鐘寶元+劉清泉+鄧龍穎

【摘要】 目的：探討腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌的療效。方法：根據(jù)GenBank中Surivivin基因序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物5端引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)，以HepG2基因組DNA為模板擴(kuò)增Surivivin啟動(dòng)子基因片段。體外合成最小polyA轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)，以pSUPER.retro.puro載體為媒介構(gòu)建新的干涉載體pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP），完成干涉靶點(diǎn)的選取并完成干涉載體的構(gòu)建和鑒定；建立細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，完成FAK RNAi的干擾效應(yīng)性檢測(cè)，進(jìn)行體外細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：重組質(zhì)粒完成DNA提取后，PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得1條預(yù)期大小的特異性皮帶，質(zhì)粒Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA涉及符合要求。將目的片段與腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA慢性載體表達(dá)載體連接的陽性克隆序列，獲得DNA序列證實(shí)含有目的序列片段，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功；PCR儀結(jié)果顯示：Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平較低，抑制率能達(dá)到73.33%；Western blotting法結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后，與未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞Surivivin含量明顯下降；流式細(xì)胞儀結(jié)果表明：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA細(xì)胞凋亡率為24.39%，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的4.12%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，控制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】 腫瘤特異性； Surivivin啟動(dòng)； FAK shRNA； 靶向治療

【Abstract】 Objective：To investigate the therapeutic effects of tumor specific Surivivin promoter targeting FAK and shRNA on hepatocellular carcinoma.Method：Primers were designed according to the Surivivin gene sequence in GenBank，and the corresponding restriction sites were introduced at the 5th and the end of primer DNA.The promoter fragment of Surivivin was amplified by HepG2 genomic DNA template.In vitro synthesis of polyA transcription termination signal to the minimum，pSUPER.retro.puro vector mediated interference vector pS-surP-shRNA-mpA （pS/surP），a new interference target selection and complete the construction and identification of interference vector.Establish the cell culture and transfection and stable transfection cell lines，to complete the interference effect of detecting FAK RNAi，cell proliferation and apoptosis experiments in vitro.Result：After DNA extraction，the recombinant plasmid was amplified by PCR，and 1 expected size specific bands were obtained by agarose gel electrophoresis.FAK shRNA regulated by plasmid Surivivin promoter met the requirement.FAK shRNA chronic carrier of the fragment and tumor specific Surivivin promoter and expression of positive clone sequence vector，DNA sequence was confirmed with the objective fragment，suggesting that plasmid was successfully constructed.PCR instrument showed that Surivivin promoter FAK shRNA in HCC cells expression level is low，the inhibition rate can reach 73.33%.Western blotting method showed：after transfection，compared with untransfected HepG2 cells，transfected Surivivin cells was significantly decreased.Flow cytometry results showed that FAK cells after transfection，shRNA cell apoptosis of tumor specific Surivivin promoter was 24.39%，and there was significant difference compared with 4.12% of non transfected cells（P<0.05）.Conclusion：Tumor specific Surivivin promoter targeting FAK shRNA targeting HCC can significantly inhibit the proliferation of tumor cells and control tumor invasion and metastasis.endprint

【Key words】 Tumor specificity； Surivivin promoter； FAK shRNA； Targeted therapy

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.007

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，而我國是原發(fā)性肝癌發(fā)病率較高的國家[1]。有報(bào)道顯示，我國每年惡性腫瘤發(fā)病率為35萬，每年死亡人數(shù)約32萬，嚴(yán)重影響我國居民健康與生活[2]。目前，臨床上對(duì)于原發(fā)性肝癌以手術(shù)、放化療及介入等治療為主，這些方法雖然能改善患者癥狀，但是長(zhǎng)期療效欠佳，不能從根本上改善患者的預(yù)后[3-4]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物技術(shù)為生物方法治療肝癌提供了新的方法[5]。為了探討腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌。本課題從外源性基因?yàn)槠瘘c(diǎn)，完成細(xì)胞的分離鑒定，并進(jìn)行體外、體內(nèi)試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 本課題中主要儀器和試劑主要為RT-PCR試劑盒、倒置相差顯微鏡、流式細(xì)胞分選儀、熒光定量PCR儀及BCA-100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒等，相關(guān)試劑和儀器廠家如下，見表1。

1.2 方法 （1）根據(jù)GenBank中Surivivin基因序列設(shè)計(jì)引物，并分別在上下游引物5端引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)，以HepG2基因組DNA為模板擴(kuò)增Surivivin啟動(dòng)子基因片段。體外合成最小polyA轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)，將pSUPER.retro.puro作為媒介完成心載體pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP）的構(gòu)建[6]。（2）干涉靶點(diǎn)的選?。涸谙嚓P(guān)基因庫中確定FAK基因序列，并根據(jù)相關(guān)要求完成兩對(duì)siRNA寡聚脫氧核苷酸序列的設(shè)計(jì)，以一組經(jīng)處理后無同源性的siRNA作為對(duì)照。（3）干涉載體的構(gòu)建和鑒定：將以人FAK基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)的siRNA寡核苷酸鏈的退火后，與構(gòu)建好的Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP）連接，構(gòu)建重組的短發(fā)卡狀shRNA真核表達(dá)載體，通過篩選、測(cè)序?qū)Σ迦雙S/surP中的干涉序列進(jìn)行鑒定，并分別命名為：pS/surP-FAK/shRNA1、pS/surP-FAK/shRNA2、

