孫玉林，文 菁，趙 娟，田 麗，李 銳，陳道海,*

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院環(huán)北部灣海洋藥用動(dòng)物保護(hù)與利用研究所，廣東 湛江 524048）

響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及抗氧化活性測(cè)定

孫玉林1,2，文 菁1,2，趙 娟1,2，田 麗1，李 銳1，陳道海1,2,*

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院環(huán)北部灣海洋藥用動(dòng)物保護(hù)與利用研究所，廣東 湛江 524048）

研究胰蛋白酶提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及體外抗氧化活性，并與水提法和堿提法的多糖進(jìn)行比較。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取多糖的工藝，結(jié)果顯示最佳工藝條件為：酶解溫度55 ℃、料液比1∶40（g/m L）、酶解時(shí)間4 h、加酶量2.5%，此時(shí)虎斑烏賊肌肉多糖得率為4.15%，優(yōu)于水提法和堿提法的多糖得率。體外抗氧化活性研究表明酶法提取的多糖比堿提和水提的多糖具有更好的抗氧化活性，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/m L時(shí)，水提、堿提和酶提虎斑烏賊肌肉多糖對(duì)·OH的清除率分別為50.15%、55.14%和89.47%，其IC50值分別為4.51、3.56 mg/m L和0.82 mg/m L；對(duì)DPPH自由基的清除率分別為28.89%、31.48%和40.80%，其IC50值分別為16.66、15.43 mg/m L和11.50 mg/m L；對(duì)O2-·的清除率分別為75.43%、81.63%和97.00%，其IC50值分別為1.15、0.69 mg/m L和0.29 mg/m L；還原力大小分別為0.134、0.156和0.193。綜合分析表明，酶提法得到的多糖得率較高且具有較好的體外抗氧化活性。

虎斑烏賊；多糖；酶法提?。豁憫?yīng)面；抗氧化活性

虎斑烏賊（Sepia pharaonis）隸屬軟體動(dòng)物門(mén)（M o llusca），頭足綱（Cephalopoda），十腕目（Decapoda），烏賊科（Sepiidae），烏賊屬（Sepia）[1]，分布在菲律賓群島、馬來(lái)群島、大洋洲北部、東部和西部、印度近海、紅海以及我國(guó)的南海海域[2]。據(jù)《本草綱目》記載，烏賊肉具有活血化淤、補(bǔ)氣、補(bǔ)血、滋陰之功效，經(jīng)常食用能益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能[3]；烏賊骨（海螵蛸）具有除濕、斂瘡、治療胃病等作用；烏賊墨有抗癌、抗輻射、止血等作用。因此，虎斑烏賊是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均較高的優(yōu)良海產(chǎn)品品種。

多糖又稱(chēng)多聚糖，是一種由醛糖和（或）酮糖通過(guò)脫水形成糖苷鍵連接而成的鏈狀聚合物，具有廣泛的生物活性[4]，如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎等[5-11]。天然多糖類(lèi)化合物由于其來(lái)源廣泛、安全低毒、提取效率高、對(duì)自由基具有清除作用等優(yōu)點(diǎn)，有望作為無(wú)危害、綠色、新型抗氧化劑。近年來(lái)，除對(duì)擬目烏賊墨多糖[12]和性腺多糖[13-14]以及虎斑肌肉糖蛋白[15]的抗氧化活性有個(gè)別報(bào)道外，對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖抗氧化活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖，在對(duì)酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間和加酶量進(jìn)行單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。同時(shí)與水提法和堿提法進(jìn)行比較，以清除羥自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）能力和還原力大小作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析酶法提取對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖體外抗氧化性的影響，同時(shí)利用傅里葉紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步探討，以期為虎斑烏賊肌肉多糖在功能性食品上的綜合開(kāi)發(fā)與利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎斑烏賊購(gòu)于湛江市霞山水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，隨機(jī)選購(gòu)成體5 頭，每頭體質(zhì)量（1.5±0.5）kg，胴體長(zhǎng)（26±4）cm，胴寬（12±4）cm。

