秦騰飛，贠婷婷，王春玲*，綦文濤,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2.國家糧食局科學研究院，北京 100037）

發(fā)酵前包被布拉迪酵母生長代謝及其抗逆性機理

秦騰飛1,2，贠婷婷2，王春玲1,*，綦文濤2,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2.國家糧食局科學研究院，北京 100037）

以布拉迪酵母為研究對象，以海藻酸鹽為制備材料，基于內(nèi)源乳化凝膠化法，對酵母菌進行了發(fā)酵前包被和包被后培養(yǎng)。以未包被游離酵母菌為對照，研究了其包被后的生長和代謝特點，并探討其抗逆性機理。結(jié)果表明，相對于游離培養(yǎng)，微膠囊化包被的布拉迪酵母最終活菌數(shù)顯著增多，并有更多的乙醇生成；微膠囊化布拉迪酵母的胞外甘油濃度下降明顯，而胞內(nèi)甘油濃度則顯著升高，可比游離條件下高出157.3%；此外，微膠囊化布拉迪酵母的胞內(nèi)海藻糖含量比游離條件顯著提高110.3%。結(jié)論：微膠囊內(nèi)部微環(huán)境為布拉迪酵母提供了更穩(wěn)定的增殖空間，并使其代謝向著有利于甘油和海藻糖積累的途徑進行，從而提高了細胞的抗脅迫能力。

布拉迪酵母；微膠囊化發(fā)酵前包被；生長和代謝；抗逆性

隨著生活水平不斷提高，越來越多的消費者想通過飲食而達到保健的目的，為迎合人們的需求，市場上出現(xiàn)了各式各樣的益生菌食品及微生態(tài)制劑。益生菌是人體腸道重要的生理菌，具有形成生物屏障阻止有害菌的入侵和感染、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高機體免疫力等作用[1]；此外，還具有緩解乳糖不耐癥、減輕遺傳性過敏癥狀、抑制結(jié)腸癌等生理功能[2]。然而，益生菌產(chǎn)品在制備、貯藏過程中以及通過人體胃酸、膽堿、胰酶等不利環(huán)境后活菌率大大下降[3]。為解決上述問題，研究者也在積極探索提高益生菌制劑有效性的方法，包括新菌種的篩選和新劑型的構(gòu)建等[4-5]。在新劑型的構(gòu)建方面，微膠囊技術(shù)一直是比較熱門的選擇，研究也較多[6-7]。目前針對微生物細胞的微膠囊包被可分為發(fā)酵前包被和發(fā)酵后包被，發(fā)酵前包被的特點是，將少量微生物細胞作為種子包被入微膠囊后，再次進行發(fā)酵，使微生物在微膠囊形成的微環(huán)境中繼續(xù)增殖代謝，從而實現(xiàn)其高密度和高活性的目的。由于這種發(fā)酵前包被細胞的高密度團塊式生長，更有利于微生物細胞抵抗外界脅迫等不利環(huán)境[8]。

