錢卓真，湯水粉，羅方方，王麗娟，位紹紅

（1.廈門大學材料學院，福建 廈門 361005；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013）

石斑魚中阿維菌素類藥物多殘留測定及食用安全風險評估

錢卓真1,2，湯水粉2，羅方方2，王麗娟2，位紹紅2

（1.廈門大學材料學院，福建 廈門 361005；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013）

建立高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時定量檢測石斑魚血漿、肌肉組織、肝臟組織中阿維菌素、伊維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽方法。樣品經(jīng)乙腈提取，堿性氧化鋁固相萃取柱和LC-C18固相萃取柱串聯(lián)凈化，Thermo Hypersil Gold C18色譜柱分離，10 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸溶液和乙腈梯度洗脫，電噴霧正離子模式下以多反應監(jiān)測方式檢測，基質匹配法外標定量。分別以環(huán)境水體中阿維菌素上下限質量濃度（4、8 ng/m L）、伊維菌素上下限質量濃度（6、12 ng/m L）作為受試質量濃度開展生物富集、消除實驗，并對石斑魚的食用安全進行了風險評估。結果表明，阿維菌素和伊維菌素在2.5～200 ng/m L范圍內，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在0.25～20 ng/m L范圍內，線性回歸系數(shù)均大于0.99。方法檢出限分別為2.5、2.5、0.25 ng/m L（血漿），1、1、0.1 μg/kg（肌肉組織），2.5、2.5、0.25 μg/kg（肝臟組織），方法定量限分別為5、5、0.5 ng/m L（血漿），2、2、0.2 μg/kg（肌肉組織），5、5、0.5 μg/kg（肝臟組織）。3 個添加量的平均回收率為74.6%～93.6%，日內相對標準偏差為2.3%～10.9%，日間相對標準偏差為9.2%～12.6%。阿維菌素、伊維菌素均屬于非生物累積性物質，在石斑魚體內代謝規(guī)律相同，均按一級動力學過程從體內消除。本研究條件下，環(huán)境水體中藥物質量濃度是石斑魚肌肉組織中藥物殘留質量濃度及消除時間的重要因素。為保證食用安全，環(huán)境水體中阿維菌素質量濃度達到4～8 ng/m L時，石斑魚浸浴72 h后安全食用時間為22 d；環(huán)境水體中伊維菌素質量濃度達到6～12 ng/m L時，石斑魚浸浴72 h后安全食用時間為39 d。

石斑魚；阿維菌素類藥物殘留；食用安全風險評估

阿維菌素類藥物是現(xiàn)今廣泛使用的農用殺蟲劑，由鏈霉菌中阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，包括阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、伊維菌素等藥物[1-2]，結構見圖1。阿維菌素通過W ilk inson催化劑作用得到伊維菌素，而經(jīng)過化學結構修飾得到甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽。按照世界衛(wèi)生組織五級分類標準，阿維菌素類藥物具有神經(jīng)毒性和發(fā)育毒素[3]，仍將其列為高毒化合物。

圖1 阿維菌素（a）、伊維菌素（b）和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（c）的分子結構Fig. 1 M olecular structures of abamectin (a), ivermectin (b) and emamectin benzoate (c)

