劉子重++李欣

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.25.007

[摘要] 目的 研究黑素對人表皮滲透屏障功能和超微結(jié)構(gòu)的影響。 方法 方便選取2014年8月—2015年8月于鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院皮膚科門診招募穩(wěn)定期白癜風(fēng)20例，用多功能皮膚生理儀測量黑素缺失的白癜風(fēng)皮損和正常皮膚的基礎(chǔ)經(jīng)皮水分丟失及恢復(fù)率；同時，從上述患者中挑選出5例，用RuO4電子特染結(jié)合透射電鏡技術(shù)比較白癜風(fēng)脫色皮損和正常皮膚角質(zhì)層板層脂膜超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 白癜風(fēng)組TEWL為（11.13±1.04）g/（m2·h），對側(cè)正常皮膚組TEWL為（10.38±1.26）g/（m2·h）；兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；白癜風(fēng)TEWL的恢復(fù)速率為（41.29±4.03）%，對側(cè)正常皮膚TEWL的恢復(fù)速率為（59.47±4.23）%，白癜風(fēng)皮損恢復(fù)率低于正常皮膚。電鏡下觀察到正常皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間隙可見4～8層排列規(guī)整電子致密帶和透明帶重復(fù)交替排列板層狀脂膜結(jié)構(gòu)，白癜風(fēng)皮損角質(zhì)層細(xì)胞間隙板層脂膜結(jié)構(gòu)斷裂出現(xiàn)空泡，空泡內(nèi)充填有無形電子致密物。結(jié)論 黑素缺失皮損存在存在滲透屏障功能和結(jié)構(gòu)的改變，可能原因皮損由于黑素缺失，影響了板層脂膜合成相關(guān)酶類活性。

[關(guān)鍵詞] 黑素；白癜風(fēng)；經(jīng)皮水分丟失；超微結(jié)構(gòu)；板層脂膜

[中圖分類號] R28 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）09（a）-0007-04

Effects of Melanin on the Function and Ultrastructure of Human Epidermal Osmotic Barrier

LIU Zi-zhong， LI Xin

Department of Dermatology， the Fourth Hospital of Zhenjiang， Zhenjiang， Jiangsu Province， 212001 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the effects of melanin on function and ultrastructure of human epidermal osmotic barrier. Methods 20 outpatients with stable vitiligo recruited from August 2014 to August 2015 at Department of Dermatology in this hospital were convenient selected. The basal TEWL and the barrier recovery rate were measured on both vitiligo-involved and contralateral uninvolved sites by respective probes connected to a multifunctional skin physiological instrument. And 5 patients were selected among the above 20 patients， the ultrastructural changes of lipid lamellar membranes in the skin were assessed by a transmission electron microscopy （TEM） technique in combination with ruthenium tetroxide （RuO4） staining. Results TEWL in vitiligo-involved group was not significantly different compared with the uninvolved group[（11.13±1.04）g/（m2·h） vs （10.38±1.26）g/（m2·h）]）； at the same time， barrier recovery was significantly delayed in vitiligo-involved group compared with contralateral uninvolved group[（41.29±4.03）% vs （59.47±4.23）%]（P<0.05）， so the recovery rate was lower than the normal skin. Electron microscopy showed that normal skin stratum corneum cell gap can be seen 4 to 8 layers arranged regular electron dense band and zona pellucida repeated alternating plate lamellar lipid membrane structure， vitiligo skin lesions stratum corneum cell gap lamellar lipid membrane structure fragmentation， the voids are filled with invisible electronic compacts. Conclusion The loss of melanin in the skin might alter the function and the structure of epidermal permeability barrier. The reason may be absence of melanin inhibiting activity of enzymes in lamellar membrane synthesis.endprint

[Key words] Melanin； Vitiligo； Transepidermal water loss； Ultrastructure； Lamellar membrane

