田亞晨，貢漢生*，趙 珊，劉文麗，南樹港，楊 婷

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

煙臺地區(qū)引起甜櫻桃采后腐爛霉菌的分離鑒定

田亞晨，貢漢生*，趙 珊，劉文麗，南樹港，楊 婷

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

為明確引起煙臺地區(qū)甜櫻桃采后腐爛的主要霉菌，對煙臺采后腐爛甜櫻桃中的霉菌進行分離，應用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析方法和形態(tài)學觀察將分離的霉菌進行鑒定。選出代表性霉菌菌株回接櫻桃，進行致腐性檢測。結(jié)果表明：從煙臺不同區(qū)縣收集的腐爛櫻桃中分離出的60 株霉菌分屬于6 個種：燕麥赤霉菌（Gibberella avenacea）、總狀毛霉菌（Mucor racemosus）、三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）、互生鏈格孢菌（Alternaria alternate）、奧桑青霉菌（Penicillium polonicum）和煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus），其中互生鏈格孢菌和總狀毛霉數(shù)量較多，分別為14 株和15 株。將這些霉菌中的代表菌株重新接回到甜櫻桃，均能引起甜櫻桃的腐爛。

甜櫻桃；霉菌；分離鑒定

甜櫻桃（Prunus avium L.）又名大櫻桃，是薔薇科、李屬、櫻桃亞屬植物，19世紀70年代從歐洲傳入中國[1-4]。甜櫻桃是我國北方上市最早的高檔鮮食水果之一，素有“春果第一枝”的美稱[5]。甜櫻桃色澤鮮艷，酸甜可口，富含人體所需的各種維生素、微量元素、多酚物質(zhì)和花色苷[6-8]。甜櫻桃本身具有較強的抗氧化能力，在預防疾病和維持人體健康方面起著非常重要的作用[9-10]。甜櫻桃含有的各種有機成分如葡萄糖、蛋白質(zhì)等和無機成分如鐵、鈣、磷、鉀、鈉等成為各種微生物的天然培養(yǎng)基，使其極易污染霉菌而腐爛[11]。櫻桃采后損失可高至50%，其中因腐爛引起的損失在一半以上，2015年我國甜櫻桃產(chǎn)量已超過60萬 t，如腐爛損失率按25%計算，每年因腐爛損失的甜櫻桃在10萬 t以上，經(jīng)濟損失數(shù)十億元[12-13]。

目前國內(nèi)外已報道引起甜櫻桃腐爛的主要有鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、葡萄孢屬（Bo trytis）、鐮刀菌屬（Fusarium）、地絲菌屬（Geotrichum）、盤長孢屬（G loeosporium）、毛霉屬（Mucor）、核盤菌屬（M onilinia）、青霉屬（Penicillium）和根霉屬（Rhizopus）的霉菌[14]。不同地區(qū)引起甜櫻桃腐爛的霉菌種類有所不同，這與不同地區(qū)的氣候特征和鄰近櫻桃園的其他農(nóng)作物污染的霉菌有關。傳統(tǒng)的真菌鑒定方法主要是觀察真菌在培養(yǎng)基上的顏色、形狀、生長狀態(tài)、生長速率及其在顯微鏡下的形態(tài)，進而確定真菌的種屬地位。但由于同種真菌的菌絲和孢子形態(tài)差別較大，某些異種真菌卻有相似的外觀形態(tài)，形態(tài)學鑒定很難完全分清。目前常用于鑒定霉菌的分子生物學方法主要有18S rDNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術[15]。在rDNA基因中，5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列稱為ITS，ITS進化速度快，具有多態(tài)性，因不需要加入成熟的核糖體，所以在進化的過程中能承受更多的變異，其進化速率約為18S rDNA的10 倍，屬于中度保守區(qū)域，利用它可以研究真菌的種及種以下的分類階元[16-17]。