福建是我國石斑魚及制品的最大生產(chǎn)基地，并且遠銷國內外。石斑魚不僅具有極高的營養(yǎng)價值，且年產(chǎn)值超過百億元。然而隨著近年福建工農業(yè)的高速發(fā)展及城鎮(zhèn)化的推進，農業(yè)生產(chǎn)中大量使用的阿維菌素類殺蟲劑隨著各類環(huán)境遷徙進入水環(huán)境[4-5]。這不僅對水生環(huán)境造成危害[6-7]，而且對石斑魚產(chǎn)生非靶標毒害作用[8]，并造成石斑魚中阿維菌素類藥物殘留過剩。已有文獻報道多集中在動物肌肉組織、牛乳和植物中阿維菌素類藥物殘留測定[9-12]，而現(xiàn)有關于魚類組織中阿維菌素類藥物殘留測定的研究多集中在肌肉組織中單種藥物殘留測定，缺少對魚類各組織中多種阿維菌素類藥物同時測定的系統(tǒng)研究。本研究參考已有方法[13-14]，建立了石斑魚血漿、肌肉組織、肝臟組織中阿維菌素、伊維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽多殘留測定的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，該方法簡單、操作性強，且有良好的準確度和精密度。其次，依據(jù)本研究建立的殘留測定方法，對污染水體中阿維菌素、伊維菌素在石斑魚肌肉組織中的富集和消除規(guī)律進行研究，并進行食用安全性評估研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參照前期課題組開展的鱸魚實驗[15]，實驗用健康石斑魚共計300 尾，平均體質量200 g，飼養(yǎng)于福建省水產(chǎn)研究所水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗基地。實驗前對石斑魚進行暫養(yǎng)，保持水溫（25±2）℃，pH 8.0，鹽度30‰，正常充氣并投喂空白配合飼料，日飼量不超過初始體質量的3%，14 d后挑選體色活力均正常者進行給藥實驗。

標準品阿維菌素（純度92%）、伊維菌素（純度96%）、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（純度98%） 德國Dr. Ehrensorfer公司；乙腈、甲酸、乙酸乙酯、正己烷（均為色譜純） 美國Tidea公司；乙酸、無水硫酸鈉、乙酸銨、氯化鈉（均為化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；堿性氧化鋁固相萃取柱（500 mg，3 m L）、LC-C18固相萃取柱（500 m g，3 m L） 美國Supelco公司；Bond Elut C18固相萃取柱（500 m g，3 m L）美國Agilent公司；Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，3 m L） 美國Waters公司；0.22 μm尼龍微孔濾膜天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ ULTRA高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀 美國ThermoFisher Scientific公司；AB204-E型、PL203型電子分析天平 美國M ettler Toledo公司；DT5-5型低速臺式離心機、GT16-3高速臺式離心機 北京時代北利離心機有限公司；TDL-80-2B低速離心機 上海安亭科學儀器廠；MS3型旋渦混合器 德國IKA公司；ZZDCH16水浴氮吹儀 廣州智真生物科技有限公司；R系列旋轉蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；KQ3200E超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司；M illi-Q型超純水儀 美國M illipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取阿維菌素10.9 mg、伊維菌素10.4 mg、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽10.2 mg（稱取標準品的質量為按純度修正過的質量），用乙腈分別配制成100 μg/m L的標準儲備液；于-18 ℃條件下避光保存，有效期6 個月。準確移取阿維菌素標準儲備液100 μL、伊維菌素標準儲備液100 μL、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽標準儲備液10 μL，乙腈稀釋并定容至10 m L容量瓶，配制成混合標準中間液，于4 ℃條件下避光保存，有效期為1 個月。實驗采用基質匹配標準曲線法，現(xiàn)配現(xiàn)用，移取適量混合標準中間液，用空白血漿樣品提取液、空白肌肉樣品提取液、空白肝臟樣品提取液分別制作成3 條基質標準曲線。

1.3.2 田間試驗

阿維菌素噴灑至作物及土壤，模擬實際生產(chǎn)中藥物較嚴重漂移和用藥土壤流失的情況，連續(xù)一周測試該種植區(qū)附近水域中阿維菌素含量。收集到的水體混合均勻，避光冷藏待測。隨后，開展以伊維菌素為噴灑藥物的田間試驗，重復上述步驟。

1.3.3 生物富集、消除實驗

田間試驗表明，種植區(qū)附近污染水域中阿維菌素質量濃度為4～8 ng/m L，伊維菌素質量濃度為6～12 ng/m L。模擬種植區(qū)附近污染水域中阿維菌素藥物對石斑魚的影響，開展石斑魚單次浸浴單種藥物72 h的藥物富集及消除實驗。實驗組分為給藥組和對照組，每池約為70 尾魚。結合田間試驗獲得水中阿維菌素殘留質量濃度情況，即低質量濃度4 ng/m L和高質量濃度8 ng/m L，分別浸浴72 h，72 h后徹底換水；結合田間試驗獲得水中伊維菌素殘留質量濃度情況，即低質量濃度6 ng/m L和高質量濃度12 ng/m L，分別浸浴72 h，72 h后徹底換水。

