高平章+簡迪強+呂鳳嬌+謝曉蘭

摘要：以凡納濱對蝦為試驗對蝦，通過不同濃度0、2、10、20 μg/L鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）暴露不同時間（120、240 h）后，采用酶促反應動力學法及實時PCR檢測分析對蝦殼膜幾丁質酶比活力及幾丁質酶 mRNA表達量差異。結果顯示，DMP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶比活力具有抑制作用，但不具有顯著性。不同濃度DMP暴露不同時間后，對對蝦殼膜幾丁質酶系列基因的mRNA表達量均受到不同程度的影響，2 μg/L DMP 暴露120 h時，對蝦殼膜LvCHT3 mRNA 表達量顯著上升；2 μg/L DMP暴露240 h時，LvCHT2 mRNA表達量顯著下降；20 μg/L DMP暴露240 h時，LvCHT6 mRNA表達量也顯著下降，說明DMP對對蝦生長發(fā)育具有毒性。

關鍵詞：凡納濱對蝦；鄰苯二甲酸二甲酯；暴露；殼膜幾丁質酶；響應機制；比活力；mRNA表達量；水體塑化劑監(jiān)控

中圖分類號： S945.4+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0155-04

通信作者：謝曉蘭，博士，教授，主要從事生物化學及生態(tài)毒理學研究。E-mail：xxl_qztc@163.com。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）別稱南美白對蝦，分類上隸屬于節(jié)肢動物門甲殼綱十足目游泳亞目對蝦科對蝦屬亞屬，在沿海地區(qū)廣泛養(yǎng)殖[1]。福建省地處沿海，海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是主要產(chǎn)業(yè)，近年來隨著對蝦人工養(yǎng)殖越來越多，養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的問題也越來越多，特別是養(yǎng)殖水體的污染問題。養(yǎng)殖水體中嚴重超標的金屬離子、有機化合物等都將導致對蝦體內(nèi)生理生化的變化，引發(fā)對蝦的蛻殼困難、生長發(fā)育緩慢、健康程度下降、患病率和死亡率升高等問題[2]。鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）等鄰苯二甲酸酯類（PAEs）化合物是常見的塑化劑（別稱酞酸酯），常用作增塑劑添加劑，會干擾人體內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)，影響人體健康[3-4]。隨著塑料制品的廣泛應用，鄰苯二甲酸酯類塑化劑已成為一種分布廣泛的內(nèi)分泌干擾物，對生態(tài)及環(huán)境健康構成了嚴重威脅[5-6]。

幾丁質酶（EC3.2.1.14）廣泛分布于各種生物體內(nèi)，與對蝦的生長發(fā)育、食物消化及疾病防御密切相關[7]。幾丁質酶是多基因家族，黃乾生等已從凡納濱對蝦中克隆出多個幾丁質酶基因，這些基因具有不同的組織分布特異性，其中凡納濱對蝦幾丁質酶基因LvCHT1、LvCHT3和LvCHT4主要表達于肝胰腺；LvCHT2在眼柄中表達量；LvCHT6和LvCHT7主要在殼膜中表達；而LvCHT5組織表達差異性較小[8]。本試驗通過暴露不同濃度的DMP于對蝦生長環(huán)境中，觀察研究暴露不同時間后，對蝦殼膜幾丁質酶比活力和基因表達量的變化，從而判斷DMP暴露對對蝦生長發(fā)育的影響。試驗結果有助于闡明幾丁質酶對DMP暴露的響應機制及DMP對對蝦生長發(fā)育的影響機制，同時也可為對蝦養(yǎng)殖水體的塑化劑監(jiān)控提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗材料為凡納濱對蝦，購于福建省泉州秀土對蝦養(yǎng)殖場，體長約（8.0±1.0） cm。