為明確引起煙臺地區(qū)甜櫻桃采后腐爛的霉菌種類，從而有針對性地抑制引起甜櫻桃腐爛的霉菌，為有效防治和解決煙臺地區(qū)甜櫻桃采后腐爛提供依據(jù)，本研究從煙臺市不同區(qū)縣市場上收集采后腐爛的櫻桃從中分離霉菌，并對這些霉菌ITS基因序列進行分析，從分子水平上確定其種屬[18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于分離霉菌的60 份樣品分別取自于煙臺福山區(qū)、萊山區(qū)、芝罘區(qū)、牟平區(qū)、蓬萊市和棲霞市6 個市區(qū)櫻桃市場上已腐爛的美早（Titon）甜櫻桃，每個市場上取10 份腐爛櫻桃樣品。

培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基，在0.10～0.15 MPa，120 ℃滅菌15 m in。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物選用ITS通用引物ITS1和ITS4，由上海生工生物工程股份有限公司合成；真菌基因組DNA提取試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；PCR M aster m ix Thermo Scientific立陶宛分公司。

1.2 儀器與設備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；IX73熒光倒置顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；高速冷凍離心機 上海安亭科技儀器廠；PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；SC850型凝膠成像系統(tǒng) 上海山富科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的培養(yǎng)與純化

在無菌條件下，用接種針挑取腐爛櫻桃表面的菌絲，接種于查氏培養(yǎng)基固體平皿中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，用接種針在長好的菌落邊緣挑取少量菌絲植入另一查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復上述步驟3 次，直至純化得到單一的霉菌。將得到的霉菌轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基保存。1.3.2 ITS序列分析

1.3.2.1 基因組DNA的提取

用無菌刮刀刮取20 mg已純化好的霉菌菌絲于1.5 m L離心管中，加入液氮研磨，按照真菌基因組DNA試劑盒說明書提取霉菌基因組DNA。

1.3.2.2 序列的擴增

應用I T S序列通用引物I T S 1：5’-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，以分離得到的霉菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR體系50 μL，擴增的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性5 m in；94 ℃變性1 m in、55 ℃復性1 m in、72 ℃延伸1 m in，40個循環(huán)；72 ℃保溫10 m in。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Genefounder染色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程股份有限公司純化后測序。

1.3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測序得到菌株的ITS基因序列應用BLAST在GenBank中進行同源性比對，利用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 霉菌的形態(tài)觀察

用接種環(huán)取少量霉菌孢子，在查氏培養(yǎng)基固體平皿中接種成等邊三角形的三點，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察描述霉菌菌落的顏色、生長速度和孢子的顏色等特征。

將滅菌的蓋玻片以45 ℃角插入查氏培養(yǎng)基平皿內(nèi)，插入深度約1/2。用接種環(huán)將菌種接種在蓋玻片與培養(yǎng)基相接的沿線，放置28 ℃培養(yǎng)3～7 d。培養(yǎng)后的菌絲體生長在培養(yǎng)基及蓋玻片上，小心用鑷子將蓋玻片取出，擦去生長較差一面的菌絲體，將生長良好的菌絲體面向載玻片，壓放于滴有1滴乳酸酚棉藍液的載玻片上，用顯微鏡觀察菌絲體和分生孢子著生情況。

1.3.4 霉菌的致腐性鑒定

把分離得到的霉菌重新接種到甜櫻桃上，觀察霉菌生長情況與原腐爛甜櫻桃樣品腐爛癥狀是否相符，如相符可認為是采后病原菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析結(jié)果

2.1.1 ITS基因序列擴增結(jié)果

從60 個腐爛甜櫻桃樣品中共分離純化得到60 株霉菌，將菌株分別編號LD3.0001～LD3.0060。將60 株霉菌通過PCR技術進行ITS序列擴增并用瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了長度為500 bp左右的清晰條帶，可用于后續(xù)鑒定工作，部分瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴增ITS序列瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis analysis of PCR amplified products

