張瑞平++周聯(lián)東++王文潔

摘要 玉米單倍體育種技術以遺傳誘導為基礎，已成為玉米育種的關鍵技術，快速、準確地識別單倍體對玉米單倍體育種非常重要。本文就玉米單倍體鑒定方法的研究進展做一綜述性探討。

關鍵詞 玉米；單倍體；鑒定；研究進展

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）20-0024-02

Research Progress on Identifying Method of Maize Haploid

ZHANG Rui-ping ZHOU Lian-dong WANG Wen-jie

（Xinxiang Academy of Agricultural Sciences in Henan Province，Xinxiang Henan 453002）

Abstract Basing on the genetic introduction，the technology of haploid breeding of maize has become the key way of maize breeding，gradually.It′s very necessary to identify maize haploid fastly and accurately.Now we have had a review discussion on the ways of identification of maize haploid.

Key words maize；haploid；identification；research progress

單倍體技術是指通過自然發(fā)生或人工誘導獲得單倍體，然后經過自然或人工染色體加倍恢復其倍性，并在此基礎上進行選擇從而獲得所需純系的方法。與傳統(tǒng)育種方法相比，單倍體育種技術在自交系選育上具有快速、準確、高效的特點，因而越來越受到育種家的重視[1]。但是玉米單倍體自然產生率極低，一般不超過0.1%[2]，人工誘導概率也僅有10%[3]。

因此，快速準確地鑒定玉米單倍體尤為關鍵。目前，玉米單倍體的鑒定方法主要有形態(tài)學鑒定、解剖學鑒定、細胞學鑒定、放射性方法鑒定和遺傳標記鑒定及分子標記鑒定等[4-6]。近年來，有學者研究出其他的玉米單倍體鑒定方法，比如在遺傳標記基礎上的可見光光譜以及近紅外漫透射鑒定等方法。

1 玉米單倍體鑒定方法

1.1 形態(tài)學鑒定

利用形態(tài)學方法鑒定單倍體是一種直觀、便捷的鑒定方法。玉米單倍體細胞染色體是正常二倍體細胞染色體數(shù)目的1/2，因而，相較于二倍體細胞，單倍體的細胞和細胞核都要小很多，正常生長狀態(tài)下的植株也比較細弱。Chase[7-9]指出，單倍體玉米植株的株高、葉長、莖粗及各部分葉寬相當于二倍體植株的70%，而雄穗分枝數(shù)、苞葉數(shù)、節(jié)間數(shù)、穗行數(shù)和每行小穗數(shù)約為二倍體植株的90%。單倍體玉米植株在幼苗生長早期主根和芽鞘長短區(qū)別明顯；在苗期第1片葉較短；在拔節(jié)期生長緩慢，葉片上沖窄小，株高、穗位高顯著低于二倍體；且發(fā)育較快，開花期比二倍體早1～2 d。根據(jù)以上區(qū)別能夠比較容易地區(qū)分出單倍體和二倍體。

1.2 解剖學鑒定

植株轉變成單倍體后會引起解剖學上的變化，比如單倍體的體細胞、細胞核變小，葉綠體數(shù)目減少等。一般通過分析氣孔保衛(wèi)細胞的大小和數(shù)目來鑒定單倍體。65 μm是區(qū)分小麥單倍體和二倍體氣孔保衛(wèi)細胞直徑長度的可靠標準，鑒定準確率超過90%[10]。而玉米單倍體的鑒定標準定為氣孔保衛(wèi)細胞長度≤29 μm[11]。

1.3 細胞學鑒定

鑒定植物體細胞或減數(shù)分裂細胞中染色體數(shù)目是確定倍性的最基本和最精確的方法。細胞學鑒定法通常是進行根尖分生組織細胞或減數(shù)分裂細胞壓片，通過觀察細胞中染色體數(shù)目區(qū)分單倍體和二倍體。流式細胞儀也是很好地用來判斷細胞倍性的方法[12]。流式細胞儀應用于倍性判斷上，通過對處于旺盛分裂期的細胞進行DNA含量檢測，從而檢測單個細胞的總核酸量。

1.4 放射性方法鑒定

隨著成長的植株、幼苗、種子倍性的增加，其對輻射的抵抗力提高，這種規(guī)律性同樣表現(xiàn)在葉片上。研究表明，在X射線劑量為54.18 C/kg時，單倍體玉米輻射2 d后出現(xiàn)壞死，而二倍體要20 d才出現(xiàn)壞死。放射性方法可以在很短的時間內照射成千上萬張葉片，鑒定快速。