胰蛋白酶（＞250 NFU/mg） 美國(guó)Am resco公司；DPPH 美國(guó)Sigma公司；牛血清蛋白、干酪素、酪蛋白、鐵氰化鉀、三氯乙酸、30%過(guò)氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、考馬斯亮藍(lán)、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；LGJ-18A冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；DFY-200手提式高速中藥粉碎機(jī) 青州市三寶中藥機(jī)械廠；H/T18MM臺(tái)式離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；BCD-348WA/H電冰箱 科龍電器股份有限公司；90-1定時(shí)恒溫磁力攪拌器 金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C pH（酸度）計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司；SHZ-95B循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

虎斑烏賊解剖，除去表皮、內(nèi)臟，得烏賊肌肉，切碎，加適量蒸餾水用組織搗碎機(jī)打成勻漿狀，采用丙酮脫脂3 次，冷凍干燥、粉碎后得到虎斑烏賊肌肉凍干粉。

1.3.2 酶提取法

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在保持其他因素相同條件下，以胰蛋白酶為酶制劑，分別考察酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/m L），酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，加酶量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，考察各因素對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，每個(gè)因素平行試驗(yàn)3 次，取平均值。

1.3.2.2 提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度（A）、料液比（B）、酶解時(shí)間（C）和加酶量（D）這4 個(gè)因素為自變量進(jìn)行組合優(yōu)化，多糖得率（Y）為響應(yīng)值，平行試驗(yàn)3 次，進(jìn)行響應(yīng)面分析。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.3 水提取法

參照文獻(xiàn)[13]，按料液比1∶30（g/m L），90 ℃水浴提取1 h后，離心（4 000 r/m in，15 m in），取上清液旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/5，向濃縮液中加入3 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，離心（4 000 r/m in，15 m in）取沉淀，4 ℃透析48 h（每8 h換1 次水），冷凍干燥制備得水提多糖。

1.3.4 堿提取法

參照文獻(xiàn)[14]，按料液比1∶40（g/m L），于燒杯中加入相應(yīng)體積的0.3 mol/L NaOH溶液，80 ℃水浴提取3 h，離心（4 000 r/m in，15 m in），取上清液并使用鹽酸溶液調(diào)pH值至6.8～7.2，旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/5，向濃縮液中加入3 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，離心（4 000 r/m in，15 m in）取沉淀，4 ℃透析48 h（每8 h換1 次水），冷凍干燥制備得堿提多糖。

1.3.5 虎斑烏賊肌肉多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[16]。精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖配制成100 μg/m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，補(bǔ)水至2 m L，加入5.0%苯酚溶液1 m L，混勻后快速加入濃硫酸5.0 m L迅速搖勻，靜置30 m in冷卻至室溫，冷卻后于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度，以蒸餾水作為空白對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按公式（1）計(jì)算虎斑烏賊肌肉多糖得率：

式中：R為多糖得率/%；C為待測(cè)液中多糖質(zhì)量濃度/（mg/m L）；V為待測(cè)液體積/m L；N為稀釋倍數(shù)；m為虎斑烏賊肌肉干粉質(zhì)量/g。

1.3.6 虎斑烏賊肌肉多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 對(duì)·OH清除能力的測(cè)定

[17]，取1 m L不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，加入9 mmol/L FeSO4溶液1 m L，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 m L，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1m L，混勻后37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 m in，3 000 r/m in離心10 m in，取上清液測(cè)定其在波長(zhǎng)510 nm處的吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照組以雙蒸水代替多糖溶液，按公式（2）計(jì)算?OH清除率：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；Ax為加入多糖溶液的吸光度；A1為以雙蒸水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.6.2 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[18]，取2 m L不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，加入含0.2 mmol/L DPPH的無(wú)水乙醇溶液2 m L后混勻，在黑暗環(huán)境中常溫反應(yīng)30 m in，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：A1為2 m L多糖溶液加2 m L DPPH無(wú)水乙醇溶液的吸光度；A2為2 m L多糖溶液加2 m L無(wú)水乙醇的吸光度；A0為2 m L雙蒸水加2 mL DPPH無(wú)水乙醇溶液的吸光度。

1.3.6.3 對(duì)O2-?清除力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法，參照文獻(xiàn)[19]略作修改。取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.20）4.5 m L，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 m in，分別加入1.0 m L樣品溶液和0.5 m L 25 mol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 m in，加入8 mol/L鹽酸溶液1 m L終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)320 nm處測(cè)定吸光度A樣品，空白組以相同體積的蒸餾水代替樣品，測(cè)定吸光度A空白。對(duì)照組以相同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚，測(cè)定吸光度A對(duì)照。重復(fù)3 次，取平均值，按公式（4）計(jì)算O2-?清除率，并與VC對(duì)照比較。