2.1.2 同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育關系

采用ITS序列分析方法對60 株霉菌進行鑒定，將PCR擴增后的產(chǎn)物進行測序。測序獲得的ITS基因序列與GenBank中收錄的基因序列進行同源性比較，并將典型菌株的ITS序列提交GenBank，用M EGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。基于ITS序列分析結(jié)果和構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），分離得到的60 株霉菌按照親緣關系分屬于6 個種：燕麥赤霉菌（Gibberella avenacea），8 株；總狀毛霉菌（Mucor racemosus），14 株；三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum），8 株；互生鏈格孢菌（Alternaria a lternate），15 株；奧桑青霉菌（Penicillium polonicum），8 株；煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus），7 株。其中赤霉菌為鐮刀菌的有性階段，都屬于鐮刀菌屬，所以同源性極為接近（圖2）。

圖2 由MEGA 6.0構建霉菌菌株系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of mou lds established by MEGA 6.0

表1 腐爛櫻桃中所含霉菌種類及數(shù)量Tab le 1 Species and numbers of moulds isolated from decayed cherry fruits

每種霉菌中選出1株典型菌株進行后續(xù)實驗，具體見表1。典型菌株LD3.0013、LD3.0026、LD3.0032、LD3.0047、LD3.0058和LD3.0044的ITS序列收錄號分別為KY 056767、KY 056768、KY 056769、KY 056770、KY056771和KY056772。

2.2 霉菌的形態(tài)學分析

2.2.1 霉菌菌落形態(tài)觀察結(jié)果

圖3 霉菌菌落形態(tài)Fig. 3 M ould colonies

將6 株霉菌接種到查氏培養(yǎng)基中，經(jīng)3～5 d培養(yǎng)進行形態(tài)觀察，結(jié)果見圖3。LD3.0013菌落為圓形，菌落中心有不規(guī)則狀白色小突起，菌絲體呈白色，氣生菌絲呈羊毛狀，較疏松，邊緣有緣毛，產(chǎn)生少量孢子。LD3.0026菌落為蓬松的絨毛狀，菌絲初期白色，后頂端變?yōu)榛野咨梁谏?，說明孢子囊大量成熟。LD 3.0032菌落內(nèi)部紅褐色，表面白色，可肉眼觀察到白色氈狀菌絲，氣生菌絲致密，菌絲較短。LD3.0047菌絲褐色至灰黑色，菌落表面呈絨毛狀。LD 3.0058營養(yǎng)體為白色或淡黃色，菌絲較短，培養(yǎng)后期菌落中心及表面產(chǎn)生藍綠色孢子。LD3.0044菌絲早期是無色的，后來漸變?yōu)闇\褐色的氈狀菌落，氣生菌絲較致密，可觀察到大量孢子。

2.2.2 霉菌菌體觀察結(jié)果

將6 株典型霉菌接種到查氏培養(yǎng)基中插片培養(yǎng)，生長3～7 d，乳酸酚棉藍染色液染色后用顯微鏡觀察，6 株霉菌的顯微鏡照片如圖4所示。

圖4 霉菌分離、純化后的顯微形態(tài)特征Fig. 4 M icroscopic morphology of the moulds

根據(jù)圖4顯微鏡觀察到的霉菌顯微形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，LD 3.0013菌絲體疏松，成網(wǎng)狀，菌絲內(nèi)有隔，表面光滑，頂端不形成膨大的頂囊；分支較多，部分分支呈鐮刀形并聚集成束；分生孢子梗不明顯，分生孢子較少，呈卵圓形或圓形。LD 3.0026的菌絲無隔、多核、分枝狀，無假根或匍匐菌絲；菌絲體上直接生出單生、總狀分枝的孢囊梗；各分枝頂端長著球形孢子囊，內(nèi)有不同形狀的囊軸，但無囊托，囊內(nèi)產(chǎn)生大量球形、橢圓形的孢囊孢子。LD3.0032的菌絲有隔，分枝；分生孢子梗分枝或不分枝；分生孢子有兩種形態(tài)，小型分生孢子呈卵圓形至柱形，有隔膜，大型分生孢子鐮刀形或長柱形，有較多的橫隔。LD 3.0047的菌絲有隔，表面光滑，多分枝，頂端形成膨大的孢子頭；分生孢子梗較短，大多數(shù)不分枝，與營養(yǎng)菌絲幾乎無區(qū)別，聚集成網(wǎng)狀；分生孢子較少，少數(shù)為卵圓形。LD 3.0058菌絲有橫隔，基部無足細胞，頂端不形成膨大的頂囊；孢梗莖表面較粗糙，分枝與梗莖有不同程度的叉開，不對稱，頂端不膨大；分生孢子梗，多為單輪生，雙輪生者少；分生孢子，多呈球形；分生孢子鏈疏松而不規(guī)則，散亂彎曲。LD3.0044的菌絲有橫隔，無分枝；分生孢子梗直接生于氣生菌絲，孢梗莖較長，壁光滑透明；分生孢梗莖頂端膨脹后生出產(chǎn)孢細胞；分生孢子為小球形或近球形。