分別于給藥后0.5、1.5、2.5、4.5、7.0、10.5、23.75、34.5、47.5、58.5、72.0、82.5、95.5、175、239.5、311.5、408、528 h和744 h時隨機撈取浸浴4 ng/m L阿維菌素的石斑魚進行樣品采集；分別于給藥后0.5、1.5、2.5、4.5、7.0、11.0、24.0、35.0、47.5、58.5、72.0、82.5、95.5、175.5、239.5、311.5、407.5、528、629.5、745.5 h和936 h隨機撈取浸浴8 ng/m L阿維菌素的石斑魚進行樣品采集；每個時間點3 尾石斑魚，每3 尾采集樣品混合作為一個樣，即每個時間點有3 個平行樣。

分別于給藥后0.5、1.25、2.25、4.25、7.5、11.0、24.5、34.5、48.0、59.0、72.0、82.5、97.0、144、216、312、408、528 h和600 h隨機撈取浸浴6 ng/m L伊維菌素的石斑魚進行樣品采集；分別于給藥后0.5、1.25、2.25、4.25、7.5、11.0、24.5、34.5、48.0、58.5、72.0、82.5、97.0、144、192、311.5、414、530、720.5、937 h和1 200 h隨機撈取浸浴12 ng/m L伊維菌素的石斑魚進行樣品采集；每個時間點3 尾石斑魚，每3 尾采集樣品混合作為一個樣。

1.3.4 儀器分析條件

Thermo Hypersil Gold C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫35 ℃；流動相A為10 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；流速0.25 m L/m in；梯度洗脫程序見表1。電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源正離子掃描模式；多反應監(jiān)測模式；噴霧電壓3 200 V；鞘氣壓力15 arb；輔助氣壓力5 arb；離子傳輸管溫度350 ℃；霧化室加熱溫度150 ℃；碰撞氣1.5 m torr；母離子、子離子和碰撞能量見表2；Q1半峰寬為0.7 D，Q3半峰寬為0.7 D。

表1 梯度洗脫程序Tab le 1 Gradient elution program

表2 阿維菌素、伊維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽質譜參數(shù)Table 2 M ass spectral parameters for abamectin, ivermectin and emamectin benzoate

1.3.5 血漿樣品前處理

準確量取石斑魚血漿1 m L于5 m L塑料離心管中，加入乙腈2 m L，渦旋混合1 m in，8 000 r/m in離心3 m in，取上清液于10 m L離心管。加入無水硫酸鈉1 g，渦旋30 s，3 000 r/m in離心5 m in。上清液轉入預先用5 m L乙腈活化的堿性氧化鋁固相萃取柱，并用5 m L乙腈洗滌堿性氧化鋁固相萃取柱，收集全部流出液。流出液在50 ℃條件下氮吹至干，加入梯度洗脫的初始流動相溶液1.0 m L超聲溶解，過0.22 μm濾膜后待測分析。

1.3.6 肌肉、肝臟樣品前處理

稱取試樣肌肉（5±0.05）、肝臟（2±0.02）g于100 m L塑料離心管中，加入無水硫酸鈉5 g，渦旋30 s。加入乙腈15 m L，渦旋1 m in，超聲10 m in，3 500 r/m in離心5 m in，再用乙腈10 m L重復提取離心1 次。合并上清液，轉入預先用5 m L乙腈活化的堿性氧化鋁固相萃取柱，并用6 m L乙腈洗滌堿性氧化鋁固相萃取柱，收集全部流出液至100 m L雞心瓶中，40 ℃條件下減壓旋轉蒸發(fā)至近干。