1.5 遺傳標記法鑒定

1.5.1 人工肉眼分選。利用孤雌生殖誘導系為材料，并根據(jù)籽粒Navajo標記和ABPI紫色植株顯性雙標記系統(tǒng)對誘導產生的單倍體進行鑒定[13]。首先根據(jù)籽粒Navajo標記性狀選出可能的單倍體籽粒，再經過有無苗期葉鞘色素或胚根色素確定單倍體的真?zhèn)巍Ｓ纱丝蓪㈦s交籽?？煞譃?類[14]：①胚盾狀體、胚乳糊粉層均著色，為雜合二倍體；②盾狀體、糊粉層均未著色，為花粉污染所致；③盾狀體未著色、糊粉層著色，為擬單倍體籽粒，其具有正常3n胚乳和可能由未受精的雌配子發(fā)育成的胚。種植第③類籽粒，若幼苗葉鞘為綠色即為單倍體或雙單倍體。

1.5.2 基于機器視覺玉米單倍體分選。在遺傳標記的基礎上，李衛(wèi)軍等[15]根據(jù)玉米籽粒胚面顏色標記不同，設計了一套單倍體分選系統(tǒng)，包括斜面翻滾部件、傳動部件、信號采集與處理部件、籽粒分選部件。該系統(tǒng)基于機器視覺，可以在運動過程中全自動、高通量地分選單倍體籽粒，其原理是采集具有胚面的玉米籽粒圖片，并判斷胚部區(qū)域是否有顏色標記，以此來鑒別籽粒是單倍體還是二倍體。當玉米籽粒為多倍體時，控制器向電機發(fā)送信號，電機帶動玉米擋板滑動，打開篩選窗口，籽粒落入收容盒；若為單倍體，則電機不運動，籽粒保留。

值得注意的是該系統(tǒng)的斜面翻滾部件，可產生玉米籽粒的多姿態(tài)信息，使獲得含胚面圖片的成功率達到90%，解決了人工擺設籽粒的問題。endprint

1.5.3 基于可見光光譜高效鑒別玉米單倍體籽粒。近年劉 金等[16]已證明利用可見光光譜分析建立玉米單倍體籽粒鑒別方法，并使模型可鑒別未參與建模材料的單倍體具有可行性，并且基于該方法有望建立玉米單倍體籽粒的自動化快速篩選系統(tǒng)。

1.5.4 基于近紅外漫透射光譜鑒別玉米單倍體。覃 鴻等[17]證明基于近紅外的漫透射可實現(xiàn)分析光程縱深信息全累加，得到樣品內部信息，對胚面朝向不敏感，能有效鑒別隨機擺放的玉米單倍體和多倍體。近紅外方法為實現(xiàn)實用化的自動鑒別提供了條件。

1.6 油分標記鑒定

陳紹江和宋同明[5]最先提出利用油分的花粉直感效應鑒定單倍體。用高油的單倍體誘導系作父本的雜交籽粒油分相對于母本自交的油分大大提高，而由于單倍性，單倍體籽粒不存在花粉直感，油分較低。再利用近紅外光譜儀或核磁共振測定籽粒油分，從而分選出擬單倍體。

1.7 其他鑒定方法

另外，也有報道用除草劑抗性方法、SSR標記、SNP標記、室內發(fā)芽等方法鑒別玉米單倍體。

2 各鑒定方法的優(yōu)缺點

形態(tài)鑒定法鑒定速度快。在生長發(fā)育上，單倍體與其相應的二倍體具有高度相關性，株高是鑒定單倍體準確的方法[18]，但形態(tài)鑒定法要求鑒定者經驗豐富。細胞學和解剖學鑒定準確，但速度較慢，不適合大批量材料的鑒定。放射法鑒定單倍體速度快，但是工作量大，且會對玉米植株造成不可逆的損傷。遺傳標記系統(tǒng)是由2個不同遺傳標記性狀組合而成，可靠性和鑒別效率較高，但在不同的雜交組合中，標記系統(tǒng)中籽粒標記的表現(xiàn)差異很大，并且要花費大量的人力、物力。

在遺傳基礎上基于機器視覺的玉米單倍體分選、基于可見光光譜以及基于近紅外漫透射光譜鑒別玉米單倍體籽粒是近年來新興的技術，這幾種方法辨識度高、效率高，并且有望實現(xiàn)全自動鑒別玉米單倍體籽粒，是一個值得深入探究的方向。

油分標記鑒定法，雖然基于核磁共振測油技術研發(fā)的單倍體自動分選儀已經成功，但該技術只能篩選高油型誘導系誘導的籽粒，目前常規(guī)誘導系是否能利用油分進行分選還在探索中。

3 前景展望

在前人研究成果的基礎上，科研工作者們不斷改進和創(chuàng)新，在不久的將來有望實現(xiàn)高效自動化玉米單倍體鑒別。特別是利用光譜學原理對玉米籽粒胚面的鑒別，給玉米單倍體籽粒鑒別提供了新的方向。

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