發(fā)酵前包被微膠囊化益生菌的抗脅迫能力已有諸多報道[9-10]，然而對其抗脅迫的機理還需要深入研究。在微膠囊環(huán)境中，由于微生物細胞成團塊狀增殖和代謝[11]，有研究報道，這種高密度的團塊式生長會引起微生物細胞間的群體感應[12]，而群體感應是引起微生物細胞諸多特殊現(xiàn)象的根本原因，如菌體發(fā)光、抗生素的合成、生物膜的形成抗外界脅迫、胞外多糖的合成及黏附宿主腸表皮細胞等[13]。還有研究報道，高壓靜電法制備的微膠囊化酵母菌，其胞內(nèi)海藻糖和甘油的濃度會發(fā)生變化，從而會提高酵母菌對高滲透壓、長時間貯存等不利條件的影響[14]。相對于高壓靜電法，乳化凝膠化更適合于規(guī)?；l(fā)酵前包被益生菌的生產(chǎn)過程[15]?；诖耍狙芯恳圆祭辖湍笧檠芯繉ο?，以海藻酸鹽為制備材料，研究了酵母菌在基于內(nèi)源乳化凝膠化法制備的微膠囊內(nèi)的生長和代謝特點，并對其胞內(nèi)抗脅迫相關(guān)物質(zhì)的變化進行了檢測，以探討其抗脅迫的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布拉迪酵母由國家糧食局科學研究院實驗室保藏；海藻酸鈉、碳酸鈣、冰醋酸、氯化鈣、石蠟、Span 80、吐溫80、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）、檸檬酸三鈉、蒽酮、濃硫酸、三氯乙酸（均為分析純）、海藻糖標準品 國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖試劑盒、甘油試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙醇試劑盒美國BioAssays公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M LS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器 日本Panasonic公司；離心機 德國Eppendorf公司；Multiskan FC型酶標儀、超凈工作臺 塞默飛世爾（上海）儀器有限公司；精密增力電動攪拌器 常州國華電器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 布拉迪酵母微膠囊的制備

益生菌微膠囊的制備參考梁新曉等[16]方法，以海藻酸鈉為主要材料，按碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比1∶4稱取碳酸鈣，分散于少量蒸餾水中，加入1 m L 2.1×109CFU/m L布拉迪酵母種子液，補充無菌水，使海藻酸鈉的終質(zhì)量分數(shù)為2%，攪拌均勻，作為水相；表面活性劑Span 80充分分散于液體石蠟中作為油相，按水油體積比1∶3～1∶4，向油相中加入水相，以400 r/m in攪拌5 m in形成穩(wěn)定的乳化液；向其中加入180 μL冰酸醋酸使碳酸鈣解離出Ca2+，與海藻酸鈉產(chǎn)生凝膠化反應，并固定10 m in形成海藻酸鈣微膠囊；最后用去離子水多次沖洗，通過分液漏斗分離沉降含有布拉迪酵母菌的海藻酸鈣微膠囊。通過光學顯微鏡進行微膠囊在培養(yǎng)前后的形態(tài)學觀察。

1.3.2 布拉迪酵母生長曲線的繪制

以未包被游離布拉迪酵母作為對照，以微膠囊化布拉迪酵母為實驗組，實驗組和對照組分別做3個平行，培養(yǎng)基為YPD（其中包含20 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母膏），置于溫度為30 ℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，并分別于不同培養(yǎng)時間取樣分析活菌數(shù)。布拉迪酵母生長曲線采用活菌計數(shù)法，即首先將包被布拉迪酵母的微膠囊用破囊液進行破壁，以釋放酵母菌細胞，其中破囊液的成分為pH 6.5、0.055～0.060 mol/L的檸檬酸三鈉溶液；然后通過振蕩將成團塊的酵母菌盡可能分散成單個細胞，并通過常規(guī)涂布法進行酵母菌活細胞的計數(shù)；最后以培養(yǎng)時間為橫坐標，以活菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標，繪制布拉迪酵母生長曲線。

1.3.3 布拉迪酵母葡萄糖消耗量的測定

葡萄糖消耗量的測定采用葡萄糖測定試劑盒測定。原理：葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，后者在過氧化物酶（peroxidase，POD）的作用下，將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)合成紅色的醌類化合物，用酶標儀檢測OD值。檢測方法：工作液的配制：R1試劑（苯酚）與R2試劑（磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、4-氨基安替比林、POD、NaN3、GOD）等量混合均勻。在37 ℃條件下，將1 000 μL工作液與10 μL酵母發(fā)酵上清液充分混勻，置于37 ℃水浴15 m in。顯色后顏色穩(wěn)定2 h。在波長505 nm處，以空白調(diào)零，讀取校準管和樣品管的OD值。以葡萄糖濃度為橫坐標，以O(shè)D505nm為縱坐標，繪制布拉迪酵母的葡萄糖消耗曲線。葡萄糖濃度計算如下式所示：