1.3.7 多糖還原力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19-20]，取1.0 m L樣液，然后加入2.5 m L 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 m L 1%鐵氰化鉀溶液于試管中混勻?；旌衔镌?0 ℃水浴中反應(yīng)20 m in，迅速冷卻并加入2.5 m L 10%三氯乙酸溶液，混勻后以4 000 r/m in離心10 m in。取2.5 m L上清液加入0.5 m L 0.1%三氯化鐵溶液混勻，再加1 m L蒸餾水搖勻，以蒸餾水調(diào)零，室溫反應(yīng)10 m in后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。以去離子水代替樣品作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3 次平行，取平均值。并與VC對(duì)照比較。

1.3.8 紅外光譜分析

取2 mg干燥虎斑烏賊肌肉多糖，KBr壓片，Nicolet 6700傅里葉紅外光譜分析儀于4 000～400 cm-1區(qū)間掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3 次，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用苯酚-硫酸法測(cè)定得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=174.96X+0.657 9，R2=0.998 9。其中Y為吸光度，X為葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/m L）。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

圖1 酶解溫度對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis tem perature on the yield of polysaccharides

固定料液比1∶40，酶解時(shí)間4 h，加酶量2.5%，設(shè)置酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著酶解溫度的升高，多糖得率緩慢增加。當(dāng)酶解溫度超過(guò)55 ℃時(shí)，多糖得率反而快速下降，原因是酶為一類(lèi)具有最適反應(yīng)溫度范圍的物質(zhì)，酶解溫度過(guò)低會(huì)抑制酶的催化活力，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活，所以在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件下，確定最適酶解溫度為55 ℃。

2.2.2 料液比對(duì)多糖得率的影響

圖2 料液比對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 2 Effect of solid-to-water ratio on the yield of polysaccharides

固定酶解溫度5 5 ℃，酶解時(shí)間4 h，加酶量2.5%，設(shè)置料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/m L），考察料液比對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。料液比對(duì)多糖得率的影響較為明顯。隨著料液比的增加，多糖得率逐漸升高，當(dāng)料液比在1∶10～1∶40時(shí)，多糖得率增加明顯，當(dāng)料液比高于1∶40時(shí)，多糖得率開(kāi)始下降?？赡艿脑蚴橇弦罕扔绊懚嗵堑娜艹?，料液比較低時(shí)，溶液黏度較高不利于多糖的擴(kuò)散；料液比過(guò)高時(shí)，對(duì)酶濃度造成一定的稀釋?zhuān)焕诙嗵堑奶崛　＞C合節(jié)約資源以及后續(xù)離心、濃縮、醇沉等因素考慮，選擇1∶40為最適料液比。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides

固定酶解溫度55 ℃，料液比1∶40，加酶量2.5%，設(shè)置酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，考察酶解時(shí)間對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，虎斑烏賊肌肉多糖得率也隨之增加，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)多糖得率達(dá)到最大，超過(guò)4 h后多糖得率反而下降?？赡茉蚴欠磻?yīng)達(dá)4 h的時(shí)候，胰蛋白酶酶解作用已經(jīng)比較充分，使多糖最大限度的溶出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胰蛋白酶的催化活性開(kāi)始降低，為減少能耗，節(jié)約時(shí)間，選取4 h作為最適酶解時(shí)間。

2.2.4 加酶量對(duì)多糖得率的影響

圖4 加酶量對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 4 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharides

固定酶解溫度55 ℃，料液比1∶40，酶解時(shí)間4 h，設(shè)置加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，考察加酶量對(duì)虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)加酶量在1.0%～2.5%時(shí)，隨著酶添加量的增加，多糖得率增加明顯，在2.5%～3.0%范圍內(nèi)多糖得率增長(zhǎng)緩慢?？赡茉蚴请S著酶添加量的增加，增加了酶與底物的接觸機(jī)會(huì)，導(dǎo)致多糖較快的溶解出來(lái)，但當(dāng)溶液中酶濃度達(dá)到一定范圍時(shí)，多糖的溶出率已趨于最大化。因此，從節(jié)約成本的因素考慮，選擇2.5%為最適加酶量。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)酶解溫度（A）、料液比（B）、酶解時(shí)間（C）和加酶量（D）4 個(gè)因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面，優(yōu)化虎斑烏賊肌肉多糖提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立二次回歸模型，擬合的二次多元回歸方程為：Y=-91.953 45+2.759 10A+0.325 80B+3.223 41C+5.830 59D-4.234 50×10-4AB-3.147 50×10-3AC+3.326 00×10-3AD+0.011 082BC-0.029 484BD-0.132 61CD-0.024 981A2-3.364 03×10-3B2-0.378 16C2-0.878 40D2。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface methodology