試驗試劑：RNA提取試劑盒，OMEGA bio-tek公司；5×Prime Script Buffer，TaKaRa公司；Taq酶，TaKaRa公司；β-actin 引物（actin-F：5′-TACACCTTCACGACCACCGC-3′；actin-R：5′-TCTCCAGCGAGGAGGAGGAA-3′）、LvCHT2引物（LvCHT2-F：5′-CGGCAAGTACAGACCTGAAGACAT-3′；LvCHT2-R：5′-ATCATAATCAGCCCAAGTGTCGTG-3′）、LvCHT5引物（LvCHT5-F：5′-TGTCTCCGCTTTGGTGAGG-3′；LvCHT5-R：5′-ATGGTGGTGGGCGTATTGTT-3′）、LvCHT6引物（LvCHT6-F：5′-CGCTTTCATCCAACACCACC-3′；LvCHT6-R：5′-CCTCGCGGAGTTCCTTAACC-3′）、LvCHT7引物（LvCHT7-F：5′-CTTGTTCCAGATGGCACTG TATTT-3′；LvCHT7-R：5′-TGGTTCTTGTTCAGGTGTC TTTTC-3′），均由上海生工生物工程股份有限公司合成；牛血清蛋白，上海藍季科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍G-250，國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯二甲酸二乙酯，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖，天津市福晨化學試劑廠；其他化學試劑，均為西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，使用的蒸餾水均為玻璃重蒸水。

1.2試驗方法

1.2.1酶濃度的測定配制0.1 mg/mL標準蛋白溶液與001%考馬斯亮藍G-250，取6個15 mL離心管，將其標好號，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蛋白質標準液，再加入5 mL考馬斯亮藍染液，用蒸餾水補足至6 mL，試劑空白對照，用UV-1800紫外分光光度計測定其在595 nm下的D值，然后以標準蛋白量（μg）為橫坐標、以D值為縱坐標，繪制標準曲線，過原點回歸得標準曲線方程：y=4.62×0.001x，r2=0.992。采用相同的方法，以提取的幾丁質酶液代替標準蛋白溶液測定酶蛋白濃度。

1.2.2凡納濱對蝦DMP暴露試驗與取樣凡納濱對蝦在實驗室馴養(yǎng)穩(wěn)定后進行暴露試驗。對蝦養(yǎng)殖條件：水溫為（22±1） ℃，比重為1.010，鹽度為1%，pH值為7.6。DMP暴露設計：設置4個DMP梯度濃度組，分別為0、2、10、20 μg/L（二甲亞砜助溶），每個濃度組設3個平行組。暴露試驗在 50 cm× 35 cm×30 cm的養(yǎng)殖桶中進行，放試液 20 L，隨機放入試驗對蝦50尾，試驗期間每天喂食一定量，每天定時換 10 L 試液，持續(xù)增氧。分別暴露120、240 h后，每桶分別取3尾對蝦，用蒸餾水將取樣對蝦沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，將殼膜放入研缽中加入適量Tris-HCl緩沖液研磨，置 4 ℃ 抽提1 h后，12 000 r/min下冷凍離心，取中間澄清液，即得幾丁質酶粗酶液，冷凍以備分析幾丁質酶比活力和mRNA表達量。endprint

1.2.3幾丁質酶比活力的測定參見文獻[9]，以葡萄糖作標準物，采用DNS法測定還原糖濃度，以葡萄糖量（mg）為橫坐標、以D500 nm為縱坐標繪制標準曲線，得回歸曲線方程y=1.25x（r2=0.998）。參照文獻[10]制備膠體幾丁質，再用蒸餾水調(diào)膠體幾丁質溶液至終濃度為1%。取0.5 mL 1%膠體幾丁質溶液和0.5 mL （pH值為 6.0）0.1 mol/L磷酸緩沖液混合后，在45 ℃下預熱10 min，加入0.3 mL幾丁質酶液和02 mL蒸餾水，45 ℃下反應1 h，沸水浴20 min終止反應，并迅速冷卻后再加入1.5 mL DNS試劑，再沸水浴20 min，冷卻到室溫后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，離心后取上清，并以滅活的等量酶液按上述步驟作空白對照，在500 nm下測吸光度。以還原糖的生成速度來衡量幾丁質酶活力。酶活力單位定義為：在45 ℃、pH 值6.0的測活條件下，水解膠體幾丁質生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為1個活力單位。比活力定義為：1 mg酶蛋白具有的酶活力單位。