1.3.4 布拉迪酵母乙醇生成量的測定

發(fā)酵液中乙醇含量采用乙醇試劑盒進行測定，即基于乙醇脫氫酶催化氧化乙醇，生成的NADH與噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium b rom ide，M TT）發(fā)生反應，并伴隨著顏色的變化，生成灰色物質(zhì)，利用酶標儀測在560 nm波長處的OD值，其具體操作如下：1）按質(zhì)量分數(shù)0.10%、0.06%、0.03%、0%配制乙醇標準品；2）取10 μL樣品于酶標孔內(nèi)，然后加入90 μL 工作液（80 μL Assay Buffer、1 μL Enzyme M ix、2.5 μL NAD和14 μL MTT混合），在室溫下反應30 m in，后終止反應，利用酶標儀于560 nm條件下測其OD值。得出乙醇的標準曲線和回歸方程（y=4.356 3x+0.002 4，R2=0.999），并根據(jù)樣品的OD560nm和標準品曲線計算出樣品的乙醇質(zhì)量分數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以乙醇質(zhì)量分數(shù)為縱坐標，繪制布拉迪酵母乙醇代謝曲線。

1.3.5 布拉迪酵母胞內(nèi)外甘油濃度的測定

甘油濃度采用酶試劑盒測定。即在ATP存在條件下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫；在POD的作用下生成有色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，在550 nm波長條件下的OD值與甘油濃度成正比。操作方法具體為：1）按照1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 μmol/L的濃度配制甘油標準品；2）取50 μL標準品加入150 μL工作液于酶標板孔內(nèi)，37 ℃反應20 m in，利用酶標儀在550 nm波長下檢測其OD值，并繪制其標準曲線和回歸方程（y=0.000 8x+0.004 9，R2=0.999）；3）胞外發(fā)酵液中甘油的測定：取1 m L發(fā)酵液，4 000 r/m in轉(zhuǎn)速下離心10 m in，取50 μL上清液，加入150 μL工作液于酶標板孔，37 ℃反應20 m in，于550 nm波長條件下檢測其OD值，根據(jù)甘油標準曲線計算胞外發(fā)酵液中甘油濃度；4）離心收集細胞，沸水浴10 m in提取胞內(nèi)甘油，并采用上述方法檢測其濃度。

1.3.6 布拉迪酵母胞內(nèi)海藻糖含量的測定

胞內(nèi)海藻糖含量的測定采用海藻糖試劑盒，基于硫酸蒽酮比色法測定[17]。即糖類在硫酸作用下，脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，然后蒽酮與糠醛或羥甲基糠醛經(jīng)過脫水縮合，產(chǎn)生藍綠色的糠醛衍生物，顏色的深淺即可作為定量的依據(jù)。過程如下：1）按照200、100、50、25、12.5、6.25、0 mg/L的質(zhì)量濃度配制海藻糖標準品溶液，分別取上述海藻糖溶液0.5 m L，加入2.5 m L蒽酮溶液，95 ℃水浴加熱10 m in，冷卻后用酶標儀測定在620 nm波長條件下的OD值，得到標準曲線和回歸方程（y=0.004 6+0.026 8，R2=0.996）；2）海藻糖提?。? 000 r/m in離心分離酵母菌細胞，加入4 m L 0.5 mol/L三氯乙酸溶液，振蕩均勻后置于帶有冰塊的冰水混合物中進行萃取，此時所得溶液中僅有海藻糖存在[18]，將提取液3 000 r/m in離心分離10 m in，取0.5 m L稀釋好的提取液，加入2.5 m L 蒽酮溶液，充分混勻，沸水煮10 m in，冷卻后用酶標儀測定其在波長620 nm條件下的OD值，最后根據(jù)海藻糖標準曲線計算其含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)表示為 ±s（n=3）。各檢測指標采用Excel 2007進行統(tǒng)計分析，以P小于0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前與發(fā)酵后布拉迪酵母微膠囊形態(tài)

