許光遠 孫文 宋紫臨 郭璇 吳麗麗 秦靈靈 侯丹 張茁 田碩 李響 劉銅華

摘要：目的 觀察和于泰輔助降糖片聯合二甲雙胍對糖尿病大鼠骨骼肌胰島素抵抗的影響，探討其作用機制。方法 6～7周齡雄性ZDF（fa/fa）大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、和于泰輔助降糖片組（降糖片組）、和于泰輔助降糖片聯合二甲雙胍組（聯合組），另選ZDF（fa/+）大鼠為正常組，各給藥組給予相應藥物灌胃，連續(xù)6周。檢測體質量、空腹血糖（FBG）、三酰甘油、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）、血清胰島素水平，計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），并進行口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）；HE染色觀察骨骼肌病理變化；RT-PCR和Western blot分別檢測骨骼肌相應基因和蛋白表達。結果 與二甲雙胍組、降糖片組比較，聯合組大鼠TC、FFA、FBG水平及HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）；OGTT各時間點血糖水平及曲線下面積顯著降低（P<0.05，P<0.01）；HE染色肌纖維排列整齊，細胞核無增多及內移，未見明顯炎細胞浸潤；骨骼肌胰島素受體（InsR）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖轉運蛋白4（Glut4）mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；骨骼肌磷酸化InsR、磷酸化Akt、Glut4蛋白表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結論 和于泰輔助降糖片聯合二甲雙胍能夠改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，效果優(yōu)于單獨應用。

關鍵詞：和于泰輔助降糖片；二甲雙胍；聯合應用；PI3K/Akt信號通路；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）11-0039-05

Abstract： Objective To observe effects of Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets combined with metformin in insulin resistance （IR）； To discuss its mechanism of action. Methods 6–7 week old male ZDF （fa/fa） rats were randomly divided into model group， metformin group， Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets group （Jiangtang Tablets group）， and metformin combined with Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets group. ZDF （fa/+） rats were chosen as normal group. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 6 weeks. Body weight， FBG， TG， TC， FFA， FINS， HOMA-IR， OGTT and HE staining were tested. HE staining was used to observe the pathological changes of skeletal muscle. RT-PCR and Western blot were used to detect skeletal muscle corresponding gene and protein expression. Results Compared with Jiangtang Tablets group and metformin group， TC， FFA， FBG， and HOMA-IR in metformin combined with Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Blood glucose level and AUC significantly decreased at each time point in OGTT. HE staining of skeletal muscle fibers arranged in order； nucleus increased and internal movement was not significant， without obvious infiltration of inflammatory cells. Expressions of skeletal muscle InsR， Akt， and Glut4 mRNA expression increased （P<0.05， P<0.01）. Expressions of skeletal muscle p-InsR， p-Akt， and

Glut4 protein expression increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets combined with metformin can improve IR in type 2 diabetic rats， and the effect is better than single-application.

Key words： Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets； metformin； combination-application； PI3K/Akt signaling pathway； rats

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）作為2型糖尿病的主要發(fā)病基礎越來越受到研究者重視。骨骼肌是胰島素作用的主要外周靶組織，調節(jié)葡萄糖攝取和利用，在IR發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病的一線用藥，一方面可以提高胰島素敏感性而促進骨骼肌、脂肪組織對外周葡萄糖的攝取、利用，達到降糖、改善IR作用，另一方面能夠抑制肝、腎過度的糖異生，促進葡萄糖無氧代謝。但二甲雙胍單獨應用往往療效不理想，并且會出現胃腸道不良反應、增加乳酸中毒的風險[1]。和于泰輔助降糖片（苦瓜、桑葉、玉竹、三七、肉桂等提取物）是在臨床經驗基礎上結合現代研究成果創(chuàng)制的，具有激活胰島β細胞、調節(jié)神經內分泌系統(tǒng)、改善肝腎功能等作用。現代藥理研究表明，其主要成分苦瓜總皂苷[2-4]、桑葉總黃酮[5-6]、桂皮醛[7-8]、三七總皂苷[9]等有確切降糖、改善IR的作用。本研究采用自發(fā)性2型糖尿病動物模型ZDF大鼠，觀察和于泰輔助降糖片與二甲雙胍聯合應用改善ZDF大鼠骨骼肌IR的療效，并與單獨應用相比較，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性自發(fā)性2型糖尿病模型ZDF（fa/fa）大鼠24只，6～7周齡，體質量180～200 g；同周齡雄性ZDF（fa/+）大鼠6只，北京維通利華實驗技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所SPF級動物實驗室。ZDF（fa/fa）大鼠pumina#5008飼料（蛋白質26.85%、脂肪16.71%、碳水化合物56.44%）誘導喂養(yǎng)，ZDF（fa/+）大鼠喂養(yǎng)普通全價營養(yǎng)顆粒鼠飼料。