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。此模型的P值小于0.000 1，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到高度顯著水平；失擬項(xiàng)P值為0.546 3大于0.05，不顯著，說(shuō)明該模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)擬合程度較好。R2為0.985 0表明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的適配度達(dá)到98.50%，具有較高的擬合度，實(shí)驗(yàn)誤差較小，可以利用該模型預(yù)測(cè)上述提取條件對(duì)多糖得率的影響。分析模型回歸方程系數(shù)的P值，C、BC、BD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)的影響高度顯著（P＜0.001），A、B、D、CD項(xiàng)影響顯著（P＜0.05），AB、AC、AD項(xiàng)影響不顯著。根據(jù)方差分析結(jié)果，消去不顯著項(xiàng)，擬合方程簡(jiǎn)化為：Y=-91.953 45+2.759 10A+0.325 80B+3.223 41C+5.830 59D+0.011 082BC-0.029 484BD-0.132 61CD-0.024 981A2-3.364 03×10-3B2-0.378 16C2-0.878 40D2。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface model

2.3.2 響應(yīng)面和等高線圖分析

圖5 各因素的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 5 Responsive surface and contour p lots show ing the interactive effects of variab les on the yield of polysaccharides

如圖5所示，等高線的形狀，反映了兩被測(cè)變量間交互作用顯著與否，橢圓形等高線表明兩被測(cè)變量間交互作用顯著，圓形等高線則意味著兩被測(cè)變量間交互作用不顯著[21]。料液比和酶解時(shí)間、料液比和加酶量以及酶解時(shí)間和加酶量的交互作用均為顯著。

2.3.3 驗(yàn)證與優(yōu)化

響應(yīng)面分析后的最優(yōu)提取條件為料液比1∶41.37、酶解溫度54.77 ℃、加酶量2.41%、酶解時(shí)間4.22 h，最高多糖得率為4.16%。采用響應(yīng)面優(yōu)化后的條件對(duì)提取條件驗(yàn)證，平行3 組實(shí)驗(yàn)，如表4所示，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.24%，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)酶提虎斑烏賊肌肉多糖提取工藝。

表4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Verification of the optim ized conditions

2.4 3 種提取方法獲得多糖得率比較

圖6 3 種提取方法獲得多糖得率比較Fig. 6 Comparison in the yields obtained with three extraction methods

由圖6可知，經(jīng)水提法、堿提法和酶提法獲得的虎斑烏賊肌肉多糖的得率分別為1.82%、2.89%和4.15%。酶提法獲得的多糖得率最高，分別是堿提法和水提法的1.44 倍和2.28 倍。對(duì)比這3 種提取方法，酶提法要優(yōu)于堿提法和水提法，可能的原因是胰蛋白酶專(zhuān)一性好，能夠水解由賴(lài)氨酸、精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鍵，在提取過(guò)程中能除去大部分蛋白質(zhì)，水解產(chǎn)物純凈，多糖純度較高；堿提法雖然提取率較高，但容易將多糖斷裂成小分子單糖，使多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，另外，還容易將一些雜質(zhì)一并提取出來(lái)，導(dǎo)致多糖純度不高；水提法雖然提取工藝簡(jiǎn)單，成本較低，但提取率不高，多糖含量較低。此外，水提、堿提和酶提這3 種方法所獲得多糖中的總糖含量分別為73.12%、68.05%和86.54%。