肌肉樣品處理：直接加入梯度洗脫的初始流動相溶液1.0 m L超聲溶解，過0.22 μm濾膜后待測分析。

肝臟樣品進一步凈化，加入2.5 m L乙腈超聲溶解，再加入乙腈飽和正己烷1 m L，渦旋混合1 min，3 000 r/m in離心5 m in，取下清液，加入水2.5 m L，混合備用。混合液轉入預先用5 m L乙腈、5 m L 50%乙腈溶液（體積比1∶1）活化的LC-C18固相萃取柱，3 m L水淋洗，8 m L酸化乙腈溶液（含0.3%乙酸）洗脫，收集所有洗脫液。洗脫液50 ℃氮吹至干，加入梯度洗脫的初始流動相溶液1.0 m L超聲溶解，過0.22 μm濾膜后待測分析。

1.3.7 生物富集系數(shù)

通常以生物富集系數(shù)（bio logical concen tration factor，BCF）作為描述生物對污染物質富集效應的指標，以此度量污染物在生物體累積的趨勢，按公式（1）計算。

式中：CB為阿維菌素類藥物在石斑魚肌肉組織中平均穩(wěn)態(tài)殘留濃度/（μmol/L）；CW為阿維菌素類藥物在水中平均濃度/（μmol/L）；K1為吸收速率常數(shù)；K2為消除速率常數(shù)。

研究表明，魚類對污染物的富集作用強弱與污染物的辛醇-水分配系數(shù)（Kow）、水溶解度（S）等密切相關[16-17]，如公式（2）、（3）所示。

1.3.8 食用安全評估

在食用安全性方面，可以根據(jù)消除后期測定的組織藥物質量濃度及規(guī)定的最高殘留限量（maximum residue lim it，MRL），計算各組織藥物質量濃度降至MRL所需時間（w ithdrawal time，WDT），按公式（4）計算：

式中：WDT為休藥期/d；MRL為最高殘留限量/（μg/kg）；Co為殘留消除半對數(shù)曲線的縱截距/（μg/kg）；Ke為殘留消除曲線速率常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用W inNonlin 5.2軟件非房室模型統(tǒng)計矩原理處理數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 色譜及質譜條件的優(yōu)化

圖2 阿維菌素類藥物在多反應監(jiān)測模式下總離子流圖Fig. 2 Total ion chrom atogram of avermectins under multip le reaction monitoring mode

3 種阿維菌素類藥物屬于分子質量大且極性較弱的化合物，適用于反相C18色譜柱分離。比較了甲醇和乙腈2 種有機相對分離度和峰形的影響。結果表明，以乙腈作為流動相，3 種阿維菌素類藥物峰形尖銳，響應值較大。阿維菌素、伊維菌素在ESI正離子源條件下，[M+Na]+和[M+NH4]+的離子化效率最高。選擇[M+Na]+作為母離子，得到的碎片峰信息不穩(wěn)定；而選擇[M+NH4]+作為母離子，可以得到穩(wěn)定且豐富的碎片離子[18]。其次，樣品基質對[M+Na]+具有明顯的基質抑制效應。因此，本研究選用[M+NH4]+作為母離子。在流動相中加入10 mmol/L乙酸銨溶液可以抑制[M+Na]+，促進母離子[M+NH4]+的響應值；同時加入0.1%甲酸溶液來增強待測物的離子化。在最佳色譜及質譜條件下，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、阿維菌素、伊維菌素保留時間分別為2.52、3.87、5.03 m in，標準品圖譜見圖2。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取

阿維菌素、伊維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽均屬于弱極性化合物，溶于有機溶劑。實驗考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈對3 種目標物的提取效果。結果表明，甲醇提取效率低，乙酸乙酯容易乳化，而乙腈不僅提取效率高，且利于后續(xù)的凈化[19]，所以最終選用乙腈作為提取劑。為了有效除去石斑魚組織中的水分，防止減壓旋轉時的爆沸現(xiàn)象，本研究采用無水硫酸鈉作為除水劑。

