梁景巖，陳 露，潘 陽，袁婷婷，張雨蒙，徐文華，何凱明，楊天立，王英歌

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，江蘇揚(yáng)州 225001；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇揚(yáng)州 225001)

原花青素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔MMP-9表達(dá)的影響

梁景巖1，陳 露1，潘 陽2，袁婷婷1，張雨蒙2，徐文華2，何凱明2，楊天立2，王英歌2

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，江蘇揚(yáng)州 225001；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇揚(yáng)州 225001)

探討原花青素對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響。將24只新西蘭白兔隨機(jī)分為對(duì)照組(n=8)、模型組(n=8)和原花青素組(n=8)。模型組給予高脂日糧，原花青素組在模型組的基礎(chǔ)上加用原花青素。采集試驗(yàn)前及喂食12周后試驗(yàn)兔的耳緣靜脈血，檢測(cè)靜脈血中血脂水平的變化，觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化情況，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MMP-9的表達(dá)。結(jié)果顯示，在高脂日糧喂養(yǎng)的模型組中MMP-9表達(dá)明顯升高，主動(dòng)脈的病理形態(tài)學(xué)變化嚴(yán)重；而原花青素組主動(dòng)脈病變明顯減輕， MMP-9蛋白表達(dá)明顯下降(P<0．05)。表明原花青素對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展具有抑制作用，這一作用可能是通過抑制MMP-9的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

原花青素；動(dòng)脈粥樣硬化；基質(zhì)金屬蛋白酶-9;家兔

動(dòng)脈硬化是動(dòng)脈的一種非炎癥病變。男性較女性多，其發(fā)病趨勢(shì)嚴(yán)峻，是老年人死亡主要原因之一。動(dòng)脈硬化病人多有脂代謝異常。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是導(dǎo)致動(dòng)脈血管狹窄和閉塞的主要病理過程；同時(shí)也是血管壁慢性炎癥的結(jié)果。在此過程中，金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9， MMP-9)的作用開始被人們所關(guān)注。有研究表明，過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)γ的活化對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis，AS)反應(yīng)能夠起到抑制作用；MMP-9對(duì)AS斑塊的形成過程具有促進(jìn)作用[1]。

原花青素是一種天然抗氧化劑，作為一類生物類黃酮，清除人體內(nèi)自由基功效顯著[2]。其可溶于水，可廣泛應(yīng)用于降血脂、抗脂質(zhì)過氧化、改善血液循環(huán)、預(yù)防白內(nèi)障、降血壓、滋潤(rùn)及美白皮膚等方面[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素在發(fā)揮強(qiáng)抗氧化功能的同時(shí)，對(duì)于人體微循環(huán)特殊改善和清除自由基等方面有重要作用[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，原花青素抑制AS的發(fā)生可通過降脂、改善血管內(nèi)皮功能的途徑實(shí)現(xiàn)。為了驗(yàn)證原花青素是否通過影響 MMP-9的表達(dá)來干擾AS的發(fā)生，本研究通過喂養(yǎng)高脂日糧的方法來建立AS新西蘭白兔模型，通過原花青素的干預(yù)治療來觀察MMP-9的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步完善原花青素對(duì)AS防治的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雌性新西蘭白兔24只，9周齡，體重1.5 kg～2 kg,揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。高脂日糧：普通混合飼料(88.5%)、豬油(10%)、膽固醇(1%)、豬膽鹽(0.5%)。單籠喂養(yǎng)，溫度在22℃～25℃之間，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及模型構(gòu)建 將經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)的24只新西蘭白兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、原花青素組3個(gè)組，每組8只。對(duì)照組飼喂普通飼料每天160 g/只，模型組飼喂高脂飼料160 g/d，原花青素組每天飼喂高脂飼料160 g/d+原花青素1 g/kg，喂養(yǎng)至第12周末。采集所有試驗(yàn)兔耳緣靜脈血，檢測(cè)其血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，同時(shí)對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行X線檢查。若TC、TG偏高，HDL偏低，且X線檢查可見主動(dòng)脈伸長(zhǎng)、擴(kuò)張和扭曲，有時(shí)可見鈣質(zhì)沉著，則可確定該試驗(yàn)兔動(dòng)脈粥樣硬化造模成功。

1.2.2 采集血清標(biāo)本 于12周末采集所有試驗(yàn)兔空腹耳緣靜脈血6 mL，注入不含抗凝劑的試管中，標(biāo)本靜置后離心分離血清。用于測(cè)定血脂中各指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、MMP-9的水平。

