馮基高，莫業(yè)和，徐鵬翔，胡德獻，歐陽一彬，張彩彩

(1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570311；2.海南醫(yī)學院生理學教研室，海南 ?？?571199)

·論著·

SNAI2在人腦惡性膠質瘤中的表達情況及其與細胞增殖轉移的關系

馮基高1，莫業(yè)和1，徐鵬翔1，胡德獻1，歐陽一彬1，張彩彩2*

(1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570311；2.海南醫(yī)學院生理學教研室，海南 ?？?571199)

目的觀察鋅指轉錄因子2(zinc-finger transcription factor-2,SNAI2)在人腦膠質瘤中的表達及其對膠質瘤細胞增殖轉移能力的影響。方法收集37例惡性膠質瘤患者的臨床資料及腫瘤組織標本。采用反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測組織中SNAI2的表達水平，分析其表達與患者臨床病理資料間的關系。在體外實驗中，構建穩(wěn)定干擾SNAI2(small interfering RNA SNAI2，shSNAI2)的膠質瘤細胞株，通過噻唑藍比色法檢測細胞增殖能力，劃痕實驗檢測細胞侵襲轉移能力，Western blot檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及緊密連接蛋白(Zo-1)的表達，檢測細胞上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的水平。結果高級別腦膠質瘤中SNAI2的表達顯著高于低級別腦膠質瘤、良性腦膜瘤及正常腦組織，且低級別腦膠質瘤SNAI2的表達顯著高于良性腦膜瘤及正常腦組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Spearman相關分析結果顯示SNAI2的表達與患者性別、年齡及體質量不相關，與患者腫瘤大小及膠質瘤細胞分級呈正相關(P<0.05)。MTS實驗結果示各組細胞隨時間增加增殖能力增強，且shSNAI2細胞系相比對照細胞系增殖能力顯著減弱(P<0.05)。劃痕修復實驗結果示相比對照細胞系轉移能力明顯減弱(P<0.05)。Western blot結果顯示shSNAI2細胞系E-cadherin及Zo-1表達增高，Vimentin表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論SNAI2在人腦膠質瘤中高表達，且與患者腫瘤的大小和分級密切相關，其能夠促進膠質瘤細胞的增殖、轉移及EMT過程的發(fā)生，是潛在的促癌基因。

神經(jīng)膠質瘤；鋅指轉錄因子2;細胞增殖

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.006

腦膠質瘤起源于腦的膠質細胞，是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，約占腦腫瘤的35.26%～60.96%[1]，按惡性程度分類可將膠質瘤分為低級別膠質瘤和高級別膠質瘤，其中高級別膠質瘤又占膠質瘤的絕大多數(shù)，其惡性程度高，浸潤性強，且易復發(fā)，患者5年生存率在5%以下[2]。因此，明確腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展機制是臨床和基礎研究面臨的重要問題。近年來許多研究顯示，鋅指轉錄因子2(zinc-finger transcription factor-2, SNAI2)在乳腺癌、非小細胞肺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中表達異常，且在其中參與調控多種信號通路，影響腫瘤細胞的生長及轉移[3-6]。本研究擬探討SNAI2在人腦膠質瘤中的表達及其與患者臨床資料的關系，明確其對腦膠質瘤細胞生物學效應的影響，旨在為揭示腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展的確切機制提供線索，并為臨床診治提供新的依據(jù)。

1 資 料 與 方 法

1.1 一般資料 選擇2014年3月—2016年9月海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院收治的惡性膠質瘤患者37例，收集患者的臨床資料及手術切除標本，其中男性21例，女性16例；年齡13～64歲，平均(34.1±15.6)歲；體質量36～74 kg，平均(53.4±17.3) kg；瘤體≥6 cm 17例，<6 cm 20例；膠質瘤Ⅰ級和Ⅱ級12例，Ⅲ級和Ⅳ級25例?；颊呔鶠槌醢l(fā)腦膠質瘤，手術切除膠質瘤病理標本，取材后液氮保存。同時取同期良性腦膜瘤25例及因腦外傷行手術治療的正常腦組織21例，同樣取材后液氮保存。