2.5 虎斑烏賊肌肉多糖體外抗氧化活性

2.5.1 虎斑烏賊肌肉多糖對(duì)·OH清除能力的比較

?OH是一種對(duì)人體危害極大的活潑自由基，在Fe2+作催化劑的條件下，H2O2容易產(chǎn)生?OH，多糖具有螯合Fe2+的能力，從而可以間接地抑制·OH的生成。如圖7所示，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3 種提取方法得到的多糖對(duì)·OH均有一定清除能力，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其清除·OH能力也相應(yīng)增加，呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系。在質(zhì)量濃度為0.5～4.0 mg/m L范圍內(nèi)，酶提多糖具有較高的清除能力，遠(yuǎn)高于水提和堿提多糖。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/m L時(shí)，水提、堿提和酶提多糖以及VC對(duì)·OH的清除率分別為50.15%、55.14%、89.47%和94.33%。不同提取方法獲得的多糖對(duì)·OH的清除能力有差異，清除能力大小順序?yàn)椋好柑岱ǎ緣A提法＞水提法。

圖7 虎斑烏賊肌肉多糖和VC對(duì)·OH的清除作用Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

2.5.2 虎斑烏賊肌肉多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的比較

圖8 虎斑烏賊肌肉多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig. 8 DPPH radical scavenging capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

自由基清除劑對(duì)DPPH自由基的清除程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，即與抗氧化劑的供氫能力有關(guān)。如圖8所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，水提、堿提和酶提多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的升高而增加緩慢，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/m L時(shí)，水提、堿提和酶提多糖對(duì)DPPH自由基的清除率分別為28.89%、31.48%和40.80%，與VC（98.69%）相比，其清除率均較弱。

2.5.3 虎斑烏賊肌肉多糖對(duì)O2-?清除能力的比較

O2-?是生物體內(nèi)第1個(gè)氧自由基，是其他活性氧的前體，對(duì)生物體內(nèi)細(xì)胞、酶、DNA及不飽和脂肪酸等物質(zhì)均能產(chǎn)生影響。如圖9所示，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其清除O2-?能力也相應(yīng)增加，說(shuō)明多糖質(zhì)量濃度與清除能力呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為2～4 mg/m L范圍內(nèi)，酶提多糖對(duì)O2-?具有更好的清除活性，遠(yuǎn)高于水提和堿提多糖。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/m L時(shí)，水提、堿提和酶提多糖以及VC對(duì)O2-?的清除率分別為75.43%、81.63%、97.00%和87.10%。3 種提取方法獲得的多糖對(duì)O2-?的清除能力大小順序?yàn)椋好柑岱ǎ緣A提法＞水提法。

圖9 虎斑烏賊肌肉多糖和VC對(duì)O－2?的清除作用Fig. 9 Superoxide anion radical scavenging capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

2.5.4 虎斑烏賊肌肉多糖還原力的比較

圖10 虎斑烏賊肌肉多糖和VC的還原力測(cè)定Fig. 10 Reducing capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

如圖10所示，虎斑烏賊肌肉多糖的還原力大小與多糖質(zhì)量濃度的增加呈正相關(guān)。不同提取方法獲得的多糖樣品還原力有差異，酶提多糖還原力高于堿提多糖和水提多糖。與VC相比，在0.5～4.0 mg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3 種提取方法得到的多糖還原力遠(yuǎn)低于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度為4.0 mg/m L時(shí)，水提、堿提和酶提多糖還原能力分別為0.134、0.156和0.193。而在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC的還原力均在0.97以上。

2.6 3 種方法提取的多糖對(duì)3 種自由基半清除率濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）比較

表5 3 種方法提取的多糖對(duì)3 種自由基IC50比較Table 5 Com paring results of IC50 values of the three polysaccharides extracted by different methods for free radical scavenging

由表5可以看出，水提多糖對(duì)·OH、DPPH自由基和O2-?的IC50值分別為4.51、16.66 mg/m L和1.15 mg/m L；堿提多糖分別為3.56、15.43 mg/m L和0.69 mg/m L；酶提多糖分別為0.82、11.50 mg/m L和0.29 mg/m L。3 種提取方法對(duì)DPPH自由基和O2-?的IC50值均高于VC的IC50值（0.01 mg/m L和0.08 mg/m L），但對(duì)·OH而言，酶提多糖的IC50值（0.82 mg/m L）要低于VC（1.03 mg/m L）。3 種提取方法得到的多糖對(duì)3 種自由基的IC50值有差異，酶提多糖對(duì)·OH、DPPH自由基和O2-?的IC50值最低，清除效果最好。