1.2 藥物

和于泰輔助降糖片，0.6 g/片，中生肽靈生物科技有限公司，批號140501；鹽酸二甲雙胍片，0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號20150109。

1.3 主要試劑和儀器

蘇木素、伊紅染液，北京索萊寶科技有限公司；Trizol Reagent，Life technologies公司；GoScript? Reverse Transcription System、GoTaq? qPCR Master Mix，Promega公司；RIPA裂解緩沖液，北京普利萊基因技術有限公司；磷酸化胰島素受體（p-InsR）、胰島素受體（InsR）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖轉運蛋白4（Glut4）、β-actin抗體，CST公司；羊抗鼠Ⅱ抗，Abcam公司；羊抗兔Ⅱ抗，CST公司；Block one/Block one-P，日本京都Nacalai Tesque公司；ECL發(fā)光液，美國BIO-RAD公司。7160型全自動生化儀，日本日立公司；r-911型全自動放免計數儀，中國科技大學實業(yè)總公司；E9032型酶標儀，美國Promega公司；Prism7500型PCR擴增儀，美國ABI 公司；BX53型光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；垂直電泳儀、轉移槽，美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

ZDF（fa/fa）大鼠pumina#5008飼料誘導喂養(yǎng)4周后，尾靜脈采血檢測血糖，隨機血糖≥11.1 mmol/L為成模標準，按體質量和血糖隨機分為模型組、二甲雙胍組、和于泰輔助降糖片組（降糖片組）、和于泰輔助降糖片聯合二甲雙胍組（聯合組），每組6只；6只健康雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常組。二甲雙胍組每日給予0.134 g/kg二甲雙胍藥液灌胃，降糖片組每日給予和于泰輔助降糖片0.64 g/kg藥液灌胃，聯合組每日給予二甲雙胍0.134 g/kg+和于泰輔助降糖片0.64 g/kg藥液灌胃。所有藥物均用生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質量，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)6周。

2.2 標本采集

藥物干預6周后取材，禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，4 ℃、3500 r/min離心15 min，抽取血清，用于生化指標檢測；迅速剖取小腿骨骼肌，一部分放入10%中性福爾馬林溶液固定，用于普通光學顯微鏡檢測，另一部分置于不同凍存管，放入液氮凍存，用于Western blot、RT-PCR的檢測。

2.3 一般觀察

觀察各組大鼠一般狀態(tài)（精神狀態(tài)、活動情況、毛色等），記錄體質量，1次/周。

2.4 生化指標檢測

取大鼠血清，全自動生化儀檢測空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA），全自動放免計數儀檢測血清胰島素水平（FINS），計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR，FBG×FINS÷22.5）。

2.5 口服葡萄糖耐量實驗

實驗第6周，大鼠禁食不禁水12 h，2 g/kg體質量葡萄糖溶液灌胃，尾靜脈取血，葡萄糖氧化酶法測定0、30、60、120 min血糖，計算曲線下面積（AUC）。AUC=0.5×（Bg0 min+Bg30 min）÷2+0.5×（Bg30 min+Bg60 min）÷2+1×（Bg60 min+Bg120 min）÷2，Bg為各時間點血糖。

2.6 HE染色

10%中性福爾馬林溶液骨骼肌固定>48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，蘇木精染液5 s，自來水返藍10 min，1%HCl-Alc分色30 s，自來水返藍10 min，雙蒸水洗1 min，伊紅染液5 s，乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封片。光鏡下觀察骨骼肌病理變化。

