孫良廣，黃文婧*

（廣西梧州食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002）

實時熒光PCR技術快速檢測蓮蓉制品中蕓豆成分

孫良廣1，黃文婧2,*

（廣西梧州食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002）

目的：建立基于實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法。方法：以蕓豆pvsbe2基因高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，通過對蓮子及其他富含淀粉類植物DNA進行擴增，以驗證方法的特異性；以1 ng/μL的蕓豆DNA進行系列稀釋，確定此法檢測靈敏度；對含有1%蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10 倍梯度稀釋，確定重量檢測靈敏度；并應用此方法和PCR方法對市場樣品進行了檢測，對建立的熒光PCR方法進行驗證。結果：該檢測方法具有高度特異性，與蓮子及其他高淀粉植物無交叉反應；DNA質(zhì)量濃度的檢測靈敏度達到1 pg/μL，重量檢測靈敏度可達0.01%。含蕓豆成分的蓮蓉月餅擴增陽性，檢測結果與食品標簽相符。結論：本研究建立的實時熒光PCR方法具有特異性強、靈敏度高、快速簡便的特點，更適合蓮蓉制品中蕓豆成分的快速檢測。

蓮蓉制品；蕓豆成分；檢測；實時熒光PCR

近年來，由于蓮子價格的不斷攀升，不少廠家為了節(jié)約成本會用蕓豆餡料冒充蓮蓉餡料。蕓豆內(nèi)除含有維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分外，還含有一種對人體有害的成分——血球凝集素，該成分經(jīng)高溫烹調(diào)后可被破壞。但是如果在蕓豆加工過程中，烹調(diào)時間短或翻炒不均勻，致使蕓豆不熟，可引起食物中毒[1]。蕓豆在消化吸收過程中會產(chǎn)生過多的氣體，造成脹肚。故消化功能不良、有慢性消化道疾病的人應盡量少食。還有一些對豆類蛋白敏感人群，如誤食豆制品，可能會引起過敏性皮炎或嚴重的會產(chǎn)生休克。這些不適宜食用蕓豆類食品的人群若誤食沒有標示有蕓豆成分的蓮蓉月餅，可能會造成不可預計的嚴重后果。

蕓豆的檢測依據(jù)GB/T 23814—2009《蓮蓉制品中蕓豆成分定性PCR檢測方法》蓮蓉制品中蕓豆成分定性聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法[2]，該方法為普通PCR法，主要過程為通過特異性基因序列擴增后用凝膠成像的方式鑒別，此法步驟繁瑣，干擾因素較多，不利于批量檢測。通過查閱大量文獻[3-26]后，參照GB/T 23814—2009標準中的蕓豆特異性基因序列，設計特異性引物和探針，建立蓮蓉制品中蕓豆成分的實時熒光PCR檢測方法，此法具有反應快速、特異性強、靈敏度高、結果清晰等優(yōu)點，更適合實驗室的批量和快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于蕓豆成分特異性檢測樣品皆由本實驗室提供，包括：白蕓豆、紅蕓豆、花蕓豆、黑蕓豆、大豆、蓮子、玉米、紅薯、小麥、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋共14 種物種。市售蓮蓉月餅（包括20 種標示為純蓮蓉月餅，15 種未標示出蓮蓉含量，5 種標示有白蕓豆成分，以下統(tǒng)稱為蓮蓉月餅）共40 份。

Hi-DNAsecure Plant Kit高效植物基因組DNA提取試劑盒（貨號：DP350-02） 天根生化科技（北京）有限公司；LabServ Plant DNA Kit磁珠法植物DNA提取試劑盒（貨號：KFR-804096） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒（貨號：T003L）廣州迪澳生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer TaKaRa生物工程公司；2×ES PCR M aster M ix （貨號：CW 0690M）、DNA標準M arker（100 bp ladder）（貨號：CW 0636S） 北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

M inispin臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；M IN IB-1 0 0F恒溫金屬浴 杭州米歐儀器有限公司）、XA 205DU電子天平 德國梅特勒-托利多公司；LightCycler96熒光定量PCR儀 瑞士羅氏公司；Thermo Fisher Duo磁珠提取儀、OSE-260微量分光光度計天根生化科技有限公司；C1000 Touch PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針設計合成

