李中賓，任 悅，鄒德智，王 旭，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

固定化酶輥多效酶解大豆胚片的工藝優(yōu)化

李中賓，任 悅，鄒德智，王 旭，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

利用醋酸纖維素修飾聚丙烯微孔膜，再將纖維素酶和中性蛋白酶分別固定在醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜上，并制成固定化酶輥，以大豆胚片為原料，依次按纖維素酶輥、中性蛋白酶輥的順序共同交替多效循環(huán)對其進行碾壓酶解，以冷榨大豆胚片的出油率為指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化固定化酶輥酶解大豆胚片條件。結(jié)果表明，最佳條件為酶解環(huán)境空氣相對濕度86.0%、大豆料胚溫度55.0 ℃、酶輥碾壓時間91.0 m in，在此條件下酶解的大豆胚片經(jīng)冷榨出油率為73.8%，瓦餅的蛋白變性較小，2 種固定化酶輥重復(fù)使用7 次后，其相對酶活力仍保持在80%以上。

固定化酶輥；多效酶解；冷榨法；出油率；氮溶解指數(shù)（NSI）

目前，大豆制油的工業(yè)化方法主要為溶劑萃取法、熱榨法和冷榨法[1-3]，其中溶劑萃取法的出油率最高，但油脂的營養(yǎng)價值偏低，同時豆粕中溶劑殘留，使豆粕效能降低[4-5]。熱榨法提取的油脂品質(zhì)較好，安全健康，但出油率僅為70%左右，且高溫使豆粕蛋白變性嚴重，利用率很低[6-7]。冷榨法是將未經(jīng)過蒸炒的油料直接在80 ℃以下進行物理壓榨，從而避免了熱榨法的不足，并且冷榨油不需進一步常規(guī)的油脂精煉工序，最大限度地保存了油中各種脂溶性營養(yǎng)成分[8-10]，但出油率約為熱榨法的一半，致使其市場售價較高。

近年來，人們對酶法與冷榨技術(shù)相結(jié)合制油的技術(shù)展開的相關(guān)研究[11-12]表明，相較于傳統(tǒng)冷榨制油法，酶法與冷榨技術(shù)相結(jié)合制油的技術(shù)使得出油率顯著提高，同時瓦餅中蛋白質(zhì)變性程度較低，但是此種方法所用的酶大多數(shù)為游離酶，在制油的過程中酶的用量大，成本較高，酶無法重復(fù)使用等問題限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用。將游離酶固定在載體上制成固定化酶，不僅提高了酶的穩(wěn)定性，同時可使酶重復(fù)使用，從而降低了生產(chǎn)成本[13]，固定化酶載體材料根據(jù)其形態(tài)大致可以分為微球、多孔材料和膜材料等[14-15]，而將酶固定在膜表面制成酶膜，可以將酶的催化功能和膜的分離功能有機地結(jié)合起來，這一點是其他載體材料無法比擬的[16]。

醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜具有一定的吸附性、化學(xué)穩(wěn)定性好、疏水性和機械性能優(yōu)異等優(yōu)點，根據(jù)復(fù)合膜的吸附特性固定酶，可提高酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性，從而有利于酶的回收和產(chǎn)品的生產(chǎn)。而將酶膜制成酶輥，并用于大豆胚片酶解反應(yīng)中，不僅可以降低蛋白與油脂的結(jié)合力[17-19]，保證了較高的出油率，又可以用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。

本實驗利用醋酸纖維素修飾聚丙烯微孔膜，再以醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜為載體，以吸附交聯(lián)法分別將纖維素酶和中性蛋白酶固定在載體上，如圖1所示，并將2 種固定化酶膜分別制成酶輥，依次按纖維素酶輥、中性蛋白酶輥的順序共同交替循環(huán)酶解大豆胚片，研究酶輥的相關(guān)特性及2 種酶輥連續(xù)多效酶解過程的工藝條件，研究酶解后冷榨大豆胚片的出油率及蛋白變性情況，為工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

圖1 酶固定化原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram illustrating the p rincip le of enzyme immobilization