圖1 酵前包被布拉迪酵母微膠囊的光學顯微鏡圖（×40）Fig. 1 Pre-m icroencapsulated Saccharomyces boulardii under optical m icroscope (×40)

通過乳化凝膠化法制備布拉迪酵母微膠囊，發(fā)酵前（圖1A）布拉迪酵母細胞均勻分散于微膠囊內(nèi)部，由于細胞未增殖，因此密度低，微膠囊成透明球型。發(fā)酵24 h后（圖1B），布拉迪酵母細胞充滿了整個微膠囊內(nèi)部，且呈大小不一的團塊狀分布于微膠囊內(nèi)部（圖1C）。

2.2 微膠囊化布拉迪酵母生長和代謝特點

圖2 布拉迪酵母生長曲線對比圖Fig. 2 G row th curves of free and m icroencapsulated Saccharomyces bou lardii

如圖2所示，游離培養(yǎng)條件下的布拉迪酵母，24 h內(nèi)呈現(xiàn)出標準的S型增長過程，其最終活菌數(shù)為4.7×1010CFU/m L，相對于游離培養(yǎng)，微膠囊化的布拉迪酵母生長延遲期較短，并體現(xiàn)出了顯著更高最終活菌數(shù)（P＜0.05），其最終活菌數(shù)可達2.4×1012CFU/m L，但其對數(shù)生長期的生長速率略低于游離培養(yǎng)。

圖4 布拉迪酵母乙醇生成曲線對比圖Fig. 4 Ethanol generation curves of free and m icroencapsulated Saccharomyces boulardii

由圖3可見，與游離組相比，微膠囊化布拉迪酵母的初始葡萄糖代謝速率較快，這與其較短的延遲期有關(guān)，但游離培養(yǎng)條件下葡萄糖在第14小時消耗完全，而微膠囊條件下，第16小時消耗完全，兩者最終都能將葡萄糖代謝完全。圖4表明，微膠囊化布拉迪酵母菌的乙醇生成量要顯著高于游離培養(yǎng)，但其初始生成速率低于游離培養(yǎng)。這與Westman等[10,19]的報道一致。其主要原因為包被后的釀酒酵母上調(diào)了其胞內(nèi)酒精脫氫酶的表達，從而增加了乙醇合成的產(chǎn)量[10]。

圖5 布拉迪酵母甘油代謝對比圖Fig. 5 G lycerin metabolism of free and m icroencapsulated Saccharomyces boulardii

2.3 微膠囊化布拉迪酵母的胞內(nèi)、外甘油變化如圖5A所示，0～14 h兩種培養(yǎng)條件下胞外甘油的濃度均呈緩慢降低趨勢，且兩者之間甘油濃度差異不明顯。從第16小時開始，微膠囊化布拉迪酵母的胞外甘油濃度迅速降低，而此時游離培養(yǎng)條件下的胞外甘油濃度變化仍不顯著。進一步檢測第18小時和第24小時兩個時間點布拉迪酵母細胞內(nèi)的甘油濃度，如圖5B所示，游離組和微膠囊化布拉迪酵母的胞內(nèi)甘油含量在第18小時分別為14.2 nmol/109CFU和17.9 nmol/109CFU，第24小時分別為8.2 nmol/109CFU和21.1 nmol/109CFU。兩個時間點，微膠囊化條件下酵母菌胞內(nèi)甘油濃度分別比游離組條件下顯著高出26.1%和157.3%（P＜0.05）。這種與游離組相比，發(fā)酵前包被組酵母胞內(nèi)甘油含量有所提高與Sun Zhijie等[20]研究結(jié)果一致。

2.4 包被對布拉迪酵母胞內(nèi)海藻糖的影響

圖6 培養(yǎng)18 h和24 h后布拉迪酵母胞內(nèi)海藻糖含量對比Fig. 6 Intracellular trehalose production of free and m icroencapsulated Saccharomyces bou lardii after 18 h and 24 h incubation

