劉 蕾，武瑞赟，李 軍，李平蘭,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

基于AI-2介導(dǎo)的類植物乳桿菌生物被膜態(tài)與浮游態(tài)抗脅迫能力比較與分析

劉 蕾1，武瑞赟2，李 軍1，李平蘭1,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

采用平板活菌計數(shù)法比較被膜態(tài)及浮游態(tài)的類植物乳桿菌L-ZS9經(jīng)熱處理、酸處理、膽鹽處理后的存活率，結(jié)果表明被膜態(tài)菌體具有更強的抗脅迫能力；通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法比較被膜態(tài)及浮游態(tài)菌株L-ZS9的脅迫相關(guān)基因atpβ、atpε、clp、pspC、ccpA及群體感應(yīng)信號分子自誘導(dǎo)物（autoinducer 2，AI-2）合成關(guān)鍵基因luxS的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明被膜態(tài)菌體的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于浮游態(tài)；通過報告菌株發(fā)光檢測法比較被膜態(tài)及浮游態(tài)菌株上清液中AI-2的活性，結(jié)果表明被膜態(tài)菌體上清液中AI-2的活性顯著高于浮游態(tài)；且外源信號分子AI-2可以調(diào)控基因atpβ、atpε、clp、ccpA、luxS的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果說明生物被膜不僅可以提供物理防御作用，而且其細(xì)胞個體的基因轉(zhuǎn)錄水平與浮游態(tài)也有所不同，且群體感應(yīng)系統(tǒng)在被膜的形成與調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究為開發(fā)高活力益生菌功能食品提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

類植物乳桿菌；生物被膜；抗脅迫能力；信號分子AI-2；轉(zhuǎn)錄水平

近年來，腸道菌群因其在營養(yǎng)物質(zhì)代謝、人體自身發(fā)育及免疫疾病等方面發(fā)揮的重要作用引起了科研人員的廣泛關(guān)注。腸道菌群依據(jù)其數(shù)量多少可分為主要（優(yōu)勢）菌群和次要菌群，其中乳桿菌因其具有重要生理功能而歸為優(yōu)勢菌群。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對益生菌的定義，益生菌是指當(dāng)以足夠數(shù)量存在時可對機體健康產(chǎn)生有益作用的活性微生物，其中研究最深入、應(yīng)用最廣泛的是乳酸菌。許多研究結(jié)果表明，乳酸菌對皮膚炎、哮喘、節(jié)段性回腸炎、肝源性腦病、鼻炎、結(jié)腸直腸癌、胃腸道感染、肥胖乃至抑郁癥等精神疾病均具有顯著的治療作用[1-3]。目前，益生菌不僅是一種食品補充劑，其營養(yǎng)保健及治療作用也得到了越來越多的認(rèn)可。因此，如何有效發(fā)揮益生菌的益生作用已成為近年來的研究熱點。

益生菌通常被直接制備成菌粉或以食物（如酸奶、果汁、發(fā)酵乳酪等）為載體通過口服進入人體，黏附定植于胃腸道黏膜表面，通過拮抗病原菌、分泌活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)等途徑發(fā)揮益生作用[4]。值得注意的是，益生菌在生產(chǎn)制備過程中會經(jīng)受各種不良環(huán)境的脅迫，如噴霧干燥制備菌粉時菌體需耐受80 ℃以上的高溫[5]。當(dāng)菌體攝食入口，在到達(dá)發(fā)揮益生功效的生態(tài)位點前，需經(jīng)受pH 2.0～3.0的胃酸環(huán)境，以及質(zhì)量濃度約為0.05～2 g/100 m L的膽鹽環(huán)境[6-7]。以上脅迫環(huán)境都會對益生菌的生理活性產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，如何提高益生菌的抗脅迫能力意義重大。