1.2.3 動(dòng)物處死及標(biāo)本留取 在12周末，通過往試驗(yàn)兔耳緣靜脈推注空氣的方法將其處死。剖檢出主動(dòng)脈，剝除外膜結(jié)締組織及脂肪，選取其中的降主動(dòng)脈，沖洗，用950 mL/L乙醇固定；獲取標(biāo)本，用于免疫組化檢測(cè)及光鏡觀察病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 將兔降主動(dòng)脈標(biāo)本置于950 mL/L乙醇固定過夜之后，沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，將初步處理好的組織經(jīng)修整后切成厚度為4 μm的切片，放入45℃溫水中展開，隨后，將切片放在56℃溫箱中2 h左右；再通過HE和免疫組化染色觀察其形態(tài)變化。免疫組化染色的陽性標(biāo)記物：棕色反應(yīng)物，其平均灰度值借助細(xì)胞漿染色的方法獲取。

2 結(jié)果

2.1 血脂水平變化

試驗(yàn)前各組試驗(yàn)兔的血脂水平?jīng)]有顯著差異，試驗(yàn)后，通過對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn)，模型組TG增高不如其他指標(biāo)明顯，而與正常對(duì)照組相比，TC、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)均明顯升高(P<0.05)。經(jīng)過原花青素干預(yù)后的原花青素組，與模型組比較，TG變化不明顯，而TC、LDL-C、HDL-C等指標(biāo)均有降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2 病理形態(tài)學(xué)情況

通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組血管表現(xiàn)為內(nèi)皮光滑,內(nèi)皮細(xì)胞完整、排列整齊；中膜平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)排列整齊。模型組血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞缺失嚴(yán)重，內(nèi)膜增厚明顯，含大量泡沫細(xì)胞，脂質(zhì)沉積等；中膜SMC增殖，排列紊亂。原花青素組內(nèi)膜增厚不明顯，泡沫細(xì)胞的含量少；中膜SMC排列比較整齊(圖1)。

表1 3組兔血脂指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of blood lipid indexes of three groups of rabbits

注：*與對(duì)照組相比，P<0.05;#與，與模型組相比，P<0.05。
Note:*Compared with the control group,P<0.05;#Compared with the model group,P<0.05.

A.對(duì)照組;B.模型組;C.原花青素組A.Control group;B.Model group;C.Proanthocyanidins group圖1 HE染色觀察各組主動(dòng)脈病理形態(tài)Fig.1 HE staining to observe the aortic histopathological lesions

2.3 MMP-9的表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， MMP-9的棕色反應(yīng)物位于胞漿上，對(duì)照組棕色反應(yīng)物的表達(dá)量較少。模型組表達(dá)增多明顯，在內(nèi)膜靠近中膜處表現(xiàn)的尤為突出，呈棕黃色或棕褐色；原花青素組表達(dá)降低明顯，著色程度降低(圖2)。與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，模型組和原花青素組MMP-9表達(dá)水平有明顯差異 (P<0.05)；模型組和原花青素組相比，原花青素組的MMP-9表達(dá)明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.05)(表2)。

A.對(duì)照組;B.模型組;C.原花青素組A.Control group;B.Model group;C.Proanthocyanidins group圖2 免疫組化觀察主動(dòng)脈MMP-9表達(dá)在組間變化情況Fig.2 The changes of aortic MMP-9 expressions observed by immunohistochemistry in three groups

表2 金屬蛋白酶(MMP-9)的灰度值表達(dá)情況Table 2 The expression of matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) by calculating the gray value

注：*與對(duì)照組相比，P<0.05;#與，與模型組相比，P<0.05。
Note:*Compared with the control group,P<0.05;#Compared with the model group,P<0.05.

