常躍興 郭愛靈 陳鐸葆 鄧云 張榮波 姚斯琪

摘要：目的 建立葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量測定方法，比較室溫超聲法、超聲加熱法和加熱回流法等樣品處理方法對(duì)葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量測定結(jié)果的影響。方法 總黃酮含量測定采用紫外分光光度法，在波長250 nm處測定吸光度；葛根素含量測定采用HPLC，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75），檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min。結(jié)果 室溫超聲法、加熱回流法和超聲加熱法葛根中總黃酮含量分別為15.09%、14.48%、12.71%（n=3），葛根素含量分別為4.37%、4.09%、3.80%（n=3）；粉葛中總黃酮含量分別為2.09%、2.23%、2.17%（n=3），葛根素含量分別為0.50%、0.53%、0.52%（n=3）。結(jié)論 室溫超聲法、超聲加熱法可替代加熱回流法分別用于葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量測定時(shí)供試液制備；皖南野生葛根和粉葛中葛根素含量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：供試液制備；葛根；粉葛；總黃酮；葛根素；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.019

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）11-0078-04

Effects of Different Sample Preparation Methods on Total Flavonoids and Puerarin Content from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix in South Anhui Province CHANG Yue-xing， GUO Ai-ling， CHEN Duo-bao， DENG Yun， ZHANG Rong-bo， YAO Si-qi （Pharmacy Department of Medical College， Anhui University of Science and Technology， Huainan 232001， China）

Abstract： Objective To establish UV spectrophotometry and HPLC methods for content determinations of total flavonoids and puerarin from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix； To compare the ultrasonic method at room temperature， conventional refluxing method and ultrasonic method at heating conditions at the aspect of content determinations. Methods The content determinations of total flavonoids was determined by UV spectrophotometry at 250 nm； the content of puerarin was determined by HPLC with octadecylsilane-bonded silica gel as the stationary phase， a mixture of methanol and water （25：75） as the mobile phase， 256 nm as the detection wavelength， 1.0 mL/min as the flow rate. Results Contents of total flavonoids in Puerariae Lobatae Radix by ultrasonic method at room temperature， conventional refluxing method and ultrasonic method were15.09%， 14.48%， and 12.71% （n=3）， respectively. The contents of puerarin were 4.37%， 4.09%， and 3.80% （n=3）， respectively. Contents of total flavonoids in Puerariae Thomsonii Radix were 2.09%， 2.23%， and 2.17% （n=3）， respectively. The contents of puerarin were 0.50%， 0.53%， and 0.52% （n=3）， respectively. Conclusion Ultrasonic method at room temperature can replace conventional refluxing method for content determinations of total flavonoids and puerarin from Puerariae Lobatae Radix， and ultrasonic method at heating conditions also can replace conventional refluxing method for content determinations of total flavonoids puerarin from Puerariae Thomsonii Radix. Puerarin contents from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix in South Anhui Province are all in line with the Pharmacopoeia standards.

Key words： sample preparation； Puerariae Lobatae Radix； Puerariae Thomsonii Radix； total flavonoids； puerarin； content determination

基金項(xiàng)目：2015年安徽理工大學(xué)引進(jìn)人才基金項(xiàng)目（11079）；安徽理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610361317）

葛屬植物資源分布較廣且蘊(yùn)含量較大的是野葛和甘葛藤[1]，二者自2005年版《中華人民共和國藥典》開始分別以葛根和粉葛分開收載。二者所含異黃酮類成分是其主要有效成分[2]，而葛根素是其最主要的活性成分[3]。歷版藥典亦以葛根素含量作為質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)代研究表明，不同產(chǎn)地野生葛根和粉葛所含黃酮類成分和葛根素含量均有較大差異[4]，甚至產(chǎn)地為山西運(yùn)城、大同和晉城的野葛所含葛根素含量最大者為4.48%，最小者僅為1.46%[5]。本研究采集安徽蕪湖野葛和甘葛藤，建立其總黃酮和葛根素含量測定方法，比較室溫超聲法、超聲加熱法和加熱回流法等樣品處理方法對(duì)其總黃酮和葛根素含量測定的影響。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）；Diamonsil Plus C 18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m，迪馬公司）；KQ-100 DE型超聲波清洗器（工作頻率為40 kHz，試驗(yàn)過程中超聲功率均為100 W，昆山超聲儀器有限公司）；MS105DU型十萬分之一天平（梅特勒托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；BSM220.4型分析天平（上海精卓電子科技有限公司）；DE-100 G型多功能小型粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）。