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆胚片（從企業(yè)生產(chǎn)線上取樣，工藝參數(shù)為大豆破碎4～6 瓣，軟化溫度70 ℃，時間約15 m in，胚片厚度0.3 mm左右；水分質(zhì)量分數(shù)10.6%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)41.6%，脂肪質(zhì)量分數(shù)20.8%，灰分質(zhì)量分數(shù)4.3%）黑龍江九三康諾有機農(nóng)產(chǎn)品科技有限公司；纖維素酶（25 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg） 諾維信（中國）有限公司；聚丙烯微孔膜 北京塑料研究所；醋酸纖維素 中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SG30-2B型家用螺旋榨油機 北京永恒鑫盛科技發(fā)展中心；JF-976G分體式加熱平臺 東莞市長安金峰電子工具廠；SM-03B型電子霧化加濕器 江蘇濕美電氣制造有限公司；N24120型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海凱朗儀器設(shè)備廠；PHS-3C精密酸度計 上海雷韻試驗儀器制造有限公司；THZ-82數(shù)顯水浴恒溫振蕩器江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；PP-2000型掃描電子顯微鏡 英國Quorum公司；2300自動定氮儀 杭州福斯特卡托公司。

1.3 方法

1.3.1 聚丙烯復(fù)合膜的表面修飾

聚丙烯微孔膜內(nèi)部呈纖維狀，微孔較多，這種結(jié)構(gòu)并不利于酶的固定化，因此需用醋酸纖維素對聚丙烯微孔膜進行表面改性，將5.0 g醋酸纖維素溶于100 m L丙酮中，待溶解完全形成均一的膜液，將聚丙烯微孔膜浸于溶有醋酸纖維素的丙酮溶液中，自然成膜，以去離子水沖洗醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜數(shù)次干燥備用[20]。

1.3.2 酶膜的制備

纖維素酶膜的制備：將7.5 m g纖維素酶溶解于45 ℃、500 m L、pH 4的磷酸鹽緩沖液中配制成酶液，取2 份相同大小的醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜緊密貼合，置于上述酶液中振蕩吸附5 h后，加入2.5 m L戊二醛進行交聯(lián)反應(yīng)4 h，確保纖維素酶固定于單張酶膜的一側(cè)，以達到節(jié)約成本的目的。取出酶膜以去離子水沖洗數(shù)次后于室溫下干燥，制得一側(cè)有固定化纖維素酶的酶膜，對酶膜進行表征，觀察其表面形貌，所得電鏡圖片經(jīng)專業(yè)圖象分析軟件分析其孔徑大小[21]。

中性蛋白酶膜的制備：將7.5 mg中性蛋白酶溶解于51 ℃、500 m L、pH 7的磷酸鹽緩沖液中配制成酶液，將2 張緊密貼合的纖維素/聚丙烯復(fù)合膜置于酶液中，振蕩吸附4 h后，加入2.5 m L戊二醛進行交聯(lián)反應(yīng)3 h，干燥后制得一側(cè)有固定化中性蛋白酶的酶膜，對酶膜進行表征，觀察其表面形貌，所得電鏡圖片經(jīng)專業(yè)圖象分析軟件分析其孔徑大小。

1.3.3 固定化酶膜載酶量的測定

用單位面積的酶膜所固定的酶蛋白含量表示載酶量，采用Bradford[22]的方法測定固定化前后的纖維素酶及中性蛋白酶的酶液含量，同時測定清洗固定化酶膜所用PBS中的酶蛋白含量，同一條件下進行平行重復(fù)實驗3 次，取平均值，實驗誤差在5%以下。根據(jù)公式（1）計算載酶量：

式中：ρ0為固定化之前酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（m g/m L）；ρ為酶經(jīng)固定化后溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/m L）；ρw為清洗溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/m L）；V為固定化實驗所用酶溶液體積/m L；Vw為清洗溶液體積/m L；S為浸入酶溶液中膜的面積/cm2。

1.3.4 固定化酶膜酶活力測定

測定固定化酶膜活力時，每次取固定化酶膜2 份，其中一份做空白實驗，在樣品瓶中加入另一份固定化酶膜1 cm2，其中纖維素酶活力采用QB 2583—2003《纖維素酶制劑》中的濾紙酶活力法測定；中性蛋白酶活力采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林-酚法測定，以酶活力最大值為100%，其余酶活力與其對比，即相對酶活力，見公式（2）：

