resistance gene screening results of E.coli isolates

本試驗在33株大腸埃希菌分離株中共篩查到tetB、tetC、tetM、tetK、tetL 5種四環(huán)素類耐藥基因，其中tetK分離率最高，為該場大腸埃希菌中主要的四環(huán)素類耐藥基因。耐藥基因分離情況與相關文獻報道也存在差異，如張揚等[9]在雞源大腸埃希菌中發(fā)現tetA基因，而本研究并未檢測出該基因；江西地區(qū)主要四環(huán)素耐藥基因為tetA及tetB，而本研究飼養(yǎng)場中的主要耐藥基因為tetK。不同的藥物敏感性及耐藥基因篩查結果，可能與地區(qū)間藥物使用習慣及治療方式有關[11]。

在本試驗的33株大腸埃希菌分離株中，大部分分離株只攜帶1種四環(huán)素類耐藥基因，極少數分離株同時攜帶3種耐藥基因。說明四環(huán)素類藥物耐藥基因在病原菌，特別是大腸埃希菌中普遍存在，雖然同時攜帶3種耐藥基因的分離株較少，但由于其攜帶耐藥基因數量較多，能夠介導病原菌對四環(huán)素類抗生素的多藥耐藥，因此造成危害較大，需要引起注意[12]。

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TetracyclineSensitivityTestandDrugResistanceGeneDetectionofEscherichiacoliinOneChickenFarmofFuxin

ZHANG Ya-wei1, GAO Feng2, LIU Yao-chuan3, ZHU Jiang-wei3, WEI Shu1, WANG Jun1, ZHAO Pei1, ZHAO Xiao-tong1, GU Gui-bo1

(1.AnimalDiseasePreventionandControlCenterinLiaoningProvince,Shenyang,Liaoning,110164,China;2.LiaoningAgrculturalTechnicalCollege，Yingkou，Liaoning，115009，China;3.MajorAnimalEpidemicEmergencyCenterinLiaoningProvince,Shenyang,Liaoning,110161,China)

E.colicould cause chicken colibacilosis and bring huge harm to breeding industry.In this study,33E.coliisolates were obtained from a chicken breeding farm in Fuxin area,and antibiotic sensitivity test was taken out to detect the sensitivity of isolates to 6 kinds of tetracyclines which commonly used in clinical treatments.And drug resistance genes were screened.The results showed that, isolates were highly resistant to oxytetracycline and doxycyclinum,moderately resistant to tetracycline and doxycylcline,and sensitive to duomycin and deoxytetracycline.5 kinds of resistance genes were screened in 33E.coliisolates,the positive genes were tetB,tetC,tetM,tetK and tetL,none isolates was positive for tetA gene,and tetK was the major resistance gene.

E.coli;tetracyclines;antibiotic resistance;resistance gene

2016-12-13

遼寧省農業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2015015)

張雅為(1981-)，女，遼寧丹東人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學相關研究。

S852.612;S858.31

B

1007-5038(2017)10-0118-04