2.3 分離霉菌的致腐性檢測結(jié)果

將分離出的6 種典型霉菌（LD3.0013、LD3.0026、LD3.0032、LD3.0047、LD3.0058和LD3.0044）接種于刺破表皮的新鮮櫻桃上進行致腐性檢測。發(fā)現(xiàn)6 株霉菌均能引起櫻桃的腐爛，腐爛癥狀與原始樣品腐爛癥狀相同，見圖5，它們在果實內(nèi)部或表面發(fā)病，生成絨毛絮狀菌絲，蔓延生長，最后導致全果腐爛。從接種霉菌而腐爛的甜櫻桃上再次分離霉菌，分離得到的霉菌與所接霉菌菌體形態(tài)相同。說明這6 株霉菌是引起煙臺市甜櫻桃采后腐爛的霉菌。

圖5 霉菌回接櫻桃圖Fig. 5 Sweet cherry fruits artifi cially inocu lated w ith the mou lds

3 討 論

霉菌能夠在溫暖和潮濕環(huán)境中迅速繁殖，主要通過小型干性分生孢子附著在塵埃上，形成一定粒徑的生物性粒子懸浮在空氣中而傳播[19]。甜櫻桃一般在5—7月份上市，此時各地區(qū)降雨量大，平均溫度為24～28 ℃，為各類致腐霉菌的孢子萌發(fā)提供了有利的溫濕條件。另外，較高的空氣濕度容易導致甜櫻桃裂果的發(fā)生，如遇降水，會使裂果加劇，形成創(chuàng)口，更易感染病原菌[20]。

本實驗從櫻桃中分離出赤霉菌、鐮刀菌、鏈格孢菌、毛霉菌、青霉菌和曲霉菌6 個菌屬的霉菌，其中鏈格孢菌和毛霉菌占大多數(shù)。研究結(jié)果與以往報道的引起櫻桃腐爛的病原真菌種類有所不同，究其原因可能是病原真菌對不同櫻桃品種的侵染力不同，以及地理環(huán)境、管理水平和氣候條件等方面的差異，而導致引起櫻桃腐爛的病原真菌種類存在一定的差異；此外，不同地區(qū)因長期使用不同抑菌藥物，也可能致使分離所得病原菌種類有所不同。目前國內(nèi)對引起櫻桃腐爛的鐮刀菌和赤霉菌的報道很少，多數(shù)鐮刀菌的生活史包含無性和有性階段，其中赤霉菌為鐮刀菌的有性階段，所以赤霉菌也屬于鐮刀菌屬霉菌。有研究表明，鐮刀菌和赤霉菌主要存在于水稻、小麥等谷物中，不僅引起植物根、莖、葉的腐爛萎蔫造成糧食減產(chǎn)和損失，而且可產(chǎn)生多種真菌毒素如玉米赤霉烯酮和單端孢霉烯及其衍生物富集于谷?；螓溋Ｖ校秤煤笠l(fā)人及家畜肝臟和腎臟衰竭和癌變[21-23]。由于煙臺地區(qū)櫻桃和小麥等糧食作物未能有效分隔種植，使櫻桃在采收期間感染糧谷類致腐菌。本研究未發(fā)現(xiàn)趙遠征等[24]報道的引起櫻桃腐爛的鏈核盤菌，可能是因為鏈核盤菌主要產(chǎn)生褐腐病，患病櫻桃腐爛后干癟在枝頭不易擴散，且采摘時容易避開所以在采后櫻桃中較為少見。

