趙 超，葉海青，侯萍萍，楊 揚，周欣慧，鐘姝凝，張鐵華*

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

微波輔助提取林蛙卵油的工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析

趙 超，葉海青，侯萍萍，楊 揚，周欣慧，鐘姝凝，張鐵華*

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

以林蛙卵為原料，以無水乙醇為提取劑，研究微波法對林蛙卵油提取率的影響。在單因素試驗的基礎上，進行響應面優(yōu)化試驗，研究料液比、浸泡時間、微波功率對林蛙卵油提取的影響。結(jié)果表明，提取最佳工藝條件為料液比1∶9.82（g/m L）、浸泡時間3.33 h、微波時間30 m in、微波功率600 W；林蛙卵油的提取率可達到（20±0.67）%。與其他林蛙卵油提取方法比較，微波法輔助提取林蛙卵油具有得率高的優(yōu)點。對得到的林蛙卵油采用氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測出27 種脂肪酸，不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)54.98%，其中以亞油酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、亞麻酸、棕櫚反油酸、二十二碳五烯酸含量較高。

林蛙卵油；微波輔助；提取率；響應面分析；脂肪酸含量

中國林蛙是一種名貴的補品和滋補性中藥材[1-2]。溶劑浸提法和超臨界流體萃取法得到的林蛙卵油中不飽和脂肪酸含量大約占到70%，由C12～C22脂肪酸組成，主要不飽和脂肪酸是十六碳烯酸、亞油酸、油酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），其中亞麻酸質(zhì)量分數(shù)為0.16%～0.21%，二十碳四烯酸質(zhì)量分數(shù)為0.66%～1.02%[3]。李成義等[4]證明了林蛙卵油中含脂溶性維生素，如VA、VD、VE、VK、β-胡蘿卜素。此外，林蛙卵油還有很高的藥用價值，具有降血脂、抑制焦慮、保護卵巢、調(diào)節(jié)婦科內(nèi)分泌、抗驚厥、中樞神經(jīng)抑制作用[5-9]。綜上所述，林蛙卵油將是未來新型綠色保健食品和藥品。但是目前從林蛙卵中提取林蛙卵油方法有超臨界流體萃取法[10]和溶劑浸提法[11]，這2 種方法林蛙卵油最大的提取率為18.7%，存在提取率低、成本高等問題。

近年來，利用微波技術提取油脂得到了廣泛應用[12-15]。張佰清等[16]采用微波輔助提取樹莓籽油，提高了樹莓籽油得率。為了提高林蛙卵油提取率，本實驗將微波應用于林蛙卵油提取工藝中，采用Box-Behnken試驗設計結(jié)合響應面分析方法，以料液比、浸泡時間、微波時間、微波功率為考察因素，確定微波法輔助提取林蛙卵油的最佳工藝。結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析技術對油脂的組成進行分析測定，對其營養(yǎng)價值進行評價。為林蛙卵油的深入研究和開發(fā)保健型食品提供理論依據(jù)，為廢棄物林蛙卵的綜合開發(fā)利用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

林蛙卵采自于東北長白山區(qū)林蛙；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

M L3002型電子天平 瑞士M ettler-Toledo公司；GX-04型粉碎機 浙江高鑫工貿(mào)有限公司；MAS-II型微波萃取儀 上海新儀微波化學科技有限公司；EYELAN-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；5975-6890N型GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

林蛙卵→粉碎→浸提→微波萃取→過濾→去除溶劑→裝瓶

將含水量小于6%的林蛙卵粉用40目篩網(wǎng)篩分，每次準確稱取林蛙卵粉質(zhì)量10 g，在無水乙醇中浸提，采用微波法輔助提取，提取結(jié)束后沉降1 h，過濾，將上述操作重復進行2 次，合并上清液，備用。

1.2.2 微波法輔助提取林蛙卵油的單因素試驗

以料液比（1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11（g/m L）、浸泡時間（3、3.5、4、4.5、5 h）、微波時間（10、20、30、40、50 m in）、微波功率（400、500、600、700、800 W）為影響因素，以林蛙卵油提取率為指標進行單因素試驗。