2.7 虎斑烏賊肌肉多糖紅外光譜分析

圖11 3 種方法提取的虎斑烏賊肌肉多糖的紅外譜圖Fig. 11 Infrared spectra of the polysaccharides extracted by different methods

如圖11所示，在3 600～3 200 cm-1處，3 種提取物各出現(xiàn)一個(gè)吸收較強(qiáng)的寬峰：3 420.16、3 389.46 cm-1和3 421.23 cm-1，為—OH伸縮振動(dòng)峰。在3 000～2 800 cm-1范圍出現(xiàn)弱的吸收：2 959.35、2 933.57 cm-1和2 960.70 cm-1，為C—H伸縮振動(dòng)峰。在1 400～1 200 cm-1處存在C—H變角振動(dòng)，分別為1 399.81、1 397.55 cm-1和1 399.16 cm-1吸收峰。在1 200～1 000 cm-1處的吸收峰是由吡喃糖環(huán)的醚鍵（C—O—C）和—OH伸縮振動(dòng)引起的，其吸收峰分別是1 168.68、1 076.97 cm-1和1 021.35 cm-1，此4 組吸收峰均是糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰[22]，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)3 種方法獲得的提取物均為多糖類(lèi)物質(zhì)。另外，1 654.66、1 653.41 cm-1和1 653.85 cm-1處分別有一強(qiáng)的吸收峰，為酰胺Ⅰ帶的吸收峰；1 558.26、1 545.27 cm-1和1 555.84 cm-1是N—H的變角振動(dòng)，為酰胺Ⅱ帶的吸收峰，證明這3 種提取物中有少量與糖結(jié)合的蛋白（如糖蛋白）存在[23]。592.95、622.54 cm-1和590.99 cm-1是O—H面外彎曲振動(dòng)吸收峰[24]。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并與水提法和堿提法進(jìn)行比較，結(jié)果表明：虎斑烏賊肌肉多糖酶提法的最佳工藝條件為酶解溫度55 ℃、料液比1∶40、酶解時(shí)間4 h、加酶量2.5%，在此條件下，虎斑烏賊肌肉多糖得率為4.15%，優(yōu)于水提法（1.82%）和堿提法（2.89%），并且也顯著高于其他海洋動(dòng)物中多糖提取的得率，如擬目烏賊[13]、蛤蜊[25]、牡蠣[26]等。

水提、堿提和酶提虎斑烏賊肌肉多糖在質(zhì)量濃度為4 mg/m L條件下，對(duì)·OH的清除率分別為50.15%、55.14%和89.47%，其IC50值分別為4.51、3.56 mg/m L和0.82 mg/m L；對(duì)DPPH自由基的清除率分別為28.89%、31.48%和40.80%，其IC50值分別為16.66、15.43 mg/m L和11.50 m g/m L；對(duì)O2-?的清除率分別為75.43%、81.63%和97.00%，其IC50值分別為1.15、0.69 mg/m L和0.29 mg/m L。還原力大小分別為0.134、0.156和0.193。戴宏杰等[13]研究擬目烏賊生殖腺多糖在質(zhì)量濃度為10 mg/m L條件下，對(duì)·OH清除率為39.77%；對(duì)O2-?清除率約為70%。殷紅玲等[27]采用酶液提取的蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖，在質(zhì)量濃度為6.5 mg/m L條件下，對(duì)·OH清除率才達(dá)到84.75%，其IC50值為1.3 mg/m L。羅曉航等[28]研究結(jié)果表明酶法提取鮑魚(yú)臟器粗多糖對(duì)·OH的IC50值為20 mg/m L，對(duì)O2-?的清除能力非常低，當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，清除率也僅為25.40%，其IC50值為41.5 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)酶法提取多糖的抗氧化活性略高于上述報(bào)道結(jié)果。陳煉紅等[29]采用復(fù)合酶法提取松茸多糖，該糖對(duì)O2-?和DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，其IC50值分別為0.565 mg/m L和0.454 mg/m L。宋海燕等[30]采用纖維素酶提取五味子多糖，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行探討，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/m L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)71.8%。宋紅志等[31]研究表明采用超聲波輔助復(fù)合酶法提取的6 種桑黃粗多糖樣品對(duì)DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除活性，其IC50值均小于2 mg/m L。王雪等[32]研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖在質(zhì)量濃度為2 mg/m L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)90%，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果略高于本實(shí)驗(yàn)的抗氧化活性結(jié)果。程知慶等[33]研究干燥方法對(duì)瘤背石磺多糖還原力的影響，結(jié)果表明凍干多糖和烘干多糖均沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/m L時(shí)，還原能力約0.15，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相近。