pS/surP-NS（Non-Specific siRNA）[7-8]。（4）細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立：將人肝癌細(xì)胞系HepG2放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行4～5 d培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)箱條件：37 ℃、5%CO2，隔日換液。在轉(zhuǎn)染前去適當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁90.0%以上后開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染完畢后再次利用600 μg/mL的G418抗生素進(jìn)行篩選，約2周后待大部分細(xì)胞死亡，并有陽性克隆長(zhǎng)出時(shí)，導(dǎo)致顯微鏡下觀察單個(gè)細(xì)胞克隆情況；持續(xù)利用100μg/mL的G418抗生素完成1個(gè)月篩選，凍存[9]。（5）FAK RNAi的干擾效應(yīng)檢測(cè)：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系分別命名如下：HepG2-s1、HepG2-s2、HepG2-NS。用RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中FAK mRNA的表達(dá)水平。Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中FAK蛋白的表達(dá)水平。（6）體外細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)：通過水溶性四唑鹽（WST-1）比色法來檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀技術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，流式細(xì)胞儀技術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，TdT-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或者未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞進(jìn)行Caspase-3活性分析比較[10-11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定及序列測(cè)定 （1）PCR擴(kuò)增鑒定。重組質(zhì)粒完成DNA提取后，PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得1條預(yù)期大小的特異性皮帶，質(zhì)粒Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA涉及符合要求，見圖1。（2）序列的鑒定。將目的片段與腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA慢性載體表達(dá)載體連接的陽性克隆序列，獲得DNA序列證實(shí)含有目的序列片段，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

2.2 體外細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn) （1）RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染中Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA表達(dá)。PCR儀結(jié)果顯示：Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平較低，抑制率能達(dá)到73.33%，見圖2。（2）Western blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中FAK基因調(diào)控蛋白。轉(zhuǎn)染后，未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞Surivivin含量明顯下降，見圖3。

2.3 流式細(xì)胞儀技術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀結(jié)果表明：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA細(xì)胞凋亡率為24.39%，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的4.12%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

3 討論

肝癌是臨床上常見的疾病，在不同年齡段均可發(fā)病，且多發(fā)生在中老年人群中，患者由于年齡較大，機(jī)體免疫相對(duì)較低，再加上長(zhǎng)期伴有乙型肝炎、飲酒史等，加劇疾病的發(fā)展。肝癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診，已經(jīng)是中、晚期，延誤了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，臨床上如何采取有效的措施提高肝癌患者治療效果對(duì)改善預(yù)后具有重要的意義[12-13]。endprint

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)于原發(fā)性肝癌的研究已經(jīng)深入到基因水平，再加上“基因沉默”技術(shù)的發(fā)展及利用，為肝癌的分析靶向治療提供了新的方法[14-15]。本課題中以siRNA為基礎(chǔ)完成相關(guān)基因片段的感染，能有效地抑制靶基因基因表達(dá)水平及活性，能在一定程度上對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)發(fā)揮干擾。目前，臨床上對(duì)于肝癌的治療中RNAi 主要由RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）啟動(dòng)子調(diào)控等構(gòu)成，這些放大雖然能延緩病情發(fā)展，但是對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制缺乏特異性。Surivivin屬于是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，在正常人體中Surivivin表達(dá)水平相對(duì)較多，且多存在于胚胎細(xì)胞[16-17]。對(duì)于肝癌患者發(fā)病后機(jī)體免疫將迅速發(fā)揮作用，導(dǎo)致Surivivin水平得到迅速上升，并且在腫瘤細(xì)胞中均可表達(dá)，能夠選擇性地在癌組織中激活其后的外源基因的轉(zhuǎn)錄，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。國內(nèi)學(xué)者擴(kuò)增了Surivivin基因翻譯起始位點(diǎn)上游約0.4 kb的片段，證實(shí)Surivivin在肝癌細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性[18]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系中，Surivivin啟動(dòng)子活性相當(dāng)高，是AFP啟動(dòng)子活性的數(shù)十倍。由此可以看出：在肝癌的靶向性基因治療中，Surivivin啟動(dòng)子能夠有效的啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，它比AFP啟動(dòng)子具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。本研究擬利用腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性而在正常細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性幾乎為零的特性，構(gòu)建腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK RNAi真核表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的RNA干涉系統(tǒng)特異性的封閉腫瘤內(nèi)源性FAK基因表達(dá)[19]。將腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌中能積極有效的控制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，能為臨床原發(fā)性肝癌的治療提供新的思路和方法，延長(zhǎng)患者壽命，促進(jìn)患者早期恢復(fù)[20]。

綜上所述，腫瘤特異性Surivivin啟動(dòng)子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，控制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，能為肝癌的治療提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2017-06-12） （本文編輯：程旭然）endprint