葛根和粉葛，采自安徽省蕪湖市蕪湖縣境內(nèi)山坡，趁鮮切成厚片或小塊，干燥備用，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定，分別為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi和甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根；葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-201514，供含量測定用），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），美國Merk公司；水（超純水）；無水乙醇（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測定總黃酮含量

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品16.7 mg，置于200 mL容量瓶中，加入30%乙醇適量，超聲助溶，定容至刻度，搖勻，即得濃度為83.5 ?g/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取適量備用葛根或粉葛厚片，采用粉碎機(jī)將其粉碎成全部過3號(hào)篩的細(xì)粉。 分別精密稱取葛根0.1 g和粉葛0.8 g置于不同具塞錐形瓶中，各用50 mL移液管精密加入30%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲、加熱回流或超聲加熱（75 ℃±5 ℃）30 min，取出，放涼至室溫，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，得供試品溶液Ⅰ，備用。取200 ?L供試品溶液Ⅰ，置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液Ⅱ。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品溶液500、700、900、1100、1300 ?L，分別置于10 mL容量瓶中，30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得系列不同濃度的葛根素對(duì)照品溶液，以30%乙醇為空白對(duì)照，于波長250 nm處測定吸光度。以葛根素濃度C（?g/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程A=0.065C+0.002，r=0.999。結(jié)果表明葛根素對(duì)照品在4.175～10.855 ?g/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品溶液500、900、1300 ?L，分別置于10 mL容量瓶中，以30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得低、中、高濃度的葛根素對(duì)照品溶液，以30%乙醇為空白對(duì)照，于波長250 nm處測定吸光度，重復(fù)測定6次，得低、中、高濃度葛根素對(duì)照品溶液吸光度的RSD分別為0.43%、0.31%、0.80%。結(jié)果表明，紫外分光光度法測定葛根素吸光度精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批葛根或粉葛供試品溶液Ⅱ，分別于0、2、4、8、16、24 h在波長250 nm處測定吸光度，結(jié)果葛根或粉葛供試品溶液Ⅱ吸光度的RSD分別為1.76%、1.34%，表明葛根或粉葛供試品溶液Ⅱ在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批次6份葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別采用室溫超聲法和超聲加熱法制備供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ，取供試品溶液Ⅱ在250 nm波長處分別測定吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算葛根中總黃酮平均含量為15.10%，RSD=2.47%；粉葛中總黃酮平均含量為2.18%，RSD=2.34%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知總黃酮含量的葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各3份，分別置于100 mL錐形瓶中，各精密加入一定濃度的葛根素對(duì)照品溶液50 mL，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法采用室溫超聲法和超聲加熱法制備供試品溶液Ⅱ，于250 nm波長處測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1?？梢?，葛根和粉葛中總黃酮含量測定準(zhǔn)確度符合測定要求，該方法可用于本試驗(yàn)。

2.1.8 樣品含量測定 分別精密稱定葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各9份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下室溫超聲、加熱回流或超聲加熱法制備供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ，取供試品溶液Ⅱ分別于250 nm波長處測定吸光度，并計(jì)算葛根和粉葛中總黃酮含量，結(jié)果見表2。

2.1.9 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS19.0軟件對(duì)“2.1.8”項(xiàng)下數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩均數(shù)比較。結(jié)果在葛根的總黃酮含量測定中，室溫超聲法與加熱回流法無顯著差異（P>0.05），而二者均與超聲加熱法有顯著差異（P<0.05）；在粉葛的總黃酮含量測定中，加熱回流法與超聲加熱法無顯著差異（P>0.05），而二者均與室溫超聲法有顯著差異（P<0.05）。