人工合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚和特丁基對(duì)苯二酚等，目前已被廣泛用作食品添加劑，然而這些抗氧化劑可能有誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的潛在危險(xiǎn)[34]。因此，對(duì)開(kāi)發(fā)具有無(wú)危害、天然、新型抗氧化劑具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中虎斑烏賊肌肉多糖多具有一定的抗氧化能力，尤其是對(duì)·OH的清除效果較好，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，可作為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)利用。后續(xù)研究將會(huì)對(duì)這3 種提取方法得到的多糖進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)表征和其他生物活性探討。

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Optimization of Enzymatic Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from the Muscle of Sepia pharaonis Using Response Surface Methodology

SUN Yulin1,2, WEN Jing1,2, ZHAO Juan1,2, TIAN Li1, LI Rui1, CHEN Daohai1,2,*
(1. School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China; 2. Round Beibu Gulf Institute for the Protection and Utilization of Marine Animals in Medicine, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China)

The trypsin-assisted extraction of polysaccharides from the muscle of cuttlefish (Sepia pharaonis) was optim ized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The in vitro antioxidant activity of the obtained polysaccharides was assessed and compared w ith that of those obtained by water extraction and alkali extraction.The optimum extraction conditions were determ ined as follow s: hydrolysis temperature, 55 ℃; solid-to-water ratio,1:40 (g/m L); hydrolysis time, 4 h; and trysin dosage, 2.5%. Under these conditions, the maximum polysaccharide yield of 4.15% was obtained, which was higher than those extracted w ith water and alkali. The antioxidant tests in vitro showed that the enzymatically extracted polysaccharide displayed higher antioxidant activity than the water- and alkali-extracted ones.At a concentration of 4 mg/m L, the percentage scavenging of hydroxyl radical by the polysaccharides extracted w ith water,alkali and trypsin were 50.15%, 55.14% and 89.47%, w ith median inhibition concentration (IC50) values of 4.51, 3.56 and 0.82 mg/m L, respectively; the percentage scavenging of DPPH radical were 28.89%, 31.48% and 40.80% w ith IC50values of 16.66, 15.43 and 11.50 mg/m L, respectively; and the percentage scavenging of superoxide anion radical were 75.43%,81.63% and 97.00% w ith IC50values of 1.15, 0.69 and 0.29 mg/m L, respectively. The reducing capacity values of the three polysaccharides were 0.134, 0.156 and 0.193, respectively. Collectively, it was shown that the yield of enzymaticallyextracted polysaccharides was higher and the polysaccharides had higher antioxidant activity in vitro. The polysaccharides from the muscle of S. pharaonis have the potential to be a new non-hazardous and natural antioxidant.

Sepia pharaonis; polysaccharides; enzymatic extraction; response surface methodology; antioxidant activity

2017-01-19

廣東省科技廳項(xiàng)目（2014B040404071；2015A070708013；2015A030302089）；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研合作專(zhuān)題項(xiàng)目（2013B090500036）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030310406；2017A030307029）；廣東省高等教育“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”項(xiàng)目（2016KTSCX081）；湛江市財(cái)政資金科技專(zhuān)項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)性分配項(xiàng)目（2015A06008；2015A03017；2014A03011）；嶺南師范學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目（ZL1313）；嶺南師范學(xué)院自然科學(xué)研究合作項(xiàng)目（HL1402）

孫玉林（1980—），男，講師，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：sunyulin07002@126.com

*通信作者：陳道海（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幱脛?dòng)物開(kāi)發(fā)利用與保護(hù)。E-mail：dhchen11@21cn.com

10.7506/spkx1002-6630-201722037

TS201.2

A

1002-6630（2017）22-0246-10

孫玉林, 文菁, 趙娟, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及抗氧化活性測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):246-255. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722037. http://www.spkx.net.cn

SUN Yulin, WEN Jing, ZHAO Juan, et al. Optim ization of enzymatic extraction and antioxidant activity of polysaccharides from the muscle of Sepia pharaonis using response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(22): 246-255. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722037. http://www.spkx.net.cn