式中：A為固定化酶膜初始酶活力/（U/cm2）；B為使用一定時間后固定化酶膜的酶活力/（U/cm2）。

1.3.5 酶輥的制備

輥的規(guī)格為直徑60 mm，長400 mm，輥軸長80 mm，輥的表面材質(zhì)為普通碳鋼板（板厚3.0 mm），酶輥上固定2 層，第1層用牛皮紙包裹輥，將少量乳白膠均勻的涂抹在牛皮紙中間及兩側(cè)位置，第2層將制備好的固定化纖維素酶膜的空白一側(cè)纏繞于附有乳白膠的牛皮紙上，使酶膜較好的固定在輥上，從而制得固定化纖維素酶輥；同法制得中性蛋白酶輥。

1.3.6 酶輥碾壓胚片過程

將大豆胚片平鋪于帶有電熱的600 mm×400 mm不銹鋼板上，大豆胚片厚度大約5 mm，將其支撐在800 mm×450 mm×500 mm的不銹鋼板制作的密封室內(nèi)，酶輥的兩段軸頭外漏，調(diào)節(jié)電熱板至一定溫度，利用電子霧化加濕器向酶解室內(nèi)噴霧，調(diào)節(jié)酶解室內(nèi)空氣相對濕度，按照纖維素酶輥在前，中性蛋白酶輥在后的順序多次碾壓電熱板上的大豆胚片，人工轉(zhuǎn)動輥軸使2 種酶輥連續(xù)循環(huán)往復(fù)碾壓酶解胚片，期間每隔10 m in將胚片翻置1 次。

1.3.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

綜合單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken模型，對空氣相對濕度（A）、大豆料胚溫度（B）、酶輥碾壓時間（C）3 個因素進行優(yōu)化，以出油率（Y）為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析，使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗以優(yōu)化制油工藝參數(shù)。響應(yīng)面因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.8 冷榨制油方法

取出酶解后的胚片，對其進行低溫干燥處理，調(diào)節(jié)物料水分質(zhì)量分數(shù)為5%，將干燥后物料投入冷榨機內(nèi)，在冷榨壓力3.5 MPa、冷榨溫度65 ℃條件下進行冷榨制油，并計算出油率，見公式（3）：

式中：mA為壓榨后瓦餅含油質(zhì)量/g；mB為大豆胚片總含油質(zhì)量/g。

1.3.9 氮溶解指數(shù)測定

參照Mattil[23]的方法并做適當改進以測定榨油后瓦餅的氮溶解指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI），具體方法為：準確稱取100 mg樣品，加入15 m L蒸餾水，室溫下磁力攪拌30 m in， 4 000 r/m in離心30 m in，收集上清液。取20 m L上清液，凱氏定氮法測定上清液中的氮含量，同時測定瓦餅中的總氮含量。

1.3.10 酶輥操作穩(wěn)定性分析

在響應(yīng)面優(yōu)化的最佳操作條件下，用2 種酶輥對大豆胚片進行碾壓酶解操作，每次碾壓時間為優(yōu)化出酶解的最佳時間，每次碾壓結(jié)束后，從酶輥上取約1 cm2的酶膜進行酶活力檢測，重復(fù)上述實驗過程，以初始的酶活力記為100%，計算相對酶活力，考察重復(fù)使用次數(shù)對酶膜相對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶輥的制備

2.1.1 聚丙烯微孔膜及固定化酶膜的微觀結(jié)構(gòu)

從圖2a可知，空白聚丙烯微孔膜內(nèi)部呈纖維狀，錯亂交叉，微孔較多，其平均孔徑為0.22 μm，這種結(jié)構(gòu)并不利于酶的固定化。圖2b中醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜的表面平整、致密、均勻，且無明顯的微孔結(jié)構(gòu)，這說明經(jīng)醋酸纖維素修飾后，聚丙烯膜內(nèi)部微孔被醋酸纖維素交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而有利于酶的固定[24]。圖2c、2d中醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜的表面大部分被酶覆蓋，且酶在復(fù)合膜的表面分布均勻，這表明大部分的酶被固定在醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜的界面上。

圖2 微孔膜及固定化酶膜的掃描電鏡圖（×1 000）Fig. 2 Scanning electron m icroscopic images of m icroporous membrane and immobilized enzyme membrane (× 1 000)

2.1.2 酶膜載酶量及酶活力由表2可知，固定化纖維素酶膜與固定化中性蛋白酶膜的酶活力分別為18.92 U/mg和142.32 U/mg，雖然酶活力有所降低，但可增加重復(fù)利用次數(shù)，避免了酶的大量流失[25-26]。