如圖6所示，游離組和微膠囊化布拉迪酵母的胞內(nèi)海藻糖含量在第18小時分別為14.3 μg/109CFU和22.1 μg/109CFU，第24小時分別為14.5 μg/109CFU和30.6 μg/109CFU。兩個時間點，微膠囊化條件下酵母菌胞內(nèi)海藻糖含量分別比游離條件下顯著高出54.6%和110.3%（P＜0.05），這種與游離組相比，發(fā)酵前包被組酵母胞內(nèi)海藻糖含量增多與Sun Zhijie等[20]研究結(jié)果也一致。

3 討論與結(jié)論

基于乳化凝膠化原理的益生菌微膠囊化過程，由于設(shè)備簡單、操作容易很適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)勢，因此也備受益生菌微膠囊化研究者的關(guān)注[21]。但該技術(shù)也存在乳化過程和制備材料會影響益生菌本身生理活性的問題[10]。本研究首先通過乳化凝膠化原理對布拉迪酵母細胞進行了發(fā)酵前包被，經(jīng)包被后培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)布拉迪酵母細胞生長良好，可充滿整個微膠囊內(nèi)部，且呈大小不一的團塊狀分布于微膠囊內(nèi)部。這種集團式的增長不但提高了微生物細胞的密度，也容易誘導細胞間的群體感應，從而提高其對外界脅迫的抵抗能力[22-24]。

有報道表明，微膠囊可通過避免因攪拌而帶來的剪切力，為其內(nèi)部的細胞提供更加穩(wěn)定的微環(huán)境，因而也更利于細胞的增殖和代謝[25]。本研究得到了微膠囊化條件下更高的布拉迪酵母密度，進一步證明了這一點。然而，微膠囊相對于游離條件是一個嶄新的環(huán)境，且相對于游離條件，構(gòu)成微膠囊的介質(zhì)也會對傳質(zhì)的速率造成一定的影響。因此，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，雖然微膠囊條件下布拉迪酵母的延遲期段，最終活菌數(shù)高，但其微生物細胞對數(shù)生長期得的增殖（圖2）和代謝速率（圖3和圖4）并沒體現(xiàn)出優(yōu)勢，相反，略低于游離培養(yǎng)條件。

甘油在胞內(nèi)快速合成和積累是布拉迪酵母細胞中一種重要的高滲壓脅迫環(huán)境調(diào)節(jié)策略[26]。當酵母細胞處于高滲透壓脅迫狀態(tài)時，代謝流迅速轉(zhuǎn)向甘油合成途徑并大量在胞內(nèi)積累以平衡外界滲透壓，從而保護細胞免受滲透脫水的損傷，并保證酵母菌細胞在高滲透壓培養(yǎng)環(huán)境中的正常生長；反之，細胞內(nèi)甘油合成速率過低，則酵母菌對高滲透壓環(huán)境的耐受力降低，細胞的正常生長也會受到抑制[25]。本研究結(jié)果表明，在葡萄糖代謝完全后，微膠囊化酵母菌的胞外甘油濃度迅速降低，這部分甘油來自源于培養(yǎng)基本身，從而保證了細胞的正常生長；同時胞內(nèi)的甘油濃度也迅速提高，從而提高了其對高滲透壓環(huán)境的耐受力。此外，胞內(nèi)甘油的聚集也有利于微生物細胞的低溫或常溫保存，這也可能是微膠囊化酵母菌更耐受貯存的原因之一[26]。而游離培養(yǎng)條件下，布拉迪酵母并沒有進一步啟動甘油代謝途徑，其胞內(nèi)甘油濃度也相對較低。