細(xì)菌為了抵抗外界不良環(huán)境常以生物被膜的狀態(tài)存在。生物被膜是大多數(shù)細(xì)菌在自然狀態(tài)下的一種生長方式，且被膜的形成和發(fā)展與多種生理行為相關(guān)，如毒力、發(fā)光、耐藥性等。關(guān)于有害微生物生物被膜的研究已取得了很大的進展[8-9]。生物被膜不是細(xì)菌個體的簡單堆積，而是細(xì)菌菌體及胞外分泌物如多糖、纖維蛋白、脂蛋白等相互作用而形成的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的膜樣物質(zhì)。多數(shù)細(xì)菌在自然環(huán)境中之所以選擇以被膜狀態(tài)生存，主要是由于被膜態(tài)菌體具有浮游態(tài)時不可比擬的優(yōu)勢[10]。研究發(fā)現(xiàn)，將被膜態(tài)的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）制成微制劑，不僅能更好地控制其釋放，還可增強其耐熱耐酸的能力。如將形成高密度生物被膜的益生菌包裹在殼聚糖包被的藻酸鹽微膠囊中，可顯著提高菌體抗冷凍干燥的能力和耐熱能力，且生物被膜態(tài)的益生菌與浮游態(tài)相比具有更顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[11]。

本研究選擇1株類植物乳桿菌（L. paraplantarum）L-ZS9為研究對象，該菌株可產(chǎn)生多種細(xì)菌素，可有效抑制腸桿菌科微生物的生長[12-13]，具有開發(fā)成優(yōu)良益生菌制劑和益生菌添加劑的潛力。且前期研究發(fā)現(xiàn)L. paraplantarum L-ZS9具有較強的生物被膜形成能力，且群體感應(yīng)信號分子自誘導(dǎo)物（autoinducer-2，A I-2）可影響其被膜形成[14]。本實驗通過比較L. paraplantarum L-ZS9生物被膜及浮游態(tài)細(xì)胞的耐熱、耐酸、耐膽鹽能力及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，明確了被膜態(tài)菌體具有更強的抗脅迫能力；進一步對2 種狀態(tài)菌體上清液中的信號分子AI-2進行了檢測，分析了不同菌體狀態(tài)與信號分子AI-2的關(guān)系。該研究為開發(fā)高活力益生菌功能食品提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

類植物乳桿菌（L. paraplantarum）L-ZS9從比利時發(fā)酵肉Saucisson sec pur中分離，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General M icrobiological Culture Collection Center，CGMCC），保藏編號為CGMCC No. 11669。

哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170及BB152從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獲得。

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit和TRIpure 北京艾德萊生物科技有限公司；DNaseⅠ（RNase-free）及RNase抑制劑 Thermo Fisher科技（中國）有限公司；SYBG reen染料 美國K apa Biosystems公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基：M RS培養(yǎng)基，包括蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、葡萄糖20 g/L、M gSO4·7H2O 0.58 g/L、牛肉浸膏10 g/L、K2HPO42 g/L、乙酸鈉5 g/L、Tween 80 1 m L/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L。

大腸桿菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，包括胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.4，121 ℃滅菌15 m in后備用。

哈維氏弧菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基：海生菌肉湯，取37.4 g培養(yǎng)基粉末，使溶質(zhì)完全溶解，定容至1 L，121 ℃滅菌15 m in后備用。

乳酸菌上清液制備培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%脫脂乳培養(yǎng)基，115 ℃滅菌10 m in后置于4 ℃冰箱備用，在2 d內(nèi)用完。

信號分子檢測用培養(yǎng)基：AB培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中加入0.05 mol MgSO4、0.3 mol NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%無維生素酪蛋白氨基酸（vitam in-free casam ino acids），用KOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，121 ℃滅菌15 m in后添加10 m L 1 mo l/L磷酸氫二鉀（0.22 μm濾器過濾）、10 m L 0.1 mol/L L-精氨酸（0.22 μm濾器過濾）、20 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%甘油（0.22 μm濾器過濾），現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 浮游態(tài)及生物被膜態(tài)細(xì)菌制備

將活化的L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)36 h后，5 000×g離心10 m in收集菌體，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.0）重懸菌體至終濃度1×108CFU/m L，此為浮游態(tài)細(xì)胞。

細(xì)菌可附著在聚苯乙烯材料表面形成生物被膜[15]。生物被膜態(tài)L. paraplantarum L-ZS9的培養(yǎng)條件及方法參照參考文獻[14]。將活化的菌株L-ZS9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于由聚苯乙烯材料制成的細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃ 靜置培養(yǎng)36 h，用移液槍吹散并重懸細(xì)胞，收集于1.5 m L離心管中，5 000×g離心10 m in收集菌體，并重懸至終濃度1×108CFU/m L，此為被膜態(tài)細(xì)胞。