表2 2 種酶膜的載酶量及酶活力Table 2 Enzyme loadings and activities of two immobilized enzyme membranes

2.1.3 固定化酶輥立體結(jié)構(gòu)

圖3 酶輥的立體實物圖Fig. 3 Pictures of immobilized enzyme rollers

如圖3所示，碳鋼材質(zhì)具有較好的機械強度，可保證在長時間使用下酶輥不變形，牛皮紙使輥表面平整，避免在操作過程中外層固定化纖維素酶膜受到內(nèi)部輥的機械損傷，同時牛皮紙具有較好的透氣性，可使固定化纖維素酶膜層內(nèi)外濕度保持相近，從而利于其酶膜在一定的濕度下發(fā)揮作用；固定化中性蛋白酶輥結(jié)構(gòu)與固定化纖維素酶輥相同。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 酶解室空氣相對濕度對出油率的影響

通過控制通入水霧量調(diào)節(jié)酶解室內(nèi)的空氣相對濕度為75%、80%、85%、90%、95%，料胚溫度為55 ℃，酶輥連續(xù)碾壓大豆胚片的時間為90.0 m in，空氣相對濕度對大豆胚片出油率的影響見圖4。

圖4 空氣相對濕度對出油率的影響Fig. 4 Effect of relative air hum idity on oil yield

由圖4可知，隨著酶解室內(nèi)空氣相對濕度的增大，大豆胚片的出油率呈先升高后平緩趨勢，當空氣相對濕度大于85%時，出油率趨于平穩(wěn)，這主要是因為酶的催化作用只與少部分與酶結(jié)合的“結(jié)合水”有關(guān)，過高的水分含量會稀釋酶和底物，使酶促反應(yīng)速率下降[26]，并且空氣相對濕度過高，可能導(dǎo)致酶膜上固定化酶的脫落致使出油率增加不明顯，綜合考慮，空氣相對濕度在85%為宜。

2.2.2 大豆料胚溫度對出油率的影響

選取酶解室空氣相對濕度為85%，料胚溫度為35、45、55、65、75 ℃，酶輥連續(xù)碾壓大豆胚片的時間為90.0 min，大豆料胚溫度對大豆胚片出油率的影響見圖5。

圖5 大豆料胚溫度對出油率的影響Fig. 5 Effect of operating temperature on oil yield

由圖5可以看出，當大豆料胚溫度從35 ℃升至55 ℃時，出油率逐漸升高，溫度達到55 ℃時，出油率達到最大。這說明隨著溫度的升高，2 種酶的催化活性部位逐漸暴露，使酶的活性逐漸增強[28]。然而，隨著溫度繼續(xù)升高，大豆胚片出油率開始降低，這可能是因為較高溫度使酶輥上的酶部分失活所導(dǎo)致的。因此，2 種酶輥共同作用大豆胚片的最佳大豆料胚溫度為55 ℃。

2.2.3 酶輥碾壓時間對出油率的影響

選取酶解室內(nèi)空氣相對濕度為85%，料胚溫度為55 ℃，酶輥連續(xù)碾壓大豆胚片的時間為75、80、85、90、95 min，酶輥碾壓時間對大豆胚片出油率的影響見圖6。

由圖6可以看出，開始時隨著兩種酶輥連續(xù)碾壓大豆胚片時間延長，出油率逐漸增大，酶輥碾壓超過90.0 m in時，出油率增加減緩，原因為纖維素酶輥破壞了大豆胚片細胞壁，中性蛋白酶輥降低了大豆胚片內(nèi)油脂與蛋白結(jié)合力，從而使油脂易于從固體油料中釋放出來[29-30]，延長碾壓時間，雖有利于出油率的提高，但時間過長會導(dǎo)致生產(chǎn)效率的下降，綜合考慮，選取碾壓時間為90.0 m in。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

綜合單因素試驗的結(jié)果，以空氣相對濕度（A）、大豆料胚溫度（B）、酶輥碾壓時間（C）3 個因素進行優(yōu)化，以出油率（Y）為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析，使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗以優(yōu)化制油工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design w ith experimental values of oil yield