皮膚的顏色深淺決定于黑色素的數(shù)量，同時發(fā)現(xiàn)皮膚的很多功能與黑色素相關(guān)[1]。比如深色皮膚較淺色皮膚不易感染白色念珠菌，光損傷的嚴(yán)重程度在深淺皮膚中有所不同，此外，在日光暴露下，淺色皮膚較深色皮膚容易干燥，深色皮膚老化較淺色皮膚推遲，然而，對于表皮滲透屏障功能，深淺色皮膚的比較目前尚不確定。臨床上白癜風(fēng)皮損內(nèi)黑素減少甚至缺失，為我們探討黑素、表皮屏障兩者之間的關(guān)聯(lián)提供了一個有價值的體內(nèi)模型。該實(shí)驗(yàn)通過對2014年8月—2015年8月門診招募穩(wěn)定期白癜風(fēng)20例滲透屏障功能進(jìn)行比較研究，同時在透射電鏡下對白癜風(fēng)皮損和正常皮膚滲透屏障超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，以期探討黑素對皮膚屏障可能影響及其機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

實(shí)驗(yàn)一

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取20例白癜風(fēng)志愿者加入該實(shí)驗(yàn)，所有志愿者都是在鎮(zhèn)江市居住1年以上的常住居民。男9例，平均年齡（41.32±0.82）歲，女11例，平均年齡（26.17±1.37）歲，發(fā)病部位見表1）。以前研究紫外線影響皮膚色素，為了消除紫外線對角質(zhì)層功能影響，所有患者白癜風(fēng)部位及對照正常側(cè)皮膚沒有紫外線暴露，所有患者皮膚分型為Ⅲ或者Ⅳ（Fitzpatrick分型），而且患者局部和系統(tǒng)沒有使用藥物，都經(jīng)過?？漆t(yī)生確診，臨床檢查局部皮膚沒有炎癥，在檢查前24 h內(nèi)沒有使用皮膚保護(hù)劑，前2 h內(nèi)沒有肥皂或者表面活性劑清洗。

1.2 設(shè)備和方法

多功能皮膚生理儀（MPA5）購于德國Courage Khazaka公司。采用MPA5上TM300探頭測量經(jīng)皮失水。采用膠帶粘貼法破壞皮膚屏障，并測量0 h與5 h的經(jīng)皮失水，并計算其恢復(fù)速度[（0 h經(jīng)皮失水-5 h后經(jīng)皮失水）/0 h經(jīng)皮失水×100%=恢復(fù)率]。

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白癜風(fēng)皮損和正常皮膚滲透屏障功能比較

白癜風(fēng)皮膚基礎(chǔ)經(jīng)皮失水和對側(cè)正常皮膚經(jīng)皮失水：圖1所示，白癜風(fēng)組TEWL為（11.13±1.04）g/（m2·h），對側(cè)正常皮膚組TEWL為（10.38±1.26）g/（m2·h）；兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.017，P>0.05）。

2.2 白癜風(fēng)皮損和正常皮膚滲透屏障功能恢復(fù)能力比較

經(jīng)膠盤（D-squame）破壞皮膚屏障，白癜風(fēng)皮損經(jīng)皮失水的恢復(fù)率和正常對側(cè)皮膚：如圖2所示，白癜風(fēng)經(jīng)皮失水的恢復(fù)速率為（41.29±4.03）%，對側(cè)正常皮膚經(jīng)皮失水的恢復(fù)速率為（59.47±4.23）%，白癜風(fēng)皮損經(jīng)皮失水的恢復(fù)速率明顯地低于正常對側(cè)皮膚 （t=4.532，P<0.02），這個實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白癜風(fēng)皮損滲透屏障功能的穩(wěn)態(tài)動力發(fā)生改變。

實(shí)驗(yàn)二

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者選擇： 5例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者（男4例，女1例），年齡23～35歲，病程1～3年。另選擇5名年齡匹配健康志愿者做對照。

1.2 試劑及儀器

四氧化釕（Ruthenium tetroxide， RuO4），購自美國Polysciences公司（貨號：18253）；二甲胂酸鈉三水化合物（sodium cacodylate trihydrate），購自美國Sigma公司（貨號：20840）

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本準(zhǔn)備 常規(guī)皮膚活檢，皮膚組織標(biāo)本立即用手術(shù)刀修剪（切除皮下組織，標(biāo)本切成截面為1 mm2的小長條）。