1.2.2 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體耐熱能力測定

分別制備浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株L-ZS9。將收集到的菌體置于80 ℃水浴鍋中，處理3 m in。處理結(jié)束后通過平板活菌計數(shù)法計算活菌數(shù),并計算存活率。實驗每組設(shè)置3 個平行，且進行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗，測定浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體的耐熱能力。

1.2.3 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體耐酸能力測定

分別制備浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株L-ZS9。將收集到的菌體分別重懸于pH值為2.8的MRS培養(yǎng)基中，處理1 h。處理結(jié)束后通過平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。實驗每組設(shè)3 個平行，且進行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗，測定浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體的耐酸能力。

1.2.4 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體耐膽鹽能力測定

分別制備浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株L-ZS9。將收集到的菌體分別重懸于膽鹽質(zhì)量濃度為0.2 g/100 m L的MRS培養(yǎng)基中，處理0.5 h。處理結(jié)束后通過平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。實驗每組設(shè)3 個平行，且進行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗。以此確定最適處理膽鹽濃度及處理時間，測定浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體的耐膽鹽能力。

1.2.5 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體基因轉(zhuǎn)錄水平測定

收集浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)菌，按照北京艾德萊生物科技有限公司的TRIpure提取總RNA步驟分別提取兩者總RNA。cDNA的合成參照該公司TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis K it說明書進行，方法如下：總RNA 50 ng～5 μg，Random Primer 1 μL，5×RT Reaction M ix 4 μL，TUREscript H-RTase 1 μL，之后用RNase free H2O定容至20 μL。25 ℃孵育10 m in，42 ℃孵育30～50 m in，65 ℃加熱15 m in失活TUREscript H-RTase。合成的cDNA經(jīng)DNaseⅠ處理后置于-80 ℃條件下待用。

參照L. paraplantarum L-ZS9全基因組序列，選取抗脅迫相關(guān)基因atpβ、atpε、clp、pspC、ccpA以及群體感應(yīng)信號分子AI-2合成關(guān)鍵基因luxS為檢測目標(biāo)，以16S RNA為內(nèi)參基因，運用Primer 3 Input（version0.4.0）設(shè)計引物，用于進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，引物序列見表1。

表1 引物設(shè)計Table 1 Primers used in this study

實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系（20 μL）如下：1 μL cDNA，10 μL 2×Sybgreen，上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L），加7 μL無RNase水。反應(yīng)體系如下：95 ℃預(yù)變性10 m in；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用Livak法[16]。

1.2.6 細(xì)菌上清液制備

將L. paraplantarum L-ZS9接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，置于試管中振蕩培養(yǎng)以形成浮游態(tài)菌體，分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h收集菌液，4 ℃、12 000×g離心15 min，吸取上清液，用0.22 μm濾器過濾，為浮游態(tài)菌體上清液，置于-80 ℃條件下冷凍保存。

將L. paraplantarum L-ZS9接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中靜置培養(yǎng)以形成被膜游態(tài)菌體，分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h重懸菌體，4 ℃、12 000×g離心15 m in，吸取上清液，用0.22 μm濾器過濾，為被膜態(tài)菌體上清液，置于-80 ℃條件下冷凍保存。

將V. harvey i BB 152接種于M B培養(yǎng)基中，在28 ℃ 200 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。4 ℃、12 000×g離心15 m in，吸取上清液，用0.22 μm濾器過濾，為陽性對照上清液，置于-80 ℃條件下冷凍保存。

將E. co li DH 5α接種于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。4 ℃、12 000×g離心15 m in，吸取上清液，用0.22 μm濾器過濾，為陰性對照上清液，置于-80 ℃條件下冷凍保存。

1.2.7 信號分子檢測

將報告菌株V. harveyi BB170接種于MB培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)，至暗室中可見黃綠色熒光。將其按照體積比為1∶5 000轉(zhuǎn)接入新鮮配制的AB培養(yǎng)基中，以體積分?jǐn)?shù)10%的比例加入1.2.6節(jié)中制備好的上清液中，在28 ℃、200 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)5 h，從中量取100 μL于白色酶標(biāo)板，用多功能酶標(biāo)儀生物發(fā)光模式檢測發(fā)光強度，重復(fù)5 孔。進行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗。