3 討 論

AS的主要病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)的沉積、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、泡沫細(xì)胞的出現(xiàn)以及血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖和遷移，最后導(dǎo)致了粥樣斑塊形成。其中的一個(gè)關(guān)鍵性因素是由于VSMC增殖和遷移[7]。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor-b，PDGF-B)對(duì)動(dòng)脈中膜收縮型SMC具有促進(jìn)作用，可以使其遷移到內(nèi)膜下層時(shí)，轉(zhuǎn)化為分泌型SMC，參與粥樣斑塊的形成過程，是最有力的促有絲分裂原[8-9]；在此過程中通過分泌大量的活性物質(zhì)來促使細(xì)胞黏附，同時(shí)這些活性物質(zhì)也具有強(qiáng)烈的縮血管作用。MMP-9能夠?qū)MC從基底膜中釋放出來，對(duì)VSMC基底膜基質(zhì)具有分解作用，進(jìn)一步導(dǎo)致VSMC的移行，對(duì)AS發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[10]。AS的重要防御因子之一是血漿血脂中的HDL-C，而血漿中血脂主要成分包括TC、TG、HDL-C和LDL-C，對(duì)于AS的發(fā)生發(fā)展具有很明顯的抑制作用，對(duì)于AS的消退也具有明顯的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和原花青素組的新西蘭白兔血脂各指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組；模型組在AS形成過程中存在血脂代謝紊亂，并且在3個(gè)組中最為嚴(yán)重；原花青素組血脂的各項(xiàng)指標(biāo)(TG、TC、LDL-C)明顯低于模型組，而HDL-C水平明顯高于模型組，提示原花青素能夠通過改善血脂代謝來抑制AS形成?；|(zhì)金屬蛋白酶的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)SMC從中膜遷移至內(nèi)膜起到至關(guān)重要的作用[11]。由于MMP-9的主要功能是降解纖維中的基質(zhì)，因而在提升斑塊的易脆性和削弱斑塊的纖維帽這方面起到一定的作用，從而引起了斑塊破裂、血栓形成等后果，然而給予一定量的MMP-9抑制劑，能夠在AS的發(fā)展以及新生內(nèi)膜的形成等過程中起到一定的抑制作用[12]。MMP-9是MMP家族中重要成員之一，它的重要作用主要體現(xiàn)在VSMC遷移、基質(zhì)降解、AS形成和加速斑塊破裂，主要功能是降解彈力纖維和Ⅳ型膠原[13]。通過本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMP-9蛋白在對(duì)照組的表達(dá)明顯低于模型組；與模型組相比，原花青素組MMP-9蛋白表達(dá)明顯減輕，提示原花青素能降低 MMP-9蛋白的表達(dá)水平，從而對(duì)SMC從中膜向內(nèi)膜遷移的過程起到抑制作用；與抑制VSMC向內(nèi)膜遷移的MMP-9抑制劑效果一致[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)原花青素能夠抑制MMP-9的表達(dá)是通過改善血脂代謝來實(shí)現(xiàn)，通過抑制SMC對(duì)VSMC基底膜基質(zhì)的分解，從而起到防治AS的作用，表明原花青素抗AS療效的可靠性，本研究從分子生物學(xué)角度探討了原花青素抗AS機(jī)制，為探討MMP-9對(duì)AS的作用機(jī)制提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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EffectsofProanthocyanidinsonExpressionsofMMP-9inaRabbitModelofAtherosclerosis

LIANG Jing-yan1,CHEN Lu1,PAN Yang2,YUAN Ting-ting1,ZHANG YU-meng2,XU Wen-hua2,HE Kai-ming2,YANG Tian-li2,WANG Ying-ge2

(1.DepartmentofBasicMedicineandMedicalTechnology,YangzhouUniversitySchoolofMedicine,Yangzhou,Jiangsu,225001,China;2.DepartmentofClinicalMedicine,YangzhouUniversitySchoolofMedicine,Yangzhou,Jiangsu,225001,China)

To study the effects of proanthocyanidins on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in rabbits with atherosclerosis,twenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups: control group (n=8),model group (n=8) and proanthocyanidins group (n=8).The model group was fed with the high-cholesterol diet,and the proanthocyanidins group that were on the basis of the model group were fed with proanthocyanidins.The changes of blood lipid in venous blood were analyzed before the experiment and at the 12th weeks of feeding; the changes of aortic pathological lesions were observed and the expression of MMP-9 was detected by immunohistochemistry.The expression of MMP-9 was significantly increased in the model group with high-cholesterol diet,and corresponding pathological lesions of aorta were serious.However,the expression of MMP-9 was significantly decreased in the proanthocyanidins group (P<0.05),beside,the aortic pathological lesions were improved.Proanthocyanidins have an inhibitory effect on the development of atherosclerosis,and this effect may be achieved by inhibiting the expression of MMP-9.

proanthocyanidins;atherosclerosis;matrix metalloproteinase-9；rabbit

2017-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81570392);國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFE0126000)

梁景巖(1977-)，男，黑龍江黑河人 ，博士 ，講師 ，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。

S852.31;S853.74

A

1007-5038(2017)10-0088-04