1.2.3 響應面試驗設計

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，其因素固定條件為微波溫度30 ℃，微波時間30 m in，選擇料液比（A）、浸泡時間（B）、微波功率（C）為響應面試驗因素，響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Tab le 1 Code and level of independent variables used in response surface analysis

1.2.4 林蛙卵油的脂肪酸組成分析

1.2.4.1 樣品處理

稱取0.5 g林蛙卵油，加入5 m L 0.5 m o l/L KOHCH3OH溶液，70 ℃皂化回流5 m in，冷卻到室溫，從冷凝管頂部加入1 m L BF3，保持20 m in，冷卻后加入1 m L正己烷溶液，取上清液進行GC-MS分析[17-18]。

1.2.4.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 19091G-133毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣。流速1 mL/min，分流比30∶1，脂肪酸甲酯分析條件：初始溫度100 ℃，保持1 min；以8 ℃/min速率升至280 ℃；保持20 min。

1.2.4.3 質(zhì)譜條件

分析采用電子電離源（70 eV），選取全掃描模式，掃描范圍m/z 50～550。在脂肪酸的分析中，根據(jù)GC-MS中各組分保留時間以及質(zhì)譜圖，通過脂肪酸標準品、NIST和Varian標準譜庫檢索進行鑒定，采用峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對含量[19-21]。

1.2.5 林蛙卵油提取率計算

稱取1.2.1節(jié)所得上清液，倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，稱量旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶質(zhì)量，用減壓蒸餾裝置除去溶劑，揮發(fā)完后，稱量旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶的質(zhì)量，進行3 次平行實驗，結(jié)果取平均值，按下式計算林蛙卵油提取率：

式中：m1為揮發(fā)前旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶質(zhì)量；m2為揮發(fā)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)重復3 次，采用Origin 8.0繪圖，通過SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，響應面試驗設計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對林蛙卵油提取率的影響

選用無水乙醇作為提取溶劑，操作參數(shù)為微波溫度30 ℃、浸泡時間3.5 h、微波時間10 m in、微波功率500 W。如圖1所示，料液比1∶10（g/m L）時，林蛙卵油提取率最高，且料液比1∶7～1∶10（g/m L）的林蛙卵油提取率有顯著性提高（P＜0.05）。這可能由于當林蛙卵粉質(zhì)量一定時，溶液體積增大，接觸面積增大，分子擴散速率增加，有利于林蛙卵油的提取。但是提取溶劑比例太大時，部分微波會被有機溶劑吸收，對林蛙卵粉內(nèi)部的微波作用減少，細胞破碎能力減弱，林蛙卵油提取率降低[22-23]。從而，確定料液比為1∶10（g/m L）。

2.2 浸泡時間對林蛙卵油提取率的影響

圖2 浸泡時間對提取率的影響Fig. 2 Effect of soaking time on the extraction yield of oil

選用無水乙醇作為提取溶劑，操作參數(shù)為料液比1∶10（g/m L）、微波溫度30 ℃、微波時間10 m in、微波功率500 W。由圖2可知，在3.5 h時，林蛙卵油提取率最高，且在浸泡時間3.0、3.5 h下林蛙卵油提取率有顯著差異性（P＜0.05）。隨著浸泡時間的延長，林蛙卵油提取率變化不顯著，從節(jié)約時間和勞動力成本考慮，確定林蛙卵油提取時間以3.5 h最佳。

2.3 微波時間對林蛙卵油提取率的影響

選用無水乙醇作為提取溶劑，操作參數(shù)為料液比1∶10（g/m L）、微波溫度30 ℃、浸泡時間3 h、微波功率500 W。如圖3所示，當微波時間為30 m in時，林蛙卵油提取率最大。隨著時間的延長，細胞中的油脂與乙醇溶液逐漸達到了相對平衡[24-26]。大于30 m in以后，提取率變化不顯著，考慮到溫度升高，油會分解或揮發(fā)。從而，確定微波時間為30 m in。