2.7 RT-PCR檢測

取液氮凍存骨骼肌，Trizol法提取總RNA。GoScript? Reverse Transcription System試劑盒反轉錄，退火25 ℃、5 min，延伸42 ℃、1 h，滅活70 ℃、15 min，得cDNA。引物序列：InsR上游5'-GGCCC GATGCTGAGAACA-3'，下游5'-CGTCATTCCAAAG TCTCCGA-3'，產物長度214 bp；Akt上游5'-ATGTAG ACTCTCCAGATGAG-3'，下游5'-TGAGATAATCGA AGTCATTCA-3'，產物長度228 bp；Glut4上游5'-CG CGGCCTCCTATGAGATAC-3'，下游5'-CCTGAGTA GGCGCCAATGA-3'，產物長度270 bp；GAPDH上游5'-GGAAGCTCCGGGAACAAGT-3'，下游5'-TGCCA GCCCATGGATTCTC-3'，產物長度146 bp。GoTaq? qPCR Master Mix 20 μL體系，置于Applied Biosystems 7500 RT-PCR System進行反應，條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、15 s溶解。擴增后得出基因Ct值，采用2-ΔΔCt法計算基因表達量。

2.8 Western blot檢測

取液氮凍存骨骼肌，以RIPA裂解液提取總蛋白，加上樣緩沖液100 ℃、5 min蛋白變性；凝膠電泳100 V、1.5 h，預處理PVDF膜及濾紙，半干法轉膜15 V、1 h，TBS溶液洗膜10 min；Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，一抗（1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h。洗膜，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，蛋白條帶用Image J 7.0進行圖像分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較方差齊用LSD法檢驗，方差不齊用非參數檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 一般狀況

正常組大鼠精神良好，反應靈敏，動作靈活，皮毛光澤；模型組大鼠較正常組體質量顯著增加（P<0.01），并出現多飲、多尿、多食、皮毛無光澤；各給藥組表現較模型組明顯改善。各組體質量結果見表1。

4.2 生化指標檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠血清FBG、TG、TC、FFA、Fins水平和HOMA-IR顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清FBG、TG、TC、FFA、Fins水平和HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）；聯合組較二甲雙胍組、降糖片組大鼠血清TC、FFA、FBG水平和HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表1。

4.3 口服葡萄糖耐量實驗結果

與正常組比較，模型組大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與聯合組比較，二甲雙胍組、降糖片組大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.4 HE染色結果

正常組大鼠骨骼肌肌纖維排列整齊、胞漿均勻，細胞核排列正常、形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠骨骼肌纖維排列紊亂，胞漿不勻，細胞核紊亂、增多并出現核內移，見少量炎細胞浸潤；各給藥組大鼠骨骼肌肌纖維較模型組排列整齊，細胞核增多及內移不顯著，未見明顯炎細胞浸潤，其中二甲雙胍組、聯合組改善較明顯。結果見圖1。

4.5 聯合用藥對模型大鼠骨骼肌胰島素受體、蛋白激酶B、葡萄糖轉運蛋白4 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組InsR、Akt、Glut4 mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與聯合組比較，二甲雙胍組、降糖片組InsR、Akt、Glut4 mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表3。

4.6 聯合用藥對模型大鼠骨骼肌p-胰島素受體、p-蛋白激酶B、葡萄糖轉運蛋白4蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；聯合組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4表達較二甲雙胍組、降糖片組顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表4、圖2。

5 討論

IR是胰島素作用的靶器官對胰島素敏感性降低，導致組織中葡萄糖攝取和利用率下降的一種病理狀態(tài)，是2型糖尿病主要病理基礎之一。中藥在治療2型糖尿病、改善IR方面具有多靶點、多途徑、療效穩(wěn)定、不良反應小等特點。為了更好地探索中西藥聯合應用治療2型糖尿病IR的效果，本研究對和于泰輔助降糖片、二甲雙胍單獨和聯合應用的效果進行比較，結果顯示，各給藥組大鼠血清TG、TC、FBG、FINS水平及HOMA-IR較模型組降低；聯合組較二甲雙胍組、降糖片組大鼠血清TC、FBG水平及HOMA- IR降低，說明和于泰輔助降糖片、二甲雙胍在降低大鼠血糖、改善IR方面聯合應用效果優(yōu)于單獨應用。

骨骼肌是機體葡萄糖氧化利用的主要場所，同時也是胰島素作用的主要靶組織之一，對糖尿病發(fā)生發(fā)展有重要影響。骨骼肌對葡萄糖的攝取利用主要通過細胞內的胰島素信號傳導通路發(fā)揮作用。InsR是細胞內胰島素信號傳導通路的始動因子，分布于細胞表面，與胰島素結合后發(fā)生磷酸化并激活下游分子。研究發(fā)現，InsR表達升高能夠明顯降低小鼠血糖和胰島素水平[10]，改善IR。Akt是InsR下游的信號分子，被活化的InsR激活后發(fā)生磷酸化，從而被激活[11]，活化后的Akt觸發(fā)富含Glut4的囊泡向細胞表面轉位，增多細胞表面Glut4數量，增強骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取[12]，此外Glut4還可以抑制烯醇式丙酮酸羧激酶而減少糖異生[13]。因此，這些靶點分子在胰島素信號傳導中必不可少，任一個分子異常將會導致信號傳導不利，影響細胞對葡萄糖的利用及胰島素敏感性，這是糖尿病、IR發(fā)生的基本機制之一。