1.3.2 板層脂膜的特染方法 標(biāo)本置于2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、0.06%氯化鈣，pH 7.4的固定液中（二甲砷酸鈉緩沖液配制），室溫固定1 h后4℃保存。經(jīng)0.1 mol/L的二甲砷酸鈉緩沖液沖洗后，用0.25%的四氧化釕（ruthenium tetroxide，Ru04）在室溫下暗處中固定45 min，常規(guī)方法脫水、定向包埋。60～80 nm的超薄切片經(jīng)鈾-鉛雙染色后，在HIACHIH-7000FA型電鏡下觀察。

2 結(jié)果

RuO4電子特染結(jié)合透射電鏡技術(shù)比較觀察正常人皮膚和白癜風(fēng)脫色皮損表皮角質(zhì)層板層脂膜超微結(jié)構(gòu)健康志愿者正常皮膚經(jīng)四氧化釕電子特染在角質(zhì)層細(xì)胞間隙可見排列規(guī)整、電子致密帶和電子透明帶重復(fù)交替排列（alternating electron-dense and electron-lucent repeating pattern）的板層結(jié)構(gòu)（圖3）；白癜風(fēng)脫色素皮損角質(zhì)層板層結(jié)構(gòu)斷裂，空泡化，碎片化（圖4）。

圖3 正常皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)（標(biāo)尺=100 nm）

圖4 白癜風(fēng)皮損角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)（標(biāo)尺=100 nm）

四氧化釕電子特染結(jié)合透射電鏡技術(shù)觀察表皮角質(zhì)層板層脂膜超微結(jié)構(gòu)正常皮膚（圖3），角質(zhì)層細(xì)胞間隙可見4～8層排列規(guī)整電子致密帶和透明帶重復(fù)交替排列片層狀脂膜結(jié)構(gòu)（白箭頭示）；白癜風(fēng)皮損（圖4），角質(zhì)層細(xì)胞間隙（白箭頭示）板層脂膜結(jié)構(gòu)斷裂出現(xiàn)空泡，空泡內(nèi)充填有無形電子致密物（紅色星號示）

3 討論

哺乳動物的表皮是一種復(fù)層上皮（stratified epithelium），表皮的主要生理功能是滲透屏障功能（epidermal permeability barrier function），此功能通常是指表皮防止過多的水分進(jìn)出機(jī)體的功能，主要在表皮的最外層角質(zhì)層中進(jìn)行[2]。角質(zhì)層由終末分化角質(zhì)形成細(xì)胞和細(xì)胞外中性脂質(zhì)形成基質(zhì)組成。這些脂質(zhì)來源于表皮顆粒層的板層小體，這些含有板層狀結(jié)構(gòu)的小體，在細(xì)胞分化過程中逐漸遷移至顆粒層的上部，將其內(nèi)含物分泌于角質(zhì)層與顆粒層交界處，經(jīng)過一系列生物化學(xué)和物理變化轉(zhuǎn)化成連續(xù)的多層的板狀膜樣結(jié)構(gòu)，又稱為板層脂膜，分布于角質(zhì)細(xì)胞間隙之中。這種膜狀脂質(zhì)和角質(zhì)層細(xì)胞形成類似一種磚和灰結(jié)構(gòu)，并構(gòu)成滲透屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。endprint

角質(zhì)層滲透屏障功能主要通過測定基礎(chǔ)經(jīng)皮水分丟失（Transepidermal water loss ，TEWL）和表皮滲透屏障功能穩(wěn)態(tài)動力學(xué)改變來衡量，TEWL越高，基礎(chǔ)滲透屏障功能越差。表皮滲透屏障功能穩(wěn)態(tài)動力學(xué)是以經(jīng)皮水分丟失的恢復(fù)率來衡量。主要利用膠帶破壞皮膚屏障功能，然后分別在0 h與數(shù)小時測量經(jīng)皮失水分丟失，并計算其恢復(fù)率，經(jīng)皮水分丟失的恢復(fù)率主要反映的是滲透屏障恢復(fù)的能力。