1.2.4幾丁質酶mRNA表達量的測定

1.2.4.1總RNA的提取、純化與反轉錄快速取約100 mg殼膜加入1 mL RNA-組織裂解液和3顆鋼珠，用勻漿機勻漿3 min，4 ℃放置30 min，加入200 μL三氯甲烷，混勻，在冰上放置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液加入250 μL無水乙醇混勻，用HiBind RNA Spin柱子過濾，分別用300、400 mL Wash Buffer Ⅰ沖洗柱子各1次，再用500 mL Wash Buffer Ⅱ沖洗柱子2次，并在10 000 r/min離心1 min去除緩沖液，在14 000 r/min下離心2 min甩干，用40 μL DEPC-水將mRNA溶解轉移至新的離心管中，即得到總RNA。用微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。

RT-PCR反應體系：2 μL的5×Prime Script Buffer（含有Prime Script RTase、RNase Ⅰnhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反應Buffer），500 ng RNA，最后用 DEPC-水補足至10 μL；反應條件為：37 ℃反轉錄15 min，85 ℃ 反轉錄酶失活5 s。在該反轉錄體系及條件下反轉錄得cDNA。

1.2.4.2幾丁質酶的實時熒光PCR在LightCycle 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應體系為：Taq酶（含有TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶、dNTP mixture、Mg2+ 、Tli RNaseH和SYBR Green Ⅰ）10 μL，前后引物（0.4 μmol/L）各0.8 μL，DEPC-水6.4 μL，cDNA模板2 μL。反應條件為：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃引物退火20 s，40個循環(huán)。

1.2.5SPSS數(shù)據(jù)分析將試驗數(shù)據(jù)用 SPSS 20.0軟件進行單因子方差（ANOVA）和Duncans統(tǒng)計分析，得到“平均值±標準差”，當P<0.05時，表示差異顯著。

2結果與分析

2.1DMP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶比活力的影響

以“1.2.2”節(jié)的試驗方法對凡納濱對蝦進行不同濃度DMP的養(yǎng)殖暴露，分別于暴露120、240 h后取樣制備殼膜幾丁質酶粗酶液，測定酶濃度和酶活力，SPSS分析比較對蝦在0、2、10、20 μg/L DMP暴露120、240 h下的殼膜幾丁質酶比活力變化情況，具體試驗結果見表1。

2.2DMP暴露對對蝦殼膜LvCHT2基因mRNA表達量的影響

采用“1.2.4”節(jié)的方法，快速取0、2、10、20 μg/L DMP暴露組凡納濱對蝦的蝦殼，提取mRNA，反轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR，記錄其復制次數(shù)。以Lv-actin為內(nèi)參，根據(jù)文獻[11]中ΔΔCT（差別循環(huán)數(shù)）=（CT，目的基因 -CT，內(nèi)參基因）DMP暴露組-（CT，目的基因-CT，內(nèi)參基因）空白對照組用濃度代替其中的時間即可計算在不同濃度下的ΔΔCT 值，再計算2ΔΔCT 即可得出差別擴增倍數(shù)。暴露DMP 120、240 h對LvCHT2 mRNA表達量的擴增結果見表2。不同濃度DMP暴露120 h后，隨著暴露的DMP濃度增大，LvCHT2 mRNA表達量起著先降后升的影響趨勢，進一步采用SPSS單因素方差分析試驗數(shù)據(jù)，結果得P=0.218<0.05，說明影響趨勢沒有顯著差異。但隨著暴露時間延長，隨著DMP暴露濃度增大，LvCHT2 mRNA表達量變成先降后升的趨勢，進一步采用SPSS單因素方差分析試驗數(shù)據(jù)，結果得P=0.048<0.05，說明該影響趨勢具有顯著差異。2 μg/L DMP暴露對LvCHT2 mRNA表達量的影響與其他濃度組（0、10、20 μg/L）相比顯著下降，其中與空白對照組相比，LvCHT2 mRNA表達量下降78.8%。