1.2.8 添加信號分子AI-2后菌體脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測定

將類植物乳桿菌L-ZS9接種于MRS培養(yǎng)基中，不添加AI-2的為對照組，外源添加至終質(zhì)量濃度為3.84 g/m L的信號分子AI-2的為處理組[14]，培養(yǎng)24 h后，收集菌體，液氮研磨。按照北京艾德萊生物科技有限公司的TRIpure提取總RNA步驟分別提取兩者總RNA。提取過程、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法與程序設(shè)置同1.2.5節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有測試重復(fù)進行平行實驗3 次，用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體耐熱能力比較

圖1 浮游態(tài)和被膜態(tài)L-ZS9耐熱能力比較Fig. 1 Survival rates of p lank tonic and biofi lm cells of L-ZS9 under heat treatment

由圖1可知，浮游態(tài)菌體在80 ℃條件下處理3 m in后存活率平均值為0.15%，被膜態(tài)菌體存活率平均值為0.25%，提高了0.1%。以初始菌數(shù)為108CFU/m L計算，經(jīng)熱處理后被膜態(tài)將比浮游態(tài)多存活105CFU/m L。在實際制備益生菌制劑或發(fā)酵菌劑過程中，由于培養(yǎng)體積的擴大，被膜態(tài)活菌數(shù)將顯著高于浮游態(tài)，這對于實際生產(chǎn)具有重大意義。

從生物學(xué)上來說，溫度對生物存活影響最大，特別是高溫。高溫能破壞微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)和核酸，從而導(dǎo)致其死亡。研究發(fā)現(xiàn)[17]通過差示掃描量熱儀分析保加利亞乳酸菌在62、64、65、66 ℃的耐熱能力，確定加熱處理過程中的損傷部位：64 ℃以下引起細(xì)胞膜的損傷，65 ℃以上引起細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)的損傷，細(xì)胞核糖體的不可逆反應(yīng)也是在65 ℃。生物被膜中菌體間的黏液層可以起到很好的保護作用，減緩熱傳導(dǎo)作用，增強被膜態(tài)菌體的存活率。

2.2 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體耐酸能力比較

胃壁黏膜中含有大量腺體，可以分泌胃液，胃液呈酸性，pH值通常在2.0～3.0之間波動，有時甚至可以達(dá)到1.0。本研究發(fā)現(xiàn)pH 2.8處理1 h后，被膜態(tài)菌株L-ZS9的存活率略高于浮游態(tài)，具有統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2所示。

圖2 浮游態(tài)和被膜態(tài)L-ZS9耐酸能力比較Fig. 2 Survival rates of p lanktonic and biofi lm cells of L-ZS9 under acid treatment

低pH值對菌體生長和代謝產(chǎn)生諸多不利影響稱為酸脅迫。酸脅迫引起胞內(nèi)pH值下降，導(dǎo)致碳水化合物代謝途徑中一些酸敏感的酶活性喪失，嚴(yán)重影響能量供給。同時，酸脅迫會對細(xì)胞膜、大分子物質(zhì)（如DNA和蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷[18]。生物被膜中的胞外多聚物將菌體包裹其中，使菌體生存環(huán)境與低pH值脅迫環(huán)境隔離開來，大大削弱酸脅迫對菌體細(xì)胞膜的直接破壞作用。此外，生物被膜中菌體形成立體的三維結(jié)構(gòu)，其中的營養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓及pH值可形成梯度，這也對低pH值環(huán)境起到了緩沖作用，削弱了低pH值對菌體的殺傷作用，提高菌體存活率。

2.3 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體耐膽鹽能力比較

本研究采用0.2 g/100 m L膽鹽處理菌株L-ZS9 0.5 h，結(jié)果如圖3所示，浮游態(tài)菌體經(jīng)處理后存活率約為28%，被膜態(tài)菌體經(jīng)處理后存活率約為54%，比浮游態(tài)菌體上升約一倍。