熒光PCR檢測上游引物：ATGAATTGTACGG TGAAGGATGG；下游引物：GGACTGTAAACAAACA CAGGTAGC；探針：FAM-5’-TCGCAGTCTCGTTG T CACCTCCA-3’-BHQ1；普通PCR引物參照GB/T 23814—2009標準，引物和探針由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3.2 樣品制備

將蕓豆樣品去皮烤干后用粉碎機打成粉末，其他物種樣品均用粉碎機打碎后取樣用于DNA的提取。蓮蓉月餅樣本取月餅餡料用于DNA提取。

取含1%蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10 倍逐級稀釋，使蕓豆在混合樣品中的含量為1%、0.1%、0.01%。用于含量檢測靈敏度的測定。

1.3.3 DNA提取

將含有1%蕓豆的樣品、純蕓豆樣品、隨機抽取5批蓮蓉月餅，取樣量均為（40±2）mg。采用Tiangen（天根）的Hi-DNAsecure Plant Kit高效植物基因組DNA提取試劑盒、迪澳的植物基因組DNA提取試劑盒和LabServ Plant DNA Kit磁珠法植物DNA提取試劑盒在Thermo Fisher Duo磁珠提取儀上提取，按照試劑盒說明書進行。用OSE-260型微量分光光度計測定DNA質(zhì)量濃度和對比不同試劑盒的DNA提取效果。

1.3.4 實時熒光PCR反應

實時熒光PCR采用25 μL反應體系：10×PCR Bu ffer 2.5 μL，dNTP（2.5mm o l/L）1 μL，M gC l2（25 mm o l/L）3 μL，上、下游引物（50 mm o l/L）各0.07 μL，探針（50 mmol/L）0.05 μL，Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，50%甘油0.2 μL，模板DNA 5 μL，補水至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 m in，95 ℃變性5 s，55 ℃退火60 s，同時收集熒光，進行45 個循環(huán)。

1.3.5 實時熒光PCR的特異性實驗

選取白蕓豆、紅蕓豆、花蕓豆、黑蕓豆、大豆、蓮子、玉米、紅薯、小麥、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋的DNA作為PCR的模板，以去離子水為陰性對照模板，進行實時熒光PCR擴增，檢測熒光引物的特異性。

1.3.6 實時熒光PCR的靈敏度實驗

取白蕓豆提取出的DNA模版進行稀釋至1 ng/μL，然后再進行一系列梯度稀釋，將系列稀釋的DNA模版進行熒光PCR擴增，測試熒光PCR法的檢測靈敏度。取質(zhì)量分數(shù)1%蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10 倍系列稀釋，使蕓豆在混合樣品中的含質(zhì)量分數(shù)1%、0.1%、0.01%，作為PCR反應得模板，進行實時熒光PCR擴增，測試方法的含量檢測靈敏度。

1.3.7 蕓豆PCR擴增

普通PCR反應體系：2×Es PCR M aster M ix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL（20 pmol/μL），RNase-Free Water 7.5 μL，模板DNA 3 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 m in；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)后，72 ℃延伸5 m in。

普通PCR擴增反應結束后，PCR擴增產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法比較實驗

3 種DNA提取方法的提取下列樣本，對樣本DNA含量和純度（以A260nm/A280nm表示）進行測定，結果見表1。

由于蓮蓉月餅餡料中含有大量的糖分和油脂，會影響DNA的提取效果，依據(jù)GB/T 23814—2009標準要求，當A260nm/A280nm在1.4以上時，可用于PCR擴增，1.7～2.0之間時，PCR擴增效果好[2]，通過3 種試劑盒提取的DNA質(zhì)量濃度和純度數(shù)據(jù)對比，最終確定用迪澳的植物基因組DNA提取試劑盒提取蓮蓉月餅樣本（A260nm/A280nm均能達到1.4以上），用天根的高效植物基因組DNA提取試劑盒提取植物類樣本（A260nm/A280nm均能達到1.8以上）。確保后續(xù)PCR擴增不會受DNA純度的影響干擾實驗結果的判定。

2.2 實時熒光PCR法特異性檢測結果

圖1 蕓豆成分實時熒光PCR特異性檢測圖譜Fig. 1 Specificity of real-time fluorescent PCR for detection of kidney bean com ponent