1.2 細胞來源 研究所用的膠質瘤細胞系均來自美國模式菌種收集中心(The Global Bioresource Center，ATCC)，包括U87、U251、U118、U138、U373、T98G、SHG44細胞系。

1.3 實驗儀器 Bio-Rad超凈工作臺、NanoDrop2000超微量分光光度計，Eppendorf PCR儀，ABI 7500 Real-time PCR儀，Bio-Rad電泳儀，轉膜儀，凝膠成像儀，酶標儀等。

1.4 實驗試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，F(xiàn)etal Bovine Serum(Hyclone)，RNAiso Plus(TAKARA公司，Code No.: 9108)，逆轉錄試劑盒(Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit,Fermentas)，定量PCR試劑盒(iQ SYBR Green Supermix,BioRad)，細胞增殖能力檢測試劑盒(MTS,Promega)，Lipofectamine(Thermo Fisher Scientific公司2000CAT.NO.11668-027)，BCA Assay Reagent(美國Pierce Chemical公司)，PVDF膜(Millpore公司，Cat NO.IPVH00010)，甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，10014118)等?？贵w包括SNAI2 antibody(abcam,ab27568)，E-cadherin antibody(abcam,ab15148)，Zo-1 antibody(abcam,ab59720)，Vimentinantibody(abcam,ab92547)，β-actin antibody(santa cruz,sc-4778)。

1.5 實驗方法

1.5.1 反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測組織及細胞中SNAI2的表達水平 組織RNA的收集：從液氮中取出組織，剪碎后取20～30 mg置于1.5 mL離心管中，加入1 mL RNAiso Plus，嚴格按說明書步驟進行操作，30 μL無核酶水稀釋。細胞RNA的收集：收集培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中的對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后1 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，并轉移至1.5 mL離心管中，室溫500 g，5 min離心，棄上清，滅菌PBS沖洗2次，棄PBS，每管加入1mL RNAiso Plus，嚴格按說明書步驟進行操作，30 μL無核酶水稀釋，分光光度計檢測RNA濃度后取5 μg RNA行逆轉錄反應，RT-PCR檢測SNAI2 mRNA表達水平。反應條件：預變性94 ℃ 4 min，擴增條件94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。SNAI2上游引物：CTCCATCTGACACCTCC-TCC；下游引物：TTTCTAGACTGGGCATCGCA；目的片段大小為201 bp。內參基因Actin上游引物序列為TGGCACCCAGCACAATGAA；下游引物序列為CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；目的片段大小為186 bp。

1.5.2 慢病毒穩(wěn)定干擾U251細胞系SNAI2的表達 第1天在6孔板中接種1×106的293T細胞，第2天細胞融合度達80%左右，取1.5 mL無菌離心管，加入1.5 μg包裝質粒及0.5 μg目的質粒于500 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，脂質體與質粒3∶1混合后20 mins，緩慢滴入無血清培養(yǎng)的293T細胞中，7 h后更換含血清的培養(yǎng)基，與之后的24 h及48 h各收集1次病毒懸液，并加以過濾處理。收集的病毒懸液以2∶1的比例與含血清培養(yǎng)基混合，感染待干擾的細胞系，加入陽離子復合物polybrene 3 μL，感染3 d后，使用嘌呤霉素進行篩選(1 μg/mL)，直至細胞生長狀態(tài)良好。干擾序列包括隨機插入對照序列GV248：GCTGTTTTTTGAGATT-TCAG；sh SNAI2#1：TTCACAGCTGTCCCAGA-GGG；sh SNAI2#2：GCTGTTTTTTGAGATTT-CAG；sh SNAI2#3：GTTGTCAGACTAAATTA-TTC；sh SNAI2#4：GGATCTTTCTTGCAAAA-GAG。

1.5.3 MTS檢測細胞增殖活力 96孔板中每孔接種1 000個待檢測的細胞，并設置5個平行孔，以細胞貼壁后為0 h時間點，分別檢測細胞0 h、24 h、48 h及72 h的細胞增殖能力，具體操作為：MTS液與培基以1∶5的比例混合均勻，混勻后于生化培養(yǎng)箱中避光孵育60 min，多孔板酶標儀在490 nm檢測吸光度，根據(jù)吸光度的大小判斷細胞的增殖能力。