由表3可知，整個試驗共進行17 次，其中析因試驗為12 次，中心試驗為5 次。采用Design-E xpert 8.0.6軟件對表中數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到3 個因素對響應(yīng)值影響的回歸方程模型如下：

2.3.2 響應(yīng)面模型的顯著性檢驗與分析

表4 回歸方程的方差分析Tab le 4 Analysis of variance of regression equation

表4中出油率整體模型的F值為119.64，P值小于0.000 1，模型極顯著，表明回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著，即這種實驗方法是可靠的。失擬項是用來表示模型與實驗擬合的程度，即二者差異的程度[31]。表3中失擬項F值為1.35，P值為0.377 5，失擬項不顯著，表明該模型選擇正確，模型中的調(diào)整系數(shù)R2Adj為0.984 5，說明98.45%的響應(yīng)值變化可以通過擬合模型進行解釋，相關(guān)系數(shù)R2為0.992 2，表明該模型與實際實驗擬合較好，可以用此模型來分析和預(yù)測出油率。

從回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗可以看出：一次項C對響應(yīng)值的影響高度著性，A、B對響應(yīng)值的影響顯著。在所確定的實驗水平范圍內(nèi)，各因素對響應(yīng)值的影響程度順序為C＞A＞B，即酶輥碾壓時間＞空氣相對濕度＞大豆料胚溫度，3 個因素中，空氣相對濕度和酶輥碾壓時間之間有高度顯著交互作用，空氣相對濕度和大豆料胚溫度之間有顯著交互作用。

通過試驗設(shè)計優(yōu)化得到酶輥處理大豆胚片的最佳工藝參數(shù)為空氣相對濕度85.3%、大豆料胚溫度54.4 ℃、酶輥碾壓時間90.6 m in，該條件下出油率預(yù)測值為73.2%。根據(jù)實際情況將工藝參數(shù)進行整理，得出整理值為空氣相對濕度86.0%、大豆料胚溫度55.0 ℃、酶輥碾壓時間91.0 m in，在此條件下進行3 次平行驗證實驗，該條件下出油率平均值為73.8%，實測值與預(yù)測值之間具有良好的擬合性，從而證實了模型的有效性。同時本實驗對最佳工藝下冷榨制油后瓦餅的NSI值進行測定，結(jié)果表明，實驗冷榨瓦餅NSI為70.0%，通過比較本實驗中的冷榨瓦餅與普通冷榨瓦餅可知，本實驗冷榨瓦餅NSI較其上升3.4%，這說明本實驗方法所得的瓦餅蛋白具有較好的溶解性，相對于普通冷榨榨制油工藝所得的瓦餅蛋白加工特性較好，具有較好的經(jīng)濟價值以及更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

2.4 固定酶輥的操作穩(wěn)定性

圖7 2 種酶輥重復(fù)使用次數(shù)對相對酶活力的影響Fig. 7 Repeated usability of two immobilized enzyme rollers

由圖7可以看出，無論固定化纖維素酶輥還是固定化中性蛋白酶輥的相對酶活力，均隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低，這可能是由于重復(fù)使用次數(shù)增加，酶膜受到一定的機械損傷，使載體破損，并可能伴有固定化酶脫落現(xiàn)象，或者酶本身的失活導(dǎo)致了固定化酶相對酶活力的降低。但2 種酶輥在重復(fù)使用7 次后，相對酶活力仍可保持80%以上，說明其具有良好的操作穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本實驗研制了固定化纖維素酶輥和固定化中性蛋白酶輥，應(yīng)用2 種酶輥連續(xù)循環(huán)往復(fù)對大豆胚片進行碾壓酶解處理，降低了大豆胚片內(nèi)油脂與蛋白結(jié)合力，以冷榨出油率為指標，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了空氣相對濕度、大豆料胚溫度和酶輥碾壓時間對酶解效果的影響，在酶解最佳條件下，冷榨出油率為73.8%。同時測得壓榨后瓦餅的NSI為70.0%，相較于普通冷榨瓦餅有顯著提高，提高了3.4%。2 種固定化酶輥重復(fù)使用7 次后，其相對酶活力均可保持80%以上，具有較好的操作穩(wěn)定性，應(yīng)用此法對大豆胚片進行酶解處理，不僅提高了冷榨法制油的出油率及冷榨后瓦餅中蛋白的利用率，酶輥的連續(xù)使用性能為工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

[1] RUSSIN T A, BOYE J I, ARCAND Y. A lternative techniques for defatting soy: a practical review[J]. Food and Bioprocess Technology,2011, 4(2): 200-223. DOI:10.1007/s11947-010-0367-8.