近年來，霉菌及其毒素的污染對農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失[25]。櫻桃貯運過程中很容易發(fā)生霉爛并產(chǎn)生霉菌毒素。鏈格孢菌是導致水果、蔬菜及冷藏食品腐敗變質(zhì)的主要微生物，可以產(chǎn)生多種次生代謝物。目前，從鏈格孢菌中已經(jīng)分離了超過30 種明顯有毒性的毒素，統(tǒng)稱為鏈格孢菌毒素。有研究表明鏈格孢菌毒素具有細胞毒性、基因毒性和致突變、致癌、致畸作用[26-27]。曲霉、青霉和鐮刀菌是產(chǎn)生赭曲霉毒素、展青霉毒素、伏馬菌素等真菌毒素的主要類群，以往研究已經(jīng)證明上述霉菌毒素具有致畸、致癌、致突變等作用[28-31]?，F(xiàn)階段對于產(chǎn)毒霉菌主要通過除濕、控溫、過濾、除氧、紫外線照射、噴灑化學制劑等進行控制[32-33]。

霉菌在糧食、蔬菜和水果等農(nóng)產(chǎn)品上大量存在，由此引起的腐爛以及使人和動、植物中毒的風險，其危害極大。本研究從煙臺地區(qū)采后霉爛的甜櫻桃上共分離鑒定得到赤霉菌、鏈格孢菌、毛霉菌、鐮刀菌、青霉菌和曲霉菌6 個菌屬的霉菌，為今后抑制甜櫻桃的腐爛霉菌提供了理論支持，為新鮮櫻桃運輸、貯藏過程中微生物病害防治提供了參考依據(jù)。

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Screening and Identification of Spoilage Moulds from Postharvest Sweet Cherry in Yantai

TIAN Yachen, GONG Hansheng*, ZHAO Shan, LIU Wenli, NAN Shugang, YANG Ting
(School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

In order to clarify the dom inant mould species causing postharvest decay of sweet cherry in Yantai, spoilage moulds from decayed sweet cherry fruits were screened and identified by internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis.Typical strains were exam ined for colonial morphology and then re-inoculated into sweet cherry to test their pathogenicity.A total of 60 moulds were isolated from decayed sweet cherry from different regions of Yantai, and they were assigned to 6 species based on both ITS sequence analysis and morphological identification, Mucor racemosu, Fusarium tricinctum,Alternaria alternate, Penicillium polonicum and Aspergillus fumigatus. The predom inant species were Alternaria alternate(14 strains) and Mucor racemosu (15 strains). Compared w ith naturally decayed sweet cherry, sweet cherries inoculated w ith moulds were decayed and displayed the same colonial morphology.

sweet cherries; moulds; screening and identification

10.7506/spkx1002-6630-201722005

TS201.3

A

1002-6630（2017）22-0028-06

田亞晨, 貢漢生, 趙珊, 等. 煙臺地區(qū)引起甜櫻桃采后腐爛霉菌的分離鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 28-33.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722005. http://www.spkx.net.cn

TIAN Yachen, GONG Hansheng, ZHAO Shan, et al. Screening and identification of spoilage moulds from postharvest sweet cherry in Yantai[J]. Food Science, 2017, 38(22): 28-33. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722005. http://www.spkx.net.cn

2016-11-29

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301565）；山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2012CQ009）；煙臺市科技計劃項目（2012125）；山東省高等學?？萍加媱濏椖浚↗12LD03）

田亞晨（1995—），女，本科生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工。E-mail：1446144220@qq.com

*通信作者：貢漢生（1981—），男，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工。E-mail：hsgong_221@163.com