釀酒酵母在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)環(huán)境中遇到由高鹽引起的外界滲透壓的升高時，除甘油是最主要的生物相容性物質(zhì)外，海藻糖也常用來調(diào)節(jié)酵母胞內(nèi)的滲透壓平衡[27]。本研究結(jié)果表明，乳化凝膠化制備的發(fā)酵前包被布拉迪酵母，其細胞內(nèi)部海藻糖含量顯著高于游離培養(yǎng)。進一步驗證了上述甘油結(jié)果分析所得結(jié)論。有報道還表明，作為細胞內(nèi)的儲能物質(zhì)酵母胞內(nèi)海藻糖，還可以增強細胞抵抗高溫、低溫和高酒精濃度等極端惡劣環(huán)境的能力，使處于逆境下的細胞仍能維持其生命活性[28]。

總之，本研究結(jié)果表明，與游離細胞相比，發(fā)酵前微膠囊化培養(yǎng)的布拉迪酵母活菌積累量明顯提高，乙醇生成量顯著增加；其胞外甘油濃度下降明顯，而胞內(nèi)甘油濃度則顯著升高；此外，微膠囊化布拉迪酵母的胞內(nèi)海藻糖含量也顯著提高。因此，微膠囊內(nèi)部微環(huán)境為布拉迪酵母提供了更穩(wěn)定的增殖空間，并使其代謝途徑沿著有利于甘油和海藻糖積累的途徑進行，從而在提高活菌數(shù)的同時，提高了細胞的抗?jié)B透壓和耐貯存等抗脅迫能力。

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Grow th and Metabolism of Microencapsulated Saccharomyces boulardii and Mechanisms of Its Increased Stress Tolerance

QIN Tengfei1,2, YUN Tingting2, WANG Chunling1,*, QI Wentao2,*
(1. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China;2. Academy of State Adm inistration of Grain, Beijing 100037, China)

Saccharomyces boulardii was entrapped in alginate m icrocapsules by the emulsification/internalgelation method and was cultured in YPD liquid medium. The characteristics of grow th and metabolism of microencapsulated yeast were studied and the mechanism for its increased stress resistance was elucidated w ith the free non-encapsulated one as control.The results showed that more living cells of S. boulardii were obtained and more ethanol was generated in the form of m icrocapsules compared w ith the control group. Extracellular glycerin concentration decreased, while intracellular glycerol concentration increased significantly in m icroencapsulated culture; the extracellular glycerin concentration of microencapsulated cells was 157.3% higher than that of free non-encapsulated cells. Furthermore, compared to free culture,the intracellular trehalose content of m icroencapsulated S. boulardii was significantly increased by 110.3%. In conclusion,the microcapsule could provide a microenvironment that enabled encapsuled S. boulardii to grow stably, and facilitated the accumulation of glycerol and trehalose inside the cells, resulting in an improvement of their stress resistance.

Saccharomyces boulardii; microencapsulation; grow th and metabolism; stress resistance

10.7506/spkx1002-6630-201722021

TS201.3

A

1002-6630（2017）22-0137-06

秦騰飛, 贠婷婷, 王春玲, 等. 發(fā)酵前包被布拉迪酵母生長代謝及其抗逆性機理[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 137-142.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722021. http://www.spkx.net.cn

QIN Tengfei, YUN Tingting, WANG Chunling, et al. Grow th and metabolism of m icroencapsulated Saccharomyces boulardii and mechanisms of its increased stress tolerance[J]. Food Science, 2017, 38(22): 137-142. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722021. http://www.spkx.net.cn

2016-11-30

動物營養(yǎng)學國家重點實驗室開放課題（2004DA125184F1306）；國家自然科學基金面上項目（31471591）

秦騰飛（1989—），女，碩士研究生，主要從事食品科學研究。E-mail：715160941@qq.com

*通信作者：王春玲（1977—），女，教授，博士，主要從事功能性食品、釀造食品的研究開發(fā)。E-mail： wangchunling@tust.edu.cn綦文濤（1979—），男，副研究員，博士，主要從事微囊化細胞培養(yǎng)開發(fā)與利用。E-mail：qw t@chinagrain.org