2.2.2 樣品凈化

常用的凈化方法有液液萃取法和固相萃取法。血漿和肌肉組織中脂肪含量較少，僅采用固相萃取凈化法。肝臟樣品基質較為復雜，脂含量高，因而采用液液萃取和固相萃取相結合的凈化方法。同時，本研究比較了不同類型的固相萃取柱的凈化效果。結果表明，堿性氧化鋁固相萃取柱和C18固相萃取柱的凈化效率相當，但C18固相萃取柱凈化步驟較為繁瑣，因此采用堿性氧化鋁固相萃取柱凈化血液及肌肉組織提取液。但肝臟組織的成分比較復雜，單獨采用堿性氧化鋁柱或C18柱均未能取得良好的凈化效果[20]。因此，本研究采用堿性氧化鋁固相萃取柱和C18固相萃取柱串聯(lián)凈化的方法進行凈化，取得良好的凈化效果。

圖3 洗脫液中乙酸比例（A）和洗脫液體積（B）對目標物回收率的影響Fig. 3 Effects of different proportions of acetic acid in the eluent (A)and eluent volumes (B) on recovery

表3 方法準確度和精密度測定結果（血漿）Tab le 3 Figures of merit of the method for the determ ination of analytes in p lasma

表4 方法準確度和精密度測定結果（肌肉組織）Table 4 Figures of merit of the method for the determ ination of analytes in muscle

表5 方法準確度和精密度測定結果（肝臟組織）Table 5 Figures of m erit of the m ethod for the determ ination of analytes in liver

實驗比較了LC-C18、Bond Elut C18和Oasis HLB串聯(lián)固相萃取柱對目標物凈化效果和回收率的影響。結果表明，LC-C18凈化效果最佳，總體回收率最高。實驗對串聯(lián)固相萃取柱LC-C18的淋洗液和洗脫液進行優(yōu)化。3 m L的純水淋洗液對目標物無損失；隨著淋洗液中乙腈比例的增大，目標物損失也隨著增大，故實驗選用純水作為淋洗液。洗脫液選用對目標化合物溶解性較好的乙腈溶液，同時加入一定量的酸，用于促進目標物從C18固相萃取柱上洗脫下來。由圖3A可知，洗脫液中乙酸的比例達到0.3%時，目標物基本可以全部被洗脫下來。為了較充分地將目標物洗脫下來，故選擇8 m L酸化乙腈（含0.3%乙酸）作為最終洗脫液體積，見圖3B。

2.3 標準曲線、線性范圍、檢出限和定量限

在電噴霧有機質譜電離條件下，生物樣品提取液具有明顯的基質抑制效應，這主要來源于血漿、肌肉、肝臟樣品中內源性物質[21]。為了消除基質效應帶來的定量偏差[22]，實驗采用基質匹配標準曲線法，移取適量混合標準中間液，用空白樣品提取液分別配制成不同質量濃度基質標準溶液，阿維菌素和伊維菌素質量濃度分別為2.5、5、10、25、50、100 ng/m L和200 ng/m L，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽質量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/m L和20 ng/m L。各組分質量濃度與其色譜峰面積呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)均大于0.99，如表3～5所示。

2.4 方法準確度和精密度

以陰性石斑魚血漿、肌肉組織、肝臟組織為研究對象，進行標準添加實驗，分別以低、中、高3 個添加水平進行加標回收實驗、每個質量濃度水平做6 個平行實驗，考察方法的準確度及精密度。如表3～5所示，血漿、肌肉組織、肝臟組織中藥物加標回收率在70%～110%，日內相對標準偏差不大于15%。15 d內血漿、肌肉組織、肝臟組織分別在中等添加水平下進行6 次加標實驗，考察方法日間精密度，相對標準偏差不大于15%。方法的精密度和準確度均能滿足藥物殘留監(jiān)測需求。