膽鹽脅迫對細(xì)菌最直接的危害是破壞細(xì)胞膜。低濃度的膽鹽能夠改變細(xì)胞膜的通透性和流動性，引起一些膜鑲嵌酶類的失活和跨膜轉(zhuǎn)運子的功能紊亂[19]，此外還能改變細(xì)胞表面疏水性和電勢等表面特性。高濃度的膽鹽可以迅速解離細(xì)胞質(zhì)膜和膜蛋白，造成細(xì)胞質(zhì)組分外泄，導(dǎo)致菌體死亡。膽鹽侵入菌體后，能造成DNA損傷、引發(fā)RNA形成異常二級結(jié)構(gòu)、誘使蛋白質(zhì)錯誤折疊變性等。胞內(nèi)的膽鹽解離會同時引起低pH值酸脅迫和滲透壓失衡的產(chǎn)生[20]。由此可見，生物被膜的結(jié)構(gòu)可以抵御膽鹽對細(xì)胞膜的破壞作用，從而提高其存活率。與此同時，研究發(fā)現(xiàn)膽鹽可以促進細(xì)菌生物被膜的形成[21-24]。

膽鹽脅迫可以促進被膜形成，被膜態(tài)可以提高菌體存活率，由此推測，菌體可能通過形成被膜態(tài)來抵抗膽鹽脅迫。其具體的調(diào)控應(yīng)答機制有待進一步研究。

圖3 浮游態(tài)和被膜態(tài)L-ZS9耐膽鹽能力比較Fig. 3 Survival rates of p lanktonic and biofi lm cells of L-ZS9 under bile salt treatment

2.4 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體基因轉(zhuǎn)錄水平比較

圖4 浮游態(tài)和被膜態(tài)L-ZS9基因轉(zhuǎn)錄水平比較Fig. 4 Comparison of genes transcription in planktonic and biofi lm cells of L-ZS9

菌株L-ZS9浮游態(tài)及被膜態(tài)的脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果如圖4所示，被膜態(tài)基因atpβ、atpε、clp、pspC、ccpA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于浮游態(tài)。其中，atpβ、atpε是atp操縱子中亞基的編碼基因。乳酸菌抵御酸脅迫的一個重要機制為依靠三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）輸出質(zhì)子從而維持胞內(nèi)外pH值平衡。F1F0-ATPase在細(xì)菌中普遍存在，既能夠通過利用質(zhì)子來合成ATP，又能利用ATP水解提供的能量將質(zhì)子運送出細(xì)胞。乳酸菌在低pH值環(huán)境中，F(xiàn)1F0-ATPase水解ATP運送質(zhì)子的活性升高，這對于維持胞內(nèi)外pH值梯度非常重要[25-26]。本研究表明在酸脅迫環(huán)境下，被膜態(tài)的F1F0-ATPase可能具有更高的活性，從而更好地維持pH值梯度，有利于菌體的存活。clp為分子伴侶蛋白編碼基因，參與菌體脅迫環(huán)境下多種蛋白質(zhì)的組裝與折疊。CcpA為一般代謝調(diào)控蛋白，PspC為一般壓力蛋白，在菌體抵抗外界環(huán)境壓力過程中發(fā)揮作用。luxS基因為群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子AI-2的關(guān)鍵合成基因[27]，其表達(dá)量與AI-2的合成量密切相關(guān)。AI-2參與調(diào)節(jié)細(xì)菌生物被膜的形成，同時參與其他諸多生理行為[28-32]。菌株L-ZS9被膜態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄水平均高于浮游態(tài)，可推測生物被膜不僅可以為菌體提供結(jié)構(gòu)上的物理保護作用，其細(xì)胞個體也通過調(diào)控多種基因的表達(dá)從而激活抗脅迫機制，其具體分子機制有待進一步研究。

2.5 浮游態(tài)及被膜態(tài)菌體上清液AI-2活性比較

圖5 L-ZS9浮游態(tài)與被膜態(tài)上清液中AI-2的活性比較Fig. 5 Com parison of AI-2 activity in supernatants of p lanktonic and biofi lm cells of L-ZS9

由圖5可知，菌株L-ZS9被膜態(tài)上清液中的A I-2活性顯著高于浮游態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞數(shù)量相同的前提下，聚集態(tài)細(xì)菌比非聚集態(tài)細(xì)菌表現(xiàn)出更強的群體感應(yīng)，這可能是由于聚集態(tài)菌體的細(xì)胞與細(xì)胞間交流的距離更短[33]。微生物作為簡單細(xì)胞，無法從復(fù)雜的環(huán)境中分辨出清楚特定的信息，只能通過它們周圍的信號分子來識別環(huán)境的改變。但是，它們也有自己的防御機制。微生物細(xì)胞通過形成生物被膜來抵御外界環(huán)境的脅迫。因此，菌體細(xì)胞傾向于聚集地生長，形成細(xì)胞聚集體，從而比單細(xì)胞狀態(tài)時更好地抵御環(huán)境的變化[33]。