[2] 劉玉蘭, 陳劉楊, 汪學(xué)德, 等. 不同壓榨工藝對芝麻油和芝麻餅品質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2011, 27(6): 382-386. DOI:10.3969/j.issn.1002-6819.2011.06.066.

[3] YANIK D K. A lternative to traditional olive pomace oil extraction systems: m icrowave-assisted solvent extraction of oil from wet olive pomace[J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 77: 45-51.DOI:10.1016/j.lw t.2016.11.020.

[4] TRES M V, RACOSK I J C, LUCCIO M D, et al. Separation of soybean oil/n-hexane and soybean oil/n-butane m ixtures using ceram ic membranes[J]. Food Research International, 2014, 63: 33-41.DOI:10.1016/j.foodres.2014.02.004.

[5] 徐紅華, 申德超. 改進的擠壓膨化浸出工藝對大豆油脂及粕蛋白品質(zhì)的改善[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2007, 23(4): 249-252. DOI:10.3321/j.issn:1002-6819.2007.04.049.

[6] BARGALE P C, FORD R J, SOSULSKI F W, et al. Mechanical oil expression from extruded soybean samples[J]. Journal of the American Oil Chem ists’ Society, 1999, 76(2): 223-229.

[7] NIU Y X, LI W, ZHU J, et al. Aqueous enzymatic extraction of rapeseed oil and protein from dehulled cold-pressed double-low rapeseed cake[J]. International Journal of Food Engineering, 2012,8(3): 1-14. DOI:10.1515/1556-3758.2530.

[8] 張雪嬌, 王向紅, 桑亞新, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化亞麻籽油制備工藝條件[J]. 中國食品學(xué)報, 2013, 13(9): 99-107. DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.09.020.

[9] YU L L, ZHOU K K, PARRY J. Antioxidant properties of cold-pressed black caraway, carrot, cranberry and hemp seed oils[J]. Food Chemistry,2005, 91(4): 723-729. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.06.044.

[10] KANIA M, M ICHALAK M, GOGOLEWSKI M, et al. Antioxidative potential of substances contained in cold pressed soybean oil and after each phase of refining process[J]. Acta Scientiarum Polonorum Technologia A limentaria, 2004, 3(1): 113-121.

[11] SOTO C, CHAMY R, Zú?IGA M E. Enzym atic hyd ro lysis and pressing conditions effect on borage oil extraction by cold pressing[J]. Food Chem istry, 2007, 102(3): 834-840. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.06.014.

[12] ANWAR F, ZREEN Z, SULTANA B, et al. Enzyme-aided cold pressing of fl axseed (Linum usitatissimum L.): enhancement in yield,quality and phenolics of the oil[J]. Grasas Y Aceites, 2013, 64(5): 463-471. DOI:10.3989/gya.132212.

[13] 葉麗靜, 房鑫, 王浩綺, 等. 介孔TiO2晶須材料的硅烷化改性及其對載體pzc值和酶負載性能的影響[J]. 化工學(xué)報, 2013, 64(6): 2160-2168. DOI:10.3969/J.ISSN.0438-1157.2013.06.035.

[14] 鄧輝, 陳晟, 陳堅, 等. 產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶細胞的固定化[J]. 食品科學(xué),2013, 34(9): 164-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309034.

[15] 代云容, 牛軍峰, 殷立峰, 等. 靜電紡絲納米纖維膜固定化酶及其應(yīng)用[J]. 化學(xué)進展, 2010, 22(9): 1808-1818.

[16] 徐堅, 王玉軍, 駱廣生, 等. 利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶[J]. 化工學(xué)報, 2006, 57(10): 2372-2377.

[17] SHARMA A, KHARE S K, GUPTA M N. Enzyme-assisted aqueous extraction of rice bran oil[J]. Journal of the American Oil Chem ists’Society, 2001, 78(9): 949-951. DOI:10.1007/s11746-001-0369-x.

[18] HANMOUNGJAI P, PYLE D L, NIRANJAN K. Enzymatic process for extracting oil and protein from rice bran[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2001, 78(8): 817-821. DOI:10.1007/s11746-001-0348-2.