采用本試劑盒對富含淀粉植物DNA進行實時熒光PCR擴增，結果顯示，只有4 種蕓豆樣品的DNA有明顯的S型擴增曲線（Ct值在19.66～22.56之間），其余10 種植物DNA均未出現(xiàn)明顯的S型擴增曲線（圖1）。結果表明，本研究建立的方法所設計的引物和探針具有高度的種屬特異性。

2.3 實時熒光PCR法靈敏度測試結果

以質(zhì)量濃度為1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.000 5 ng/μL的蕓豆DNA為模板，進行熒光PCR擴增，從擴增圖譜（圖2）可以看出，在0.001 ng/μL以上的蕓豆DNA中均出現(xiàn)了明顯的S型擴增曲線。其Ct值依次為25.91、29.65、33.21、34.59、35.84。本實驗結果表明，該方法檢測靈敏度為0.001 ng/μL（即1 pg/μL）。與國標采用的普通PCR方法相比較檢測靈敏度為0.5 ng，檢測的靈敏度更高，是普通PCR的500 倍。

圖2 蕓豆成分DNA質(zhì)量濃度靈敏度實時熒光PCR檢測擴增圖譜Fig. 2 Amp lification curves show ing the sensitivity of real-time fluorescent PCR for detection of different concentrations of kidney bean DNA

將1.3.2節(jié)1%、0.1%、0.01%三個稀釋梯度的蕓豆混合樣品DNA進行實時熒光PCR擴增，此3 個濃度的蕓豆混合樣品均有明顯S型擴增曲線（圖3），Ct值依次為27.90、31.45、34.57。結果表明，該方法能檢測出原料產(chǎn)品中0.01%的蕓豆成分。

圖3 蕓豆成分實時熒光PCR重量靈敏度檢測圖譜Fig. 3 Amp lification curves show ing the sensitivity of real-time fluorescent PCR for detection of different proportions of kidney bean component

表1 實驗樣品DNA提取結果Tab le 1 Resu lts of DNA extraction from experimental sam p les

2.4 使用熒光PCR方法和普通PCR方法檢測市售蓮蓉月餅的蕓豆成分

將市售的40 批次不同廠家不同種類的蓮蓉月餅進行DNA提取后，分別用普通PCR法和實時熒光PCR法檢測進行相互驗證，檢測結果見圖4、5及表2。

圖4 市售樣品檢測結果Fig. 4 Am p lification curves for commercial sam p les

圖5 蓮蓉制品中蕓豆成分DNA凝膠電泳圖譜Fig. 5 Gel electrophoresis of am p lified DNA from kidney bean in lotus seed paste product

通過以上實時熒光PCR和普通PCR比較結果表明，1、2、3、17、18這5 批含有蕓豆成分的蓮蓉月餅使用實時熒光PCR法檢測均呈現(xiàn)陽性擴增，與食品標簽標識完成一致；而使用普通PCR法檢測，17、18號樣品含有蕓豆成分未出現(xiàn)目的條帶，與食品標簽標識不一致，存在漏檢現(xiàn)象。標識純蓮蓉月餅的為20 種，實時熒光PCR法檢出有蕓豆成分為10 種，檢出率50%，普通PCR法檢出蕓豆成分為5 種，檢出率25%。未標示蓮蓉含量的月餅共15 種，實時熒光PCR法檢出有蕓豆成分為8種，檢出率53.3%，普通PCR法檢出蕓豆成分為4 種，檢出率26.7%。

表2 市售樣品用實時熒光PCR和普通PCR法檢測結果比對Tab le 2 Com parison of the results of real time fluorescence PCR and conventional PCR for commercial sam p les

3 討 論

熒光PCR自1995年由美國App lied Biosystem s公司推出開始問世，該技術不僅實現(xiàn)了PCR技術從定性到定量的飛躍，而且比普通PCR特異性更強、操作更加方便快捷，并有效地解決了常規(guī)PCR污染及對操作人員健康隱患的問題。目前，熒光PCR已經(jīng)得到了較為廣泛的應用。熒光定量PCR技術在常規(guī)PCR的基礎上，在PCR擴增過程中加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時，探針結合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步[26]。