圖3 微波時間對提取率的影響Fig. 3 Effect of m icrowave irradiation time on the extraction yield of oil

2.4 微波功率對林蛙卵油提取率的影響

圖4 微波功率對提取率的影響Fig. 4 Effect of m icrowave power on the extraction yield of oil

選用無水乙醇作為提取溶劑，操作參數(shù)為料液比1∶10（g/m L）、微波溫度30 ℃、浸泡時間3 h、微波時間20 m in。由圖4可知，當微波功率為600 W時，林蛙卵油提取率最大。且400、500 W和600 W功率條件下林蛙卵油提取率具有顯著差異性（P＜0.05）。這是因為微波產(chǎn)生大量能量，經(jīng)過熱效應作用，萃取物的細胞結(jié)構(gòu)破裂。隨著功率的增加，熱效應越激烈，提取物吸收的能量越多，細胞結(jié)構(gòu)破裂程度越高[27-28]。當600 W以后，溫度升高，部分溶劑會揮發(fā)，冷凝的效果不明顯，所以林蛙卵油提取率會有所降低，從而確定微波功率為600 W。

2.5 響應面試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比（A）、浸泡時間（B）、微波功率（C）為影響因素，以提取率為響應值進行試驗設計，試驗方案及結(jié)果如表2所示。在料液比1∶10（g/m L）、浸泡時間3.5 h、微波功率600 W時林蛙卵油提取率最高，為20.8%。

以林蛙卵油提取率為響應值，利用Design-Expert 8.0軟件對林蛙卵油提取率結(jié)果進行回歸分析，其回歸方程為：Y=20.24-0.31A-0.33B+0.063C+0.43AB+0.45AC+0.025BC-1.27A2-0.59B2-0.7C2。

由表3可知，回歸方程模型F值為3.78，P值為0.046 7，回歸顯著；失擬項P值為0.508 7（＞0.1），說明模型失擬值不顯著，因此模型可以用于林蛙卵油提取率測定。一次項、交叉項對響應值影響不顯著，模型二次項A2影響顯著，各因素影響按主次排位順序為浸泡時間＞料液比＞微波功率。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design w ith results for response surface analysis

表3 響應面二次回歸模型分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

圖5 交互因素對林蛙卵油提取率的影響Fig. 5 Response surface p lots show ing the interactive effects of various factors on the extraction yield of oil

由圖5a可知，料液比一定時，林蛙卵油提取率隨著浸泡時間的延長成先增大后減小的趨勢，浸泡時間一定時，林蛙卵油提取率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5b可知，料液比一定時，林蛙卵油提取率隨著微波功率的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，微波功率一定時，林蛙卵油提取率隨著提取溶劑用量的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖5c可知，浸泡時間一定時，林蛙卵油提取率隨著微波功率的延長成先增大后減小的趨勢，微波功率一定時，林蛙卵油提取率隨著浸泡時間的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

通過對二次回歸方程求一階偏導，計算得到林蛙卵油提取率的最佳工藝為料液比1∶9.82（g/m L）、浸泡時間3.33 h、微波功率598.12 W。由于實際操作原因，得到提取林蛙卵油最佳工藝條件為料液比1∶9.82（g/m L）、浸泡時間3.33 h、微波功率600 W。2.6 林蛙卵油脂肪酸結(jié)果分析