[19] SANTAMARíA R I, SOTO C, Zú?IGA M E, et al. Enzymatic extraction of oil from Gevuina avellana, the Chilean hazelnut[J].Journal of the American Oil Chem ists’ Society, 2003, 80(1): 33-36.DOI:10.1007/s11746-003-0646-8.

[20] 時敏, 王雪, 馬麗娜, 等. 醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 155-158. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309032.

[21] MASSELIN I, DURAND-BOURLIER L, LA INE J M, et al.Membrane characterization using m icroscopic image analysis[J].Journal of Membrane Science, 2001, 186(1): 85-96.

[22] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of m icrogram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochem istry, 1976, 72(1/2): 248-254.

[23] MATTIL K F. The functional requirements of proteins for foods[J].Journal of the American Oil Chem ists’ Society, 1971, 48(9): 477-480.

[24] 梁單瓊, 周曉丹, 時敏, 等. 醋酸纖維素-聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(21): 171-176.

[25] 趙磊, 唐婧, 王成濤. 脂肪酶在尼龍網(wǎng)上的固定化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 210-215. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309043.

[26] 陳新營, 魏榮卿, 何冰芳, 等. 梳狀親水性環(huán)氧基載體固定化Pseudomonas stutzeri LC2-8脂肪酶[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報, 2012,26(4): 635-639.

[27] 楊縝. 有機介質(zhì)中酶催化的基本原理[J]. 化學(xué)進展, 2005, 17(5):924-930. DOI:10.3321/j.issn:1005-281X.2005.05.022.

[28] 張家明, 許多現(xiàn), 李相昕, 等. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化超臨界CO2酯交換法制備低能SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(20): 67-72.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201520012.

[29] 江連洲, 李楊, 王妍, 等. 水酶法提取大豆油的研究進展[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 346-350. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309069.

[30] BOCEVSKA M, KARLOVI? D, TURKULOV J, et al. Quality of corn germ oil obtained by aqueous enzymatic extraction[J]. Journal of the American Oil Chem ists’ Society, 1993, 70(12): 1273-1277.DOI:10.1007/BF02564241.

[31] BOHUTSKYI P, KULA T, KESSLER B A, et al. M ixed trophic state production process for m icroalgal biomass w ith high lipid content for generating biodiesel and biogas[J]. Bioenergy Research, 2014, 7(4):1174-1185. DOI:10.1007/s12155-014-9453-5.

Optim ization of Sequential Hydrolysis of Soybean Flakes by Immobilized Enzyme Rollers for Increased Cold-Presssed Oil Yield

LI Zhongbin, REN Yue, ZOU Dezhi, WANG Xu, YU Dianyu*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

An immobilized enzyme roller was developed by immobilizing cellulase and neutral protease onto polypropylene m icroporous membrane modified by cellulose acetate, respectively. Soybean flakes were rolled sequentially w ith the cellulose roller followed by the neutral protease roller and then used for the production of cold-pressed oil. Hydrolysis conditions were optim ized by one-factor-at-a-time method and response surface methodology. An air relative hum idity of 86.0%, an operating temperature of 55.0 ℃ and a rolling time of 91.0 m in were found to be the optimal conditions to obtain a higher oil yield of 73.8% and a lower degree of protein denaturation. A fter seventh repeated use, both immobilized enzyme rollers retained more than 80% of their initial activities.

immobilized enzyme roller; sequential enzymatic hydrolysis; cold pressing method; oil yield; nitrogen solubility index (NSI)

10.7506/spkx1002-6630-201722011

TS224.3；TQ644.1

A

1002-6630（2017）22-0067-07

李中賓, 任悅, 鄒德智, 等. 固定化酶輥多效酶解大豆胚片的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 67-73. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722011. http://www.spkx.net.cn

LI Zhongbin, REN Yue, ZOU Dezhi, et al. Optimization of sequential hydrolysis of soybean flakes by immobilized enzyme rollers for increased cold-presssed oil yield[J]. Food Science, 2017, 38(22): 67-73. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722011. http://www.spkx.net.cn

2017-04-10

“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YD0401402）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31571880）

李中賓（1987—），男，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：380003840@qq.com

*通信作者：于殿宇（1964—），男，教授，博士，研究方向為糧油精深加工技術(shù)。E-mail：dyyu2000@126.com