2.2 HPLC測定葛根素含量

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75），檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫。色譜圖見圖1。按葛根素峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于4000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 采用“2.1.1”項(xiàng)下濃度為83.5 ?g/mL的葛根素對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 采用“2.1.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液Ⅰ。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱定12.0 mg葛根素對(duì)照品，置于50 mL容量瓶，加30%乙醇適量，超聲助溶，繼續(xù)加30%乙醇至刻度，振搖混勻，作為葛根素含量測定線性及其范圍的母液。分別精密量取上述母液5、2、1 mL和500 ?L，分別置于10 mL容量瓶，加30%乙醇至刻度，振搖混勻，連同母液一起作為葛根素含量測定線性及其范圍的系列濃度溶液。分別精密吸取上述溶液各20 ?L注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，記錄葛根素峰面積值。以葛根素濃度為橫坐標(biāo)，葛根素峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果葛根素濃度在12～240 ?g/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=47.16X+5.322（r=0.999），滿足葛根素含量測定要求。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取濃度為12、48、240 ?g/mL的葛根素對(duì)照品溶液20 ?L，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果3個(gè)濃度對(duì)應(yīng)峰面積RSD分別為0.84%、0.97%、1.41%，表明該儀器測定葛根素含量精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批葛根或粉葛供試品溶液Ⅰ，于制備后分別放置0、6、12、18、24、30 h，精密吸取20 ?L，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算葛根素峰面積RSD分別為3.78%、4.04%，表明葛根和粉葛供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.6”項(xiàng)下制備的供試品溶液Ⅰ，進(jìn)樣20 ?L，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。葛根中葛根素平均含量為4.38%，RSD=2.13%；粉葛中葛根素平均含量為0.52%，RSD=1.47%。結(jié)果表明葛根和粉葛供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.1.8”項(xiàng)下制備的供試品溶液Ⅰ，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。表明葛根和粉葛中葛根素含量測定準(zhǔn)確度符合測定要求，該含量測定方法可用于本試驗(yàn)。

2.2.9 樣品含量測定 分別精密稱定葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各9份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下室溫超聲、加熱回流或超聲加熱法制備供試品溶液Ⅰ，在上述色譜條件下，分別精密吸取上述葛根素對(duì)照品溶液與各供試品溶液20 ?L，進(jìn)樣測定峰面積積分值，計(jì)算葛根素含量，結(jié)果見表4。

2.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS19.0軟件對(duì)“2.2.9”項(xiàng)下數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩均數(shù)比較。結(jié)果在葛根的葛根素含量測定中，室溫超聲法、加熱回流法、超聲加熱法三者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在粉葛的葛根素含量測定中，加熱回流法與超聲加熱法無顯著差異（P>0.05），而二者均與室溫超聲法有顯著差異（P<0.05）。

3 討論

葛根素含量測定結(jié)果表明，本試驗(yàn)所采葛根和粉葛均符合2015年版《中華人民共和國藥典》葛根中葛根素含量不得低于2.4%和粉葛中葛根素含量不得低于0.3%的要求，因此皖南野生葛根和粉葛均達(dá)到藥用要求，可對(duì)其藥用資源進(jìn)行可持續(xù)性開發(fā)。

本研究葛根中總黃酮含量達(dá)15.08%，與文獻(xiàn)報(bào)道的葛根中總黃酮含量6.20%～15.87%[1]，以及山西葛根含量為12.53%[6]相差不大；而粉葛總黃酮含量2.17%，亦在文獻(xiàn)報(bào)道的含量0.24%～3.67%范圍內(nèi)。

綜合權(quán)衡“2.1.9”和“2.2.10”項(xiàng)下結(jié)果，葛根總黃酮和葛根素含量測定中供試品制備方法提示以室溫超聲提取法替代加熱回流提取法，不僅含量較高，而且節(jié)約能源，操作簡單；粉葛總黃酮和葛根素含量測定中，綜合考慮節(jié)約能源和操作簡單等因素，可用超聲加熱提取法替代加熱回流提取法。葛根和粉葛總黃酮和葛根素含量測定結(jié)果變化趨勢基本一致，僅在室溫超聲與加熱回流制備供試品溶液方法方面不一致，可能是由于總黃酮含量與葛根素含量差異較大引起的。

本研究中的總黃酮含量測定用葛根和粉葛供試品溶液制備是在葛根素含量測定用葛根和粉葛供試品溶液基礎(chǔ)上進(jìn)行了稀釋，避免了供試品溶液制備的重復(fù)，節(jié)約了制備時(shí)間；同時(shí)采用超聲法處理樣品比用加熱回流法簡單，亦節(jié)約了時(shí)間。因此，本試驗(yàn)所采用的葛根和粉葛中總黃酮和葛根素供試品溶液制備方法較為簡單，可為含葛根或粉葛制劑或復(fù)方中總黃酮和葛根素的含量測定提供借鑒。

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