2.3DMP暴露對對蝦殼膜LvCHT3 mRNA表達量的影響

由表 3可見，不同濃度DMP暴露120 h對對蝦殼膜LvCHT3 mRNA表達量的影響如同對LvCHT2 mRNA表達量的影響。不同濃度DMP對LvCHT3 mRNA表達量的影響趨勢也是呈現(xiàn)先降后升的影響趨勢，進一步采用SPSS單因素方差分析得P=0.007<0.05，說明影響趨勢具有顯著差異。2 μg/L DMP暴露對LvCHT3 mRNA表達量的影響與其他濃度組的表

2.6DMP暴露對對蝦殼膜LvCHT7 mRNA表達量的影響

由表6可見，不同濃度的DMP暴露120 h后，LvCHT7 mRNA的表達量均受到不同程度的抑制，進一步采用SPSS單因素方差分析，結果得P=0.104>0.05，說明抑制效果沒有顯著性。但隨著暴露時間的延長，當不同濃度的DMP暴露 240 h 后，與空白組相比，LvCHT7 mRNA表達量出現(xiàn)大幅提升，進一步采用SPSS單因素方差分析，結果得P=0.475>005，說明影響沒有顯著性。與其他濃度組相比，2 μg/L DMP暴露240 h后，LvCHT7 mRNA表達量的提升幅度最大，與空白組相比，LvCHT7 mRNA表達量提升了480%。endprint

3討論與結論

DMP在當今社會生產(chǎn)中大量使用，DMP已經(jīng)成為環(huán)境檢出率較高的重要環(huán)境污染物之一，福建九龍江水樣含有DMP、DEHP、DEP、DOP、BBP和DBP等各種PAEs有機化學污染物，最高含量分別達1.64、3.77、11.70、0.31、0.14、17.20 μg/L[12]。福建泉州灣表層海水中DMP等PAEs 的總含量在18.77～191.51 ng/L 之間，平均值為 82.28 ng/L [13]。PAEs 易溶于脂肪，所以水體中PAEs可在水生動物體內(nèi)富集，具有較強的生態(tài)毒性。李文英等對斑馬魚進行20 d 的PAEs類物質慢性染毒試驗，發(fā)現(xiàn)隨PAEs類物質濃度增大和暴露時間延長，斑馬魚肝臟、鰓中的SOD和ATPase 活力均顯著受到抑制[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，DMP暴露240 h對對蝦的體長、體質量沒有顯著影響，但隨著暴露時間增長，對蝦的死亡率有所上升；DMP暴露后，與對蝦生長發(fā)育密切相關的殼膜幾丁質酶比活力均出現(xiàn)不同程度下降，但這種抑制效果沒有顯著性，沒有顯著性可能是DMP的暴露時間不夠長及暴露濃度不夠高。但2 μg/L DMP暴露120 h時，使對蝦殼膜LvCHT3 mRNA表達量顯著上升，其他不同濃度組暴露120 h后也出現(xiàn)不同的影響效果，但不具有顯著性；各濃度組DMP暴露120 h對殼膜LvCHT2、LvCHT5、LvCHT6、LvCHT7也均有不同的影響趨勢，同樣不具有顯著性。不同濃度的DMP暴露240 h后，對各種幾丁質酶基因的mRNA表達量也出現(xiàn)不同程度的影響，2 μg/L DMP暴露 240 h 時，LvCHT2 mRNA表達量顯著下降；20 μg/L DMP暴露240 h時，LvCHT6 mRNA表達量也顯著下降；而其他濃度組暴露240 h對LvCHT2 mRNA、LvCHT6 mRNA的表達影響均不具有顯著性；各濃度DMP暴露240 h后對LvCHT3、LvCHT5、LvCHT7的mRNA影響也均沒有顯著性。說明DMP暴露具有基因毒性，DMP暴露可能通過對與對蝦生長密切相關的幾丁質酶系基因表達影響來影響對蝦的生長發(fā)育，這種毒害會造成永久性毒害并相應產(chǎn)生具體的表觀病態(tài)現(xiàn)象。

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