1.5.4 劃痕修復實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)生長的細胞，6×105每孔接種至6孔板，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)細胞至長滿，棄去培養(yǎng)基，加入PBS 2 mL，100 μL移液槍頭垂直水平面進行劃痕，每孔3～5條，PBS清洗2次后加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，于24 h進行拍照。

1.5.5 Western blot檢測細胞蛋白表達水平 收集待檢測的對數(shù)生長期細胞，10 cm培養(yǎng)皿細胞融合度達80%左右，胰酶消化后1 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，移至1.5 mL離心管中，室溫500 g，5 min離心處理，PBS洗2次后，300 μL IP裂解液及蛋白酶抑制劑加入細胞沉淀中，混勻后冰上裂解1.5 h，BCA 法行對蛋白定量分析，保證每孔上樣量為100 μg總蛋白，配制10%丙烯酰胺膠，80 V穩(wěn)壓跑膠30 min，120 V穩(wěn)壓跑膠1 h，濕轉至 PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗 4℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1.5 h，發(fā)光液曝光顯影。一抗?jié)舛缺葹?∶1 000，二抗?jié)舛缺葹?∶3 000，以β-actin作為內參。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗、SNK-q檢驗和重復測量的方差分析；相關性采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SNAI2的表達水平 低級別膠質瘤、良性腦膜瘤、正常組織的相對表達量低于高級別膠質瘤，良性腦膜瘤、正常組織低于低級別膠質瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；良性腦膜瘤與正常組織差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別例數(shù)相對表達量高級別膠質瘤250．232±0．045低級別膠質瘤120．175±0．037?良性腦膜瘤 250．121±0．033?#正常組織 210．104±0．041?#F50．319P0．000

*P<0.05與高級別膠質瘤比較 #P<0.05與低級別膠質瘤比較(SNK-q檢驗)

2.2 SNAI2的表達水平與患者臨床資料間的相關性分析 Spearman相關分析結果顯示，SNAI2的表達與患者性別、年齡及體質量均不相關(rs=0.154、0.276、0.183，P>0.05)，與患者瘤體大小及膠質瘤分級呈正相關(rs=0.644、0.681，P<0.05)。

2.3 各膠質瘤細胞系SNAI2的表達水平 Western blot檢測U87、U251、U118、U138、U373、T98G、SHG44細胞系中SNAI2蛋白的表達情況，結果顯示U251表達較其他細胞系高，故選取U251構建干擾SNAI2細胞系(shSNAI2)，見圖1，表2。

圖1SNAI2在膠質瘤細胞系中蛋白水平的表達情況
Figure1TheproteinexpressionlevelofSNAI2inthegliomacellline

組別相對表達量U87 0．335±0．012U251 0．627±0．018?U118 0．554±0．021?#U138 0．075±0．007?#△U373 0．152±0．011?#△☆T98G 0．101±0．005?#△☆▲SHG440．180±0．011?#△☆▲★F576．327P0．000

*P<0.05與U87比較 #P<0.05與U251比較 △P<0.05與U118比較 ☆P<0.05與U138比較 ▲P<0.05與U373比較 ★P<0.05與T98G比較(SNK-q檢驗)

2.4 驗證U251中構建的穩(wěn)定干擾SNAI2的細胞系 從蛋白及mRNA2個水平進行驗證，Western blot結果顯示shSNAI2#1及shSNAI2#3干擾效率較高，且相對于對照組下降顯著，RT-PCR的結果與Western blot結果一致，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2驗證穩(wěn)定干擾U251細胞系SNAI2蛋白表達的情況
Figure2TheverificationoftheproteinexpressionlevelofSNAI2inthestableinterferenceU251

組別相對表達量GV248 0．801±0．049shSNAI21#0．127±0．016?shSNAI22#0．289±0．033?#shSNAI23#0．104±0．031?#△shSNAI24#0．385±0．045?#△☆F158．139P0．000

*P<0.05與GV248比較 #P<0.05與shSNAI2 1#比較 △P<0.05與shSNAI2 2#比較 ☆P<0.05與shSNAI2 3#比較(SNK-q檢驗)