本研究建立的蕓豆實時熒光PCR方法對蓮蓉制品中的蕓豆成分進行定性檢測，DNA質(zhì)量濃度靈敏度可到達1 pg/μL，比標準靈敏度0.5 ng提升近500 倍，含量檢測靈敏度可達到0.01%。對40 種市售月餅進行檢測，結果實時熒光PCR法蕓豆成分檢出率57.5%，普通PCR法蕓豆成分檢出率30%，實時熒光PCR法比普通PCR法檢出率高出將近一倍。對5 種外包裝標識有蕓豆成分的蓮蓉月餅檢測結果表明，實時熒光PCR法檢測準確率為100%，普通PCR法檢測準確率只有60%。由于蓮蓉制品為深加工產(chǎn)品，在加工過程中DNA遭到嚴重破壞，而且受物理、化學或生物等因子的影響使DNA質(zhì)量降低[27]，蓮蓉制品中還含有大量的糖分和油脂[28]，都是可能導致了普通PCR法檢測結果準確率不高的因素。而實時熒光PCR法由于靈敏度高，能實時記錄擴增情況，受干擾因素少，檢測準確度高，可免去電泳，無需觸毒，操作更簡便，也更快速、安全，因此更適合目前市場的檢測需求。

據(jù)相關報道[29-30]，目前國內(nèi)蓮蓉制品特別是蓮蓉月餅的餡料存在各種摻假現(xiàn)象，主要是在蓮蓉中摻入白蕓豆蓉，再加入蓮子香精制作出所謂的純蓮蓉餡料。在月餅國家標準中對蓮蓉餡料有著明確的規(guī)定，只有蓮籽質(zhì)量分數(shù)為100%，才可稱為純蓮蓉類。從以上檢測結果驗證了媒體的報道并非夸大其詞，蓮蓉摻假問題普遍存在。本方法，能更精準更快速的對蓮蓉摻假進行檢測，也可對有蓮蓉摻假行為的生產(chǎn)企業(yè)起到震懾作用，對打擊以次充好、以劣充優(yōu)的銷售亂象起重要作用。能更好地規(guī)范市場次序，保障好消費者權益和身體健康。

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A Real-Time PCR Assay for Rapid Detection of Kidney Bean Component in Lotus Seed Paste Product

SUN Liangguang1, HUANG Wenjing2,*
(Wuzhou Institutes Food and Drug Control, Wuzhou 543002, China)

Objective: This study aimed to establish a real-time PCR method for rapid detection of kidney bean components in Lotus seed paste product. Methods: Specific primers and probes were designed based on the highly conserved region of the pvsbe2 gene of Phaseolus coccineus L. Specificity was confi rmed by DNA amplification of lotus seeds and other starchrich plants. In addition, 1 ng/μL DNA of kidney bean was gradually diluted to determ ine its sensitivity. The DNA template of a mixture sample which contained 1% kidney bean and lotus seeds was 10-fold diluted to verify the weight sensitivity.And this method and PCR were applied to determ ine market samples for further validation. Results: This method had a high specificity which displayed no cross reaction w ith lotus seeds and other starch-rich plants. The sensitivity for detecting kidney bean DNA concentration and the proportion of kidney bean component were 1 pg/μL and 0.01%, respectively.The detection results indicated that positive amplification appeared in kidney bean present in lotus-seed-paste moon cake,which conformed to the food labels. Conclusions: The real-time fluorescent PCR method established in this study has the characteristics of high specificity and sensitivity and is suitable for fast detection of kidney bean component in lotus seed paste products.

Lotus seed paste product; kidney bean component; detection; real-time polymerase chain reaction

10.7506/spkx1002-6630-201722049

TS207.3

A

1002-6630（2017）22-0330-05

孫良廣, 黃文婧. 實時熒光PCR技術快速檢測蓮蓉制品中蕓豆成分[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 330-334. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722049. http://www.spkx.net.cn

SUN Liangguang, HU ANG Wenjing. A real-time PCR assay for rapid detection of kidney bean component in lotus seed paste product[J]. Food Science, 2017, 38(22): 330-334. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722049. http://www.spkx.net.cn

2016-11-08

孫良廣（1985—），男，主管中藥師，學士，主要從事食品藥品安全檢驗檢測研究。E-mail：sunliangguang＠163.com。

*通信作者：黃文婧（1984—），女，執(zhí)業(yè)藥師，學士，主要從事食品藥品安全檢驗檢測研究。E-mail：47990584@qq.com