前期研究表明，外源AI-2可以促進菌株L-ZS9生物被膜的形成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)被膜態(tài)的L-ZS9上清液中具有更強的AI-2活性。根據(jù)以上結(jié)果可推測，菌株L-ZS9的信號分子AI-2與生物被膜兩者之間存在互相促進的正反饋調(diào)控關(guān)系，具體的調(diào)控機制有待進一步研究。

2.6 信號分子AI-2對類植物乳桿菌L-ZS9脅迫相關(guān)基因的影響

上述研究發(fā)現(xiàn)被膜態(tài)菌株L-ZS9比浮游態(tài)具有更強的耐熱、耐酸和耐膽鹽能力，且被膜態(tài)菌體細(xì)胞中脅迫相關(guān)基因atpβ、atpε、clp、pspC、ccpA及群體感應(yīng)關(guān)鍵基因luxS的轉(zhuǎn)錄水平均高于浮游態(tài)菌體。而被膜態(tài)菌體上清液中的信號分子A I-2濃度更高。結(jié)合前期研究AI-2可促進菌株L-ZS9生物被膜的形成。本研究就外源AI-2對脅迫相關(guān)基因及l(fā)uxS轉(zhuǎn)錄水平進行了測定。結(jié)果如圖6所示，外源信號分子AI-2可以上調(diào)基因atpε、clp、ccpA、luxS的轉(zhuǎn)錄水平，其中atpε上調(diào)高達(dá)約140 倍，clp上調(diào)高達(dá)約145 倍，ccpA、luxS則分別上調(diào)約3.8 倍和4.4 倍。AI-2下調(diào)基因atpβ的表達(dá)約至0.07。而外源AI-2對pspC基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著影響。以上結(jié)果表明，信號分子AI-2可以直接調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因atpβ、atpε、clp、ccpA的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響菌株L-ZS9的抗脅迫能力。而AI-2作為自誘導(dǎo)物，可以促進luxS基因的表達(dá)，進一步正反饋促進AI-2合成和分泌，從而增強抗脅迫和生物被膜形成能力。關(guān)于信號分子AI-2對益生乳桿菌抗脅迫能力及被膜形成能力的調(diào)控機制有待進一步深入研究。

圖6 信號分子AI-2對L-ZS9脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 6 Effect of AI-2 on the transcriptional levels of stress resistancerelated genes

3 討 論

細(xì)菌有2 種生存狀態(tài)：自由漂浮的懸浮態(tài)和形成克隆的被膜態(tài)。隨著對生物被膜的深入研究，其重要性漸漸被認(rèn)識到[34]。生物被膜可保護細(xì)菌免受外界環(huán)境的脅迫。關(guān)于在病原微生物和有害微生物的相關(guān)研究非常多，大多集中在如何清除其生物被膜。雖然關(guān)于益生菌生物被膜的相關(guān)研究起步較晚，但已有研究表明一些益生菌的生物被膜具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。例如，Lactobacillus spp.的被膜形成能力可以促進菌株在宿主黏膜表面的黏附，以及延長其存留時間，避免病原微生物的定植[35]。在過去數(shù)年中，科研人員對乳桿菌在非生物材料（玻璃或聚苯乙烯）表面形成生物被膜的能力進行了研究。但研究表明只有部分菌株具備這種能力[35-40]。本實驗室前期研究表明類植物乳桿菌L-ZS9可以在聚苯乙烯材料表面形成生物，且其被膜態(tài)菌體的黏附能力更強[14]。有研究表明L. plantarum subsp. plantarum JCM 1149可以在玻璃表面上形成生物被膜，與其浮游態(tài)菌體相比，被膜態(tài)菌體可以更好地耐受乙酸和乙醇[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)L. reuteri的被膜形成能力與免疫激活作用有關(guān)[13]。本研究首次報道類植物乳桿菌的被膜態(tài)也具有浮游態(tài)不具有的優(yōu)勢，豐富了相關(guān)研究數(shù)據(jù)。