2.5 檢測U251 shSNAI2細胞系增殖能力的變化 MTS結果顯示不同時間點細胞增殖能力差異顯著，呈逐漸上升的趨勢(P<0.05)；不同組別細胞增殖能力差異顯著，GV248顯著高于shSNAI2 1#及shSNAI2 3#細胞(P<0.05)，且時點間、組間·時點間交互作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

組別0h24h48h96hGV248 1．00±0．402．29±0．996．83±1．0414．71±2．50shSNAI21# 1．00±0．371．36±0．522．52±1．026．18±1．79shSNAI23# 1．00±0．251．08±0．373．14±0．407．43±1．92組間 F=27．468 P=0．000時點間 F=36．225 P=0．000組間·時點間F=66．571 P=0．000

2.6 檢測U251 shSNAI2細胞系遷移能力的變化 劃痕修復實驗結果顯示U251 shSNAI2細胞系與對照組細胞U251 GV248相比，劃痕修復能力在24 h出現(xiàn)明顯差異，U251 shSNAI2細胞系修復能力顯著低于對照細胞，見圖3。

2.7 檢測U251 shSNAI2細胞系上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關分子表達水平的變化 與EMT相關的分子包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及緊密連接蛋白(Zo-1)，其表達水平可用來評估腫瘤細胞侵襲轉移能力。細胞劃痕修復實驗結果提示干擾SNAI2的表達能夠抑制U251的遷移能力，故檢測U251 shSNAI2細胞系EMT相關分子表達變化。結果顯示下調shSNAI2，E-cadherin、Zo-1的表達顯著升高，Vimentin表達降低。見圖4，表5。

圖3U251shSNAI2細胞系遷移能力變化的情況
Figure3ThechangesofthemigrationofshU251cellline

圖4U251shSNAI2細胞系EMT相關分子表達情況
Figure4ThesituationoftheproteinEMTrelatedexpressionlevelofshU251cellline

組別E?cadherinVimentinZo?1GV248 0．263±0．0430．701±0．0820．219±0．026shSNAI21#0．914±0．087?0．285±0．051?0．584±0．043?shSNAI23#0．628±0．060?0．247±0．400?0．462±0．037?F74．81656．49738．965P0．0000．0000．000

*P<0.05與GV248比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

SNAI2位于染色體8q11.21上，是鋅指轉錄因子SNAI家族的成員之一，其在正常機體內廣泛表達，尤其在外周血白細胞、肝和腦組織中高表達。近年來許多研究顯示其表達異常與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展存在緊密聯(lián)系：Atmaca等[7]在其臨床研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織高表達SNAI2的非小細胞肺癌患者生存期明顯短于低表達SNAI2的患者；Merino等[8]在其研究中指出SNAI2可通過調節(jié)促凋亡因子Bim的表達調控細胞的存活，在乳腺癌轉移中發(fā)揮重要作用；Findlay等[9]的體外研究顯示SNAI2在結直腸癌細胞系中促進其EMT過程的發(fā)生，且參與結直腸癌細胞的化療藥物抵抗；Xie等[10]的研究發(fā)現(xiàn)SNAI2可通過抑制E-cadherin的表達促進前列腺癌的發(fā)生；Ganesan等[11]的研究顯示SNAI2可通過調節(jié)磷脂酶D的表達促進惡性細胞的侵襲轉移；Little等[12]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)干擾SNAI2后可導致細胞形態(tài)發(fā)生變化，并使細胞增殖、侵襲及轉移能力減弱；Hu等[13]的研究發(fā)現(xiàn)SNAI2在非小細胞肺癌的化療抵抗的發(fā)生中發(fā)揮促進作用。以此為依據(jù)，本研究探討SNAI2在腦膠質瘤中的表達及其對腫瘤細胞生物學效應的影響。

本研究采用RT-PCR技術檢測臨床樣本中SNAI2 mRNA的表達水平，結果顯示人腦膠質瘤組織中SNAI2的表達顯著高于良性腦膜瘤組織及正常組織，提示SNAI2可能在腦膠質瘤中發(fā)揮著一定的促癌作用；在體外實驗中進一步通過構建穩(wěn)定干擾SNAI2的U251細胞系，并對其增殖、轉移能力進行檢測，MTS結果顯示在U251細胞中干擾SNAI2的表達后，細胞增殖能力顯著降低，表明SNAI2在人腦膠質瘤中發(fā)揮促進增殖的作用；劃痕修復實驗結果顯示干擾SNAI2的表達后，細胞遷移能力顯著減弱，表明SNAI2對腦膠質瘤的轉移發(fā)揮著促進作用。EMT是由上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在癌細胞轉移的過程中發(fā)揮著重要的作用[14]，其中E-cadherin、Zo-1和Vimentin是關鍵的代表性分子。E-cadherin是一種上皮細胞表達的重要的黏附分子，細胞惡性轉化的過程中往往伴隨著E-cadherin的表達下調[15]；Zo-1參與細胞緊密連接的構成，細胞惡變的過程中其表達降低，導致細胞間連接松散，進而促進腫瘤細胞的侵襲轉移[16]；Vimentin是構成細胞骨架的重要成分，在細胞移行、黏附中起關鍵作用，其在惡性腫瘤中表達增強且與細胞侵襲轉移呈正相關[17]。本研究在干擾SNAI2的表達后，U251細胞E-cadherin及Zo-1表達上調，Vimentin表達下調，表明SNAI2在膠質瘤細胞中參與促進EMT過程的發(fā)生。

綜上所述，可以確認SNAI2在人膠質瘤細胞中的促癌作用。在下一步研究中，將進行體內實驗以驗證SNAI2對腦膠質瘤的促進作用，并探討其可能的相互作用分子，闡明SNAI2在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的具體機制，確定其可能的靶標分子，以便為腦膠質瘤的臨床診治及基礎研究提供新的依據(jù)。

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ExpressionofSNAI2inhumanmalignantgliomaanditsrelationshipwithcellproliferationandmetastasis

FENG Ji-gao1，MO Ye-he1，XU Peng-xiang1, HU De-xian1，OU YANG Yi-Bin1，ZHANG Cai-cai2*

(1.DepartmentofNeurosurgery，theSecondAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570311，China； 2.DepartmentofPhysiologyTeachingandResearchSection，HainanMedicalCollege,Haikou571199,China)

ObjectiveTo investigate the mRNA expression level of zinc-finger transcription factor-2(SNAI2) gene in clinical tissues, and to identify the effect of SNAI2 on the proliferation and invasion of glioma cancer cells U251.MethodsA total of 37 cases of patients with malignant glioma was selected in our hospital. Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the mRNA level of SNAI2 in tissues and to analyze the relationship between the expression and the clinical pathological data.In vitro, we set up a stable SNAI2 interference(shSNAI2) of glioma cells. The ability of cell proliferation was detected by MTT colorimetric assay(MTS). The ability of cell invasion and metastasis was detected by scratch assay, Western blot was used to detect the expression of E-cadherin, vimentin and Zo-1, related with epithelial mesenchymal transition(EMT).ResultsThe expression of SNAI2 in high-grade gliomas was significantly higher than that in low grade gliomas, benign meningiomas and normal brain tissue, and the expression of SNAI2 in low grade gliomas was significantly higher than that in benign meningiomas and normal brain tissue, and the difference was statistically significant(P<0.05). Spearman correlation analysis was used to compare the relationship between the expression of SNAI2 and the clinical pathological data of patients, and the results show that the expression of SNAI2 and the patient's gender, age and body weight were not statistically related. There was a positive correlation between tumor size and tumor size and tumor grade(P<0.05). The results of MTS experiment showed that the proliferation ability of cells in each group increased with time, and the proliferation ability of shSNAI2 cell line was significantly lower than that of control cell line(P<0.05). The results of scratch repair showed that the ability of cell migration of shSNAI2 cell line was significantly less than that of control cell line. The results of Western blot showed that the expression of E-cadherin and Zo-1 in shSNAI2 cell line was increased, and the expression of Vimentin was decreased(P<0.05), and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionSNAI2 is highly expressed in human brain gliomas, and is closely related to the size and grade of tumor. It can promote the proliferation and metastasis of glioma cells and the occurrence of EMT.

glioma； zinc finger transcription factor 2； cell proliferation

2016-12-26；

2017-03-05

馮基高(1982-)，男，海南萬寧人，海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事神經(jīng)外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:34436100@qq.com

R730.264

A

1007-3205(2017)11-1265-06

(本文編輯：劉斯靜)