2.5 阿維菌素類藥物在石斑魚體內的生物富集

根據(jù)田間試驗，環(huán)境水體中阿維菌素類藥物質量濃度先迅速上升至一相對恒定質量濃度，前3 d阿維菌素、伊維菌素分別維持在質量濃度4～8 ng/m L和6～12 ng/m L，隨后在光照和水流的影響下逐漸降低，1 周后水體中阿維菌素類藥物質量濃度降低至檢測限以下。因此，前3 d是阿維菌素類藥物從水體進入石斑魚體內的主要蓄積時間。本研究從模擬的實際情況出發(fā)，分別以環(huán)境水體中阿維菌素類藥物上限、下限質量濃度作為受試質量濃度開展生物富集、消除實驗。

阿維菌素和伊維菌素Kow分別為9 900、1 615，根據(jù)公式（2），阿維菌素BCF為647，伊維菌素BCF為163；阿維菌素和伊維菌素S分別為7.8×10-3、4.0 mg/L，根據(jù)公式（3），阿維菌素BCF為9 551，伊維菌素BCF為283。然而在2 種水體質量濃度條件下，根據(jù)公式（1）求得的阿維菌素BCF分別為20.75、29.12，伊維菌素BCF分別為26.79、44.71，實際值均遠小于預測的BCF值，這可能與阿維菌素類藥物的相對分子質量和分子體積相關。Brooke等[23]研究表明污染物在魚體中的BCF值與污染物相對分子質量大小密切相關，相對分子質量小于350，BCF與相對分子質量呈現(xiàn)線性增長關系；而當相對分子質量大于350，BCF隨相對分子質量的增大而減小。大分子質量的阿維菌素、伊維菌素阻止了水體中的藥物透過魚鰓、皮膚的分子膜進入石斑魚，導致了較小的BCF值。這與實際實驗結果相符，肌肉組織中阿維菌素類藥物質量濃度較低，這與張衛(wèi)衛(wèi)[24]、邢麗紅[25]等的研究結果相似。Opperhuizen等[26]研究也表明疏水性化合物在魚體內的BCF值與其分子立體構型相關，當有機化合物的分子寬度大于0.95 nm，阻止向分子膜的轉運。分子體積較大的阿維菌素、伊維菌素不易由分子膜轉運，從而也導致了較小的BCF值。根據(jù)國際生物蓄積性標準BCF值大于5 000判斷，阿維菌素、伊維菌素均屬于非生物累積性物質。

2.6 石斑魚肌肉組織中藥物殘留規(guī)律及食用安全評估

圖4 阿維菌素（A）和伊維菌素（B）在石斑魚肌肉組織組織中的藥時曲線Fig. 4 Concentration-time relationships for abamectin (A) and ivermectin (B) in muscle tissue of grouper

肌肉是魚類最重要的可食組織，也是食品安全管理者和消費者共同關注的重點，因此應重點監(jiān)測肌肉組織中藥物殘留的含量。如圖4A所示，當環(huán)境水體中阿維菌素質量濃度達到4 ng/m L，2.5 h內肌肉組織中阿維菌素含量低于定量限，82.5 h達到峰值9.72 μg/kg，隨后阿維菌素含量逐漸下降，408 h（17 d）時降至定量限以下；而當環(huán)境水體中阿維菌素質量濃度達到8 ng/m L，1.5 h即可檢出阿維菌素，82.5 h達到峰值25.54 μg/kg，隨后阿維菌素含量逐漸下降，直到745.5 h（31 d）才未檢出阿維菌素。如圖4B所示，當環(huán)境水體中伊維菌素質量濃度達到6 ng/m L，1.25 h肌肉組織中伊維菌素含量為2.2 μg/kg，82.5 h達到峰值15.56 μg/kg，隨后伊維菌素含量逐漸下降，600 h（25 d）伊維菌素含量降至定量限；而當環(huán)境水體中伊維菌素質量濃度達到12 ng/m L，0.5 h時即可檢出伊維菌素，82.5 h達到峰值31.64 μg/kg，隨后伊維菌素含量緩慢減少，1 200 h（50 d）肌肉組織中伊維菌素含量才降至定量限。

綜合表明，石斑魚肌肉組織中阿維菌素含量隨著浸浴時間延長而快速上升，石斑魚肌肉組織對阿維菌素類藥物吸收較快，但蓄積濃度不高，滯留時間較長，消除較為緩慢。這與阿維菌素在鯽魚肌肉組織中的消除規(guī)律[27]、伊維菌素在虹鱒魚肌肉組織中的消除規(guī)律[28]和伊維菌素在吉富羅非魚肌肉組織中的消除規(guī)律[29]相似。阿維菌素、伊維菌素在石斑魚體內代謝規(guī)律相同，均按一級動力學過程從體內消除，但石斑魚肌肉組織中伊維菌素蓄積含量相對較高，消除較為緩慢，滯留時間更長。本研究石斑魚單次浸浴4、8 ng/m L阿維菌素海水72 h后，消除半衰期分別為107.12、143.48 h，平均滯留時間分別為175.43、205.78 h；單次浸浴6、12 ng/m L伊維菌素海水72 h后，消除半衰期分別為192.07、327.23 h，平均滯留時間分別為222.64、402.73 h。同一種藥物的消除半衰期和平均滯留時間均隨著環(huán)境水體中藥物質量濃度的增加而迅速地非線性增長，這說明同一種藥物的給藥劑量對該類藥物在石斑魚體內的代謝消除影響較大[30]。且肌肉組織中的藥物消除時間隨著環(huán)境水體中藥物質量濃度的升高而迅速增長，當環(huán)境水體中藥物質量濃度增至原水體質量濃度2 倍時，阿維菌素消除時間由原來408 h增至745.5 h，伊維菌素消除時間由原來600 h增至1 200 h。因此，在該研究條件下，環(huán)境水體中藥物質量濃度是石斑魚肌肉組織中藥物殘留質量濃度及消除時間的重要因素。

本研究中阿維菌素、伊維菌素是按照一級動力學過程從石斑魚體內消除的，即在消除后期服從指數(shù)消除：Ci = Co×e-Ket。2 種質量濃度條件下阿維菌素的Co分別為15.04、38.71，Ke分別為0.005、0.004；2 種質量濃度條件下伊維菌素的Co分別為22.51、33.53，Ke分別為0.004、0.002。但目前我國水產(chǎn)品無阿維菌素、伊維菌素MRL，以日本肯定列表中規(guī)定阿維菌素在鰻科類肌肉組織中的MRL為5 μg/kg，通過公式（4）計算，2 種質量濃度條件下阿維菌素在肌肉組織中的理論WDT值為220.26、511.67 h，即9、22 d。由于各國均未規(guī)定水產(chǎn)品中伊維菌素MRL，本實驗出于食用安全考慮，以同類藥物阿維菌素MRL作為伊維菌素的MRL，通過公式（4）計算，2 種質量濃度條件下伊維菌素在肌肉組織中的理論WDT值為376.13、951.50 h，即16、39 d。因此，為保證食用者的安全，環(huán)境水體中阿維菌素質量濃度達到4～8 ng/m L時，石斑魚浸浴72 h后安全食用時間為22 d；環(huán)境水體中伊維菌素質量濃度達到6～12 ng/m L時，石斑魚浸浴72 h后安全食用時間為39 d。

3 結 論

本研究系統(tǒng)地建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測石斑魚血漿、肌肉組織和肝臟組織中阿維菌素、伊維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留的方法，并對色譜條件、質譜條件、樣品提取凈化方法進行了優(yōu)化，方法靈敏度高，準確度、精密度和各項技術指標均滿足國內外殘留檢測的相關要求。同時在模擬實驗條件下，獲得種植區(qū)附近水域中阿維菌素類藥物含量，即阿維菌素質量濃度4～8 ng/m L、伊維菌素質量濃度6～12 ng/m L。以此作為受試質量濃度，采用研究所建立的檢測方法，開展污染水體中阿維菌素、伊維菌素在石斑魚肌肉組織中的富集、消除實驗，并進行石斑魚食用安全風險評估，有利于管理部門對水環(huán)境污染中的阿維菌素類藥物的危害有充分的認識，從而保障人們的食用安全健康。