由表4可知，GC-MS法共分離得到27 種脂肪酸，飽和脂肪酸相對含量為36.5%，其中十八碳酸相對含量為17.199%。不飽和脂肪酸占54.98%，多不飽和脂肪酸占50.02%。亞油酸含量最高，相對含量為24.41%。二十碳三烯酸相對含量為7.02%。與金莉莉等[3]檢測超臨界流體萃取法和溶劑浸提法得到的林蛙卵油相比，3 種方法提取的林蛙卵油脂肪酸組成基本一致，由C12-22脂肪酸組成，但主要脂肪酸及含量略微不同。在飽和脂肪酸含量上，微波法提取林蛙卵油飽和脂肪酸相對含量增加約8.83%，超臨界流體萃取法和溶劑浸提法提取林蛙卵油中飽和脂肪酸十六碳酸相對含量最多，微波法中十八碳酸相對含量最多。在不飽和脂肪酸的含量上，超臨界流體萃取法和溶劑浸提法得到林蛙卵油中主要不飽和脂肪酸為十六碳烯酸、亞油酸、油酸、EPA、DHA。微波法中，主要不飽和脂肪酸為亞油酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、亞麻酸、棕櫚反油酸、二十二碳五烯酸。這是降低血脂，降低血壓和血糖，預防出血性腦疾病和血栓性疾病，預防過敏性疾病，增強人體免疫力和減緩人體衰老等的主要物質(zhì)基礎[29-30]。

表4 林蛙卵油脂肪酸的組成及相對含量Table 4 Fatty acid com position of Rana chensinensis egg oil

3 結(jié) 論

微波法輔助提取林蛙卵油各因素影響按由大到小順序為浸泡時間＞料液比＞微波功率。研究得到提取林蛙卵油最佳工藝條件為微波時間30 m in、料液比1∶9.82（g/m L）、浸泡時間3.33 h、微波功率600 W。在此工藝條件下，林蛙卵油的提取率可達到（20±0.67）%。與其他方法比較，微波法輔助提取林蛙卵油具有得率高的優(yōu)點，采用GC-MS法對脂肪酸成分分析，微波法中主要不飽和脂肪酸為亞油酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、亞麻酸、棕櫚反油酸、二十二碳五烯酸。

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Optimization of M icrowave-Assisted Extraction and Fatty Acid Composition of Rana chensinensis Egg Oil

ZHAO Chao, YE Haiqing, HOU Pingping, YANG Yang, ZHOU Xinhui, ZHONG Shuning, ZHANG Tiehua*
(College of Food Science and Engineering, Jilin University, Changchun 130062, China)

The m icrowave-assisted extraction of oil from Rana chensinensis eggs using anhydrous ethanol as the extraction solvent was optimized by one-factor-at-a-time method and response surface methodology. With this aim, we investigated the eff ect of solid-to-solvent ratio, soaking time and m icrowave power on the oil yield. The results obtained from the study showed that the optim ized conditions were as follow s: solid-to-solvent ratio, 1:9.82 (g/m L); soaking time, 3.33 h; m icrowave irradiation time, 30 min; and m icrowave power, 600 W. Under these conditions, the oil yield could reach (20 ± 0.67)%,which was higher than that obtained by other extraction methods. By gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),27 fatty acids in the extracted oil were detected. Unsaturated fatty acids accounted for 54.98% of the total fatty acids in the oil, w ith 9-octadecadienoic acid, cis-11,14-eicosadienoic acid, 7,11,14-eicosatrienoate, 8,11,14,17-eicosatetraenoate,9,12,15-octadecatrienoic acid, 9-hexadecenoic acid and 7,10,13,16,19-docosapentaenoate being predom inant.

Rana chensinensis egg oil; microwave-assisted extraction; extraction yield; response surface methodology; fatty acid composition

10.7506/spkx1002-6630-201722039

TS225.2

A

1002-6630（2017）22-0263-06

趙超, 葉海青, 侯萍萍, 等. 微波輔助提取林蛙卵油的工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 263-268.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722039. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Chao, YE Haiqing, HOU Pingping, et al. Optimization of microwave-assisted extraction and fatty acid composition of Rana chensinensis egg oil[J]. Food Science, 2017, 38(22): 263-268. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722039. http://www.spkx.net.cn

2017-05-27

吉林省科技學技術廳成果轉(zhuǎn)化項目（20130727074YY）

趙超（1995—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品精深加工與食品生物技術。E-mail：2268017612@qq.com

*通信作者：張鐵華（1970—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品精深加工與食品生物技術。E-mail：zhangth@jlu.edu.cn