該實(shí)驗(yàn)通過測量白癜風(fēng)皮損與正常皮膚的基礎(chǔ)TEWL值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損和對側(cè)正常皮膚基礎(chǔ)TEWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；使用膠帶破壞皮膚屏障，分別在0 h和5 h測量兩者的TEWL值，比較兩者滲透屏障的恢復(fù)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.02），表明白癜風(fēng)皮損滲透屏障恢復(fù)能力明顯低于正常皮膚。外國研究人員[3]報導(dǎo)深色皮膚基礎(chǔ)TEWL值低于淺色皮膚；Reed等[4]報導(dǎo)深淺色皮膚基礎(chǔ)TEWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但淺色皮膚角質(zhì)層的緊密性低于深色皮膚?？赡茉蚴窃搶?shí)驗(yàn)比較滲透屏障功能在相同的個體，從而減少種族、環(huán)境、個體的差異。同時，該實(shí)驗(yàn)通過RuO4電子特染色結(jié)合透射電鏡技術(shù)觀察白癜風(fēng)皮損和正常皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間板層脂膜超微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間隙可見4～8層排列規(guī)整電子致密帶和透明帶重復(fù)交替排列片層狀脂膜結(jié)構(gòu)，而白癜風(fēng)脫色皮損角質(zhì)層間板層脂膜發(fā)生了改變，主要表現(xiàn)為脂質(zhì)膜狀結(jié)構(gòu)異常，板層脂膜結(jié)構(gòu)斷裂，出現(xiàn)空泡，空泡內(nèi)充填絮凝狀電子致密或透明物質(zhì)。

雖然白癜風(fēng)滲透屏障結(jié)構(gòu)和功能異常的確切機(jī)制還不清楚，但是目前認(rèn)為可能與黑素密切關(guān)系。黑素合成啟動所需要的黑素小體具有酸性內(nèi)容物，黑素細(xì)胞分泌的黑素小體在表皮中降解可進(jìn)一步酸化已高度酸化的環(huán)境。深膚色的個體表現(xiàn)出比淺膚色者更加酸化的角質(zhì)層（SC，pH4.5～5.0 vs 5.5～6.0），高度酸化的內(nèi)環(huán)境可活化或失活SC內(nèi)某些酶類。首先，角質(zhì)層脂質(zhì)膜狀結(jié)構(gòu)形成過程中，所需的脂類代謝酶最適內(nèi)環(huán)境pH值約為5.5，比如腦糖苷酯酶和酸性磷酸酶等，當(dāng)皮膚pH值升高時，這些酶的活性則降低，影響角質(zhì)層細(xì)胞間的復(fù)層板層膜結(jié)構(gòu)的形成。其次，在中性和堿性條件下，皮膚蛋白激酶的活性增高[5]，后者加速降解與脂類代謝相關(guān)的酶，使其失去活性，間接地影響角質(zhì)層的板層脂膜的形成。國外相關(guān)研究[6]發(fā)現(xiàn)，深膚色的個體表皮顆粒層板層小體的密度高于淺膚色者，深膚色者顆粒層和角質(zhì)層之間有更多的脂質(zhì)，這一結(jié)果表明深膚色有更多的脂質(zhì)產(chǎn)生。另外在白癜風(fēng)皮損由于黑色素缺乏，血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)減少，表皮缺乏血管內(nèi)皮生長因子會延緩滲透屏障的恢復(fù)[7]。因此，白癜風(fēng)皮損細(xì)胞因子的表達(dá)改變可以解釋屏障功能的改變。

該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然白癜風(fēng)角質(zhì)層細(xì)胞間的板層脂膜存在異常，但是基礎(chǔ)TEWL和正常皮膚相似，可能的原因在于白癜風(fēng)皮損角質(zhì)層增厚[8]，通過表皮增生來代償超微結(jié)構(gòu)異常的影響。

綜上所述，白癜風(fēng)色素脫失皮損存在滲透屏障功能的改變，可能原因與皮損黑素缺失而影響板層脂膜合成相關(guān)的酶類有關(guān)，該研究并從超微結(jié)構(gòu)水平上為黑素影響皮膚屏障提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)，同時為白癜風(fēng)患者的日常防護(hù)提供了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-06-03）endprint