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Determ ination and Food Safety Risk Assessment of Avermectin Residues in Grouper

QIAN Zhuozhen1,2, TANG Shuifen2, LUO Fangfang2, WANG Lijuan2, WEI Shaohong2
(1. College of Materials, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. Key Laboratory of Cultivation and High-Valued Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China)

A multi-residue method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLCMS/MS) was developed for the quantitative determ ination of abamectin, ivermectin and emamectin benzoate in grouper plasma, muscle and liver. The target analytes were extracted w ith acetonitrile and then cleaned up w ith an alkaline alum ina column/LC-C18SPE column. The analytes were separated on a Thermo Hypersil Gold C18column by gradient elution w ith 0.1% form ic acid-10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B, and detected by multiple reaction monitoring (MRM) w ith electrospray ionization (ESI) under positive ion mode. The target compounds were quantified by the matrix-matched external standard method. Both pesticides could move into water through various environmental routes. Therefore, the bioaccumulation and elim ination of avermectin and ivermectin in groupers were studied by bath administration at the upper and lower concentration limits (4 and 8 ng/m L for avermectin, and 6 and 12 ng/m L for ivermectin) in environmental water. Meanwhile, the food safety risk of the pesticide residues in fish was assessed. The results showed that the calibration curves were linear (R2＞ 0.99) in the concentration range of 2.5–200 ng/m L for abamectinand ivermectin and 0.25–20 ng/m L for emamectin benzoate. The lim its of detection (LOD) for abamectin, ivermectin and emamectin benzoate were 2.5, 2.5 and 0.25 ng/m L in plasma, 1, 1 and 0.1 μg/kg in muscle, 2.5, 2.5 and 0.25 μg/kg in liver,respectively. The limits of quantification (LOQ) were 5, 5 and 0.5 ng/m L in plasma, 2, 2 and 0.2 μg/kg in muscle, 5, 5 and 0.5 μg/kg in liver, respectively. The average recoveries at three spiked levels ranged from 74.6% to 93.6%. Intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) were 2.3%–10.9% and 9.2%–12.6%, respectively. Abamectin and ivermectin were no-bioaccumulative substances and their elim ination processes in grouper conformed to a fi rst order kinetics equation.Under the conditions of this study, drug concentration was an important factor affecting the residual drug concentration and elim ination time in grouper muscle tissues. Gouper was safe for consumption 22 and 39 days after 72 h bath adm inistration for 4–8 ng/m L abamectin and 6–12 ng/m L ivermectin, respectively.

grouper; avermectin residues; food safety risk assessment

2017-02-06

福建省海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目（閩臺重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術公共服務平臺，2014FJPT01）；廈門南方海洋研究中心項目（福建重要海洋經(jīng)濟生物種質庫與資源高效開發(fā)技術公共服務平臺，14PZY017NF17）；福建省海洋與漁業(yè)科技項目（KJXH-2010-007）；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項（閩海洋高新[2014]18號）；國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項（201505034-4）

錢卓真（1981—），女，助理研究員，博士，研究方向為海洋環(huán)境污染物及水產(chǎn)品質量安全。

E-mail：qianzhuozhen@126.com

10.7506/spkx1002-6630-201722046

R155.5

A

1002-6630（2017）22-0309-08

錢卓真, 湯水粉, 羅方方, 等. 石斑魚中阿維菌素類藥物多殘留測定及食用安全風險評估[J]. 食品科學, 2017, 38(22):309-316. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722046. http://www.spkx.net.cn

QIAN Zhuozhen, TANG Shuifen, LUO Fangfang, et al. Determ ination and food safety risk assessment of avermectin residues in grouper[J]. Food Science, 2017, 38(22): 309-316. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722046. http://www.spkx.net.cn