彭敏 石美琴 童曉東 楊水英 許彥

摘要：目的 測定康咳靈合劑中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量。方法 采用HPLC，色譜柱為Poroshell 120 Ec-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 ?m），以乙腈（A）-水（B）作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為210 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃。 結(jié)果 重樓皂苷Ⅰ在1.009～10.09 ?g（r=0.999 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為97.31%（RSD=2.05%，n=6）；重樓皂苷Ⅱ在0.640 5～6.405 ?g（r=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為96.41%（RSD=1.67%，n=6）。結(jié)論 本方法簡便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于測定康咳靈合劑中重樓皂苷的含量。

關(guān)鍵詞：康咳靈合劑；高效液相色譜法；重樓皂苷Ⅰ；重樓皂苷Ⅱ

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.018

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）11-0075-03

Content Determination of Polyphyllin Ⅰ and Ⅱ in Kangkeling Mixture by HPLC PENG Min， SHI Mei-qin， TONG Xiao-dong， YANG Shui-ying， XU Yan （Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nantong 226001， China）

Abstract： Objective To establish a method for determining the contents of polyphyllin Ⅰ and polyphyllin Ⅱ in Kangkeling Mixture. Methods The contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were determined by HPLC gradient elution. Poroshell 120 Ec-C18 column （4.6 mm × 150 mm， 4 ?m） was used； Acetonitrile-water （A∶B） was set as the mobile phase； the flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was 210 nm； column temperature was 30 ℃. Results Polyphyllin Ⅰ showed good linear relationship in the range of 1.009–10.09 ?g （r=0.999 6）， and the average recovery was 97.31% （RSD=2.05%， n=6）. Polyphyllin Ⅱ showed good linear relationship in the range of 0.640 5– 6.405 ?g （r=0.999 8）， and the average recovery was 96.41% （RSD=1.67%， n=6）. Conclusion The method is simple， with good repeatability and accurate results， which can be used to determine the contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ in Kangkeling Mixture.

Key words： Kangkeling Mixture； HPLC； polyphyllin Ⅰ； polyphyllin Ⅱ

咳靈合劑是依據(jù)本院臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成的院內(nèi)制劑，由矮地茶、重樓、百部、南沙參、炙枇杷葉、天冬、甘草等組成，具有潤肺祛痰、止咳平喘的功效，善于治療熱、痰火型咳嗽。重樓是康咳靈合劑的主要組成之一，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚功效?，F(xiàn)代研究表明，甾體皂苷是重樓的主要活性成分，也是重樓藥材質(zhì)量控制的重要標(biāo)準(zhǔn)[1]。因此，本研究建立重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量測定方法，作為控制康咳靈合劑質(zhì)量的方法之一。

1 儀器與試藥

DIONEX-UltiMate 3000高效液相色譜儀，紫外檢測器（賽默飛世爾科技有限公司）；JP-040S型超聲波

基金項(xiàng)目：南通市衛(wèi)生和計劃生育委員會科技項(xiàng)目（WQ2015065）

通訊作者：童曉東，E-mail：924822769@qq.com

清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；ME104/02電子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；EPED-S2- 30DH型超純水器（南京普益達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

重樓皂苷Ⅰ對照品（批號111590-201103）、重樓皂苷Ⅱ（批號111591-201103）對照品，中國食品藥品檢定研究院；康咳靈合劑為本院自制（批號分別為160113、160314、160321）；乙腈為色譜純，水為自制超純水，甲醇、正丁醇、丙酮為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Poroshell 120 Ec-C18（4.6 mm×150 mm，4 ?m）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，38%A；30～50 min，38%～45%A；50～75 min，45%～55%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 ?L；柱溫：30 ℃。在此條件下，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的出峰時間分別為44.91、49.93 min，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.50，陰性對照在與重樓皂苷對照品相同的保留時間處無色譜峰干擾。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

取重樓皂苷Ⅰ對照品2.018 0 mg、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌?.281 1 mg，精密稱定，加甲醇溶解，定容至10 mL，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品20 mL，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用丙酮洗滌2次，每次10 mL，棄去丙酮液，殘渣蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL。

2.4 陰性對照溶液的制備

依處方組成，制成缺重樓的康咳靈合劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ?qū)φ掌啡芤?、10、20、30、40、50 ?L，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。重樓皂苷Ⅰ：Y=1.432 5X+0.106 4，線性范圍為1.009～10.09 ?g，r=0.999 6。重樓皂苷Ⅱ：Y=1.589 2X-0.000 7，線性范圍為0.640 5～6.405 ?g，r=0.999 8。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ?qū)φ掌啡芤?0 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面積的RSD分別為1.29%、1.57%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號（160314）的樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積，計算得樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的平均含量分別為0.185 5、0.094 7 mg/mL，RSD分別為2.10%、2.43%，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16 h進(jìn)樣，測定峰面積，計算得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面積RSD分別為1.68%、2.12%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量（批號160314）的樣品6份，每份10 mL，分別精密加入重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ混合對照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制成加樣回收供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.6 樣品含量測定

取3批樣品（批號160113、160314、160321），每批取2份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積，并計算重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

本試驗(yàn)采用水飽和的正丁醇作為萃取溶劑，并考察了萃取溶劑倍量對重樓皂苷含量測定的影響。經(jīng)4倍量溶劑萃取后，重樓皂苷得率達(dá)到最大，繼續(xù)增大溶劑量對重樓皂苷得率并無顯著影響。綜合考慮，選擇萃取溶劑的量為樣品取樣體積的4倍，分4次萃取。

重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ?qū)儆阽摅w皂苷，難溶于丙酮[2]，因此選擇丙酮作為洗滌溶劑，除去正丁醇提取物中的雜質(zhì)。此外，本試驗(yàn)還考察了丙酮作為沉淀試劑提取正丁醇提取物水溶液中的重樓皂苷的方法。由于本品重樓皂苷含量較低，沉淀物的析出量較少，分離后對重樓皂苷含量測定影響較大。因此，選擇丙酮洗滌法作為除雜方法。

在探索色譜條件的過程中，本試驗(yàn)參考了《中華人民共和國藥典》中重樓藥材含量測定方法[3]，選擇了乙腈-水梯度洗脫的步驟，結(jié)果基線漂移嚴(yán)重，目標(biāo)成分分離不理想。因此，結(jié)合有關(guān)報道[4-5]，參照乙腈-水（42∶58）[6]的比例，降低初始流動相的極性，減慢流動相的梯度速度后，分離度較好，目標(biāo)峰與雜質(zhì)分離清晰，保留時間適中。

參考文獻(xiàn)：

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