本研究中以ZDF大鼠為模型，其為自發(fā)性2型糖尿病動物模型，更接近人體發(fā)病機制，具有高血糖、高血脂、IR的特點。實驗中各給藥組干預6周后，聯合組降糖、改善IR明顯優(yōu)于二甲雙胍組、降糖片組，并較二甲雙胍組、降糖片組顯著上調大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表達，增加p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達。因此，和于泰輔助降糖片與二甲雙胍聯合應用在降糖、改善IR方面療效優(yōu)于單獨應用，其機制可能是通過上調胰島素信號通路中InsR、Akt、Glut4的mRNA表達，以及促進InsR、Akt磷酸化和Glut4的蛋白表達，調節(jié)胰島素信號通路而促進骨骼肌細胞葡萄糖代謝。

綜上所述，和于泰輔助降糖片與二甲雙胍聯合應用降糖、改善IR的療效優(yōu)于兩藥單獨應用，與其調節(jié)胰島素信號通路關鍵靶點分子表達相關。由于中藥多靶點、多途徑發(fā)揮作用，中西藥聯合應用改善IR可能存在其他新機制，需要進一步深入研究。

參考文獻：

[1] YASMIN E， GLANVILLE J， BARTH J， et al. Effect of dose escalation of Metformin on clinical features，insulin sensitivity and androgen profile in polycystic ovary syndrome[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，156（1）：67-71.

[2] 馬春宇，于洪宇，王慧嬌，等.苦瓜總皂苷對改善2型糖尿病大鼠IR關鍵因子的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2015，31（15）：1522-1525.

[3] 肖瑩，馬春宇.苦瓜總皂苷對3T3-L1IR脂肪細胞炎癥因子的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（5）：672-676.

[4] KLOMANN S D， MUELLER A S， PALLAUF J， et al. Antidiabetic effects of bitter gourd extracts in insulin-resistant db/db mice[J]. Br J Nutr，2010，104（11）：1613-1620.

[5] CAI S， SUN W， FAN Y， et al. Effect of mulberry leaf （Folium Mori） on insulin resistance via IRS-1/PI3K/Glut-4 signalling pathway in type 2 diabetes mellitus rats[J]. Pharm Biol，2016，54（11）：2685-2691.

[6] 文靜，張德芹，夏佳楠，等.桑葉提取物對MSG肥胖大鼠IR的影響[J]. 天津中醫(yī)藥，2015，32（4）：234-238.

[7] LI J E， FUTAWAKA K， YAMAMOTO H， et al. Cinnamaldehyde contributes to insulin sensitivity by activating PPARδ， PPARγ， and RXR[J]. Am J Chin Med，2015，43（5）：879-892.

[8] SARTORIUS T， PETER A， SCHULZ N， et al. Cinnamon extract improves insulin sensitivity in the brain and lowers liver fat in mouse models of obesity[J]. PLoS One，2014，9（3）：e92358.

[9] 張聲生，吳震宇，陳劍明，等.三七總皂苷改善高脂誘導脂肪肝大鼠模型氧化應激及胰島素抵抗的研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2014，34（1）：56-61.

[10] JOO E， HARADA N， YAMANE S， et al. Inhibition of gastric inhibitory polypeptide receptor signaling in adipose tissue reduces insulin resistance and hepatic steatosis in high fat diet-fed mice[J]. Diabetes，2017，66（4）：868-879.

[11] QI J， YANG B， REN C， et al. Swimming exercise alleviated insulin resistance by regulating tripartite motif family protein 72 expression and AKT signal pathway in Sprague-Dawley rats fed with high-fat diet[J]. J of Diabetes Res，2016，2016（2）：1564386.

[12] SALTIEL A R， KAHN C R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism[J]. Nature，2001，414：799-806.

[13] 李娟娥，王磊，孫文，等.匙羹藤對2型糖尿病db/db小鼠骨骼肌葡萄糖轉運信號通路的影響[J].現代中藥研究與實踐，2015，29（3）：37-40.