自益生菌的益生功效被發(fā)現(xiàn)以來，其開發(fā)和應(yīng)用發(fā)展迅速，主要經(jīng)過4 個階段[41]。第1代益生菌產(chǎn)品主要應(yīng)用于乳制品領(lǐng)域，包括酸奶或牛奶等。它們?yōu)椴唤?jīng)包被處理的菌株，以浮游態(tài)或冷凍干燥狀態(tài)存在。第2代益生菌產(chǎn)品為藥用膠囊包被的冷凍干燥菌體，膜衣材料常為聚合材料、合成、半合成或天然制藥賦形劑[42-43]。第3代益生菌產(chǎn)品為莢膜包被或微膠囊制備的菌劑[44-45]。就在近幾年時間內(nèi)，第4代益生菌產(chǎn)品研發(fā)正在興起，其主要創(chuàng)新就在于被膜態(tài)益生菌的制備和微膠囊技術(shù)的升級[41]。在此大背景下，本研究就類植物乳桿菌被膜態(tài)與浮游態(tài)的抗逆性進行了研究，并初步發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)信號分子AI-2與被膜形成有關(guān)，為后續(xù)研究的開展提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，類植物乳桿菌L-ZS9的被膜態(tài)比浮游態(tài)細(xì)胞具有更強的耐熱、耐酸和耐膽鹽的抗脅迫能力。被膜態(tài)菌體抗脅迫相關(guān)基因atpβ、atpε、clp、pspC、ccpA以及群體感應(yīng)信號分子AI-2合成關(guān)鍵基因luxS的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于浮游態(tài)細(xì)胞，表明生物被膜除了結(jié)構(gòu)上的物理保護作用外，其個體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生了改變。群體感應(yīng)信號分子AI-2活性檢測實驗發(fā)現(xiàn)，被膜態(tài)上清液中的AI-2比浮游態(tài)上清液中具有更強的活性，表明群體感應(yīng)系統(tǒng)在菌株L-ZS9生物被膜的形成與調(diào)控中發(fā)揮重要作用。以上研究為開發(fā)高活力益生菌制劑提供了新思路，并為進一步研究益生菌生物被膜的功能與調(diào)控提供了重要信息。

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Stress Resistance of Biofi lm and Planktonic Cells of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 Regulated by Autoinducer 2

LIU Lei1, WU Ruiyun2, LI Jun1, LI Pinglan1,*
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

The present study compared the heat, acid and bile resistance of biofi lm and planktonic cells of L-ZS9 by colony counting method. The results showed that biofilm cells had stronger stress resistance than their planktonic counterpart.The transcriptional levels of the stress resistance-related genes atpβ, atpε, clp, pspC and ccpA and the luxS gene encoding the quorum sensing signal autoinducer 2 (AI-2) synthase were investigated in biofi lm and planktonic cells through realtime PCR. The results showed that the transcriptional levels of these genes were up-regulated in biofi lm cells compared to planktonic cells. AI-2 activity were measured by its ability to induce lum inescence in the reporter strain Vibrio harveyi BB170 and the results showed that the supernatant of biofi lm cells had higher AI-2 activity than planktonic cells. Exogenous AI-2 could regulate the transcriptional levels of the atpβ, atpε, clp, ccpA and luxS genes. This study suggested that biofi lm protected the cells by physical defense and biofi lm cells differed from planktonic cells in terms of the transcriptional levels of the investigated genes. The quorum sensing system played an important role in the formation and regulation of biofi lm.This work has laid a foundation for producing functional foods based on biofi lm probiotics w ith high activity.

Lactobacillus paraplantarum L-ZS9; biofi lm; stress resistance; signal AI-2; transcription

10.7506/spkx1002-6630-201722007

Q939.99

A

1002-6630（2017）22-0041-07

劉蕾, 武瑞赟, 李軍, 等. 基于AI-2介導(dǎo)的類植物乳桿菌生物被膜態(tài)與浮游態(tài)抗脅迫能力比較與分析[J]. 食品科學(xué),2017, 38(22): 41-47. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722007. http://www.spkx.net.cn

LIU Lei, WU Ruiyun, LI Jun, et al. Stress resistance of biofilm and planktonic cells of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 regulated by autoinducer 2[J]. Food Science, 2017, 38(22): 41-47. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722007. http://www.spkx.net.cn

2017-01-18

國家自然科學(xué)基金面上項目（31671831；31471707）；北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團隊項目（SCGWZJ201711）

劉蕾（1988—），女，博士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：liulei0606@gmail.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn