張龍崗，劉羽清，朱樹人 楊玲，付佩勝，朱永安

山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250117

烏鱧和雜交鱧4種同工酶的比較研究

張龍崗，劉羽清，朱樹人 楊玲，付佩勝，朱永安

山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250117

通過聚丙烯酰胺垂直梯度電泳法研究了烏鱧(Ophicephalusargus)和雜交鱧(O.argus(♂)×O.maeulata(♀))6種組織中乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、乙醇脫氫酶(ADH)和過氧化物酶(POD)的表達(dá)情況。結(jié)果表明：烏鱧和雜交鱧4種同工酶在6種組織中均表現(xiàn)出一定的組織特異性，同時(shí)在某些同工酶譜中也表現(xiàn)出一定的品種差異性，如MDH和ADH，可作為2種魚的辨別手段之一。

烏鱧(Ophicephalusargus)；雜交鱧(O.argus(♂)×O.maeulata(♀))；同工酶；電泳

烏鱧(Ophicephalusargus)又名黑魚、生魚、鱧魚、才魚等，屬鱸形目鱧科。烏鱧在我國主要分布于長江流域以及北至黑龍江一帶。它生性兇猛，繁殖力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，深受廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛，如今烏鱧在國內(nèi)已成為特種養(yǎng)殖品種之一。雜交鱧為斑鱧(♀)×烏鱧(♂)的雜交子一代，與傳統(tǒng)烏鱧養(yǎng)殖相比，雜交鱧抗病力強(qiáng)、生長速度快、耐低溫低氧(O.maealata)、全程攝食人工配合飼料，受到廣大養(yǎng)殖戶的歡迎。

魚類的同工酶研究始于20世紀(jì)60年代[1]，后來被廣泛應(yīng)用于魚類的物種鑒定、群體遺傳特性、雜交育種等方面的研究[2，3]。為了更深入地了解烏鱧和雜交鱧在生化遺傳特性上的差異，本研究利用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對烏鱧和雜交鱧的眼、肌肉、心臟、脾、肝和腎共6種組織中的乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、乙醇脫氫酶(ADH)和過氧化物酶(POD)等4種同工酶進(jìn)行了研究，旨在探討烏鱧和雜交鱧在生化遺傳水平上的差異以及4種同工酶在不同組織中表達(dá)的組織差異性，為其遺傳改良和品種鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用烏鱧采自微山湖野生種群，共計(jì)5尾，體長23～30cm，體重220～330g。雜交鱧采自微山縣特種水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗(yàn)場，為斑鱧(♀)×烏鱧(♂)雜交子1代，共計(jì)5尾，體長28～31cm，體重280～310g。

1.2方法

1.2.1樣品制備

將烏鱧和雜交鱧采用丁香酚麻醉后，低溫下分別迅速取其脾臟(p)、背部肌肉(j)、心臟(x)、肝臟(g)、眼睛(y)和腎臟(s)，置4℃冰箱中預(yù)冷的生理鹽水中，洗凈血水后，用濾紙吸去多余水分，稱重后置冷凍過的研缽中用剪刀剪碎，然后加入3倍體積(m/v)的4℃冰箱中預(yù)冷的0.05mol/L的Tris-HCl(pH8.8)緩沖液，置冰浴中研磨，研磨成漿后用移液槍吸入EP管中，4℃ 15000r/min離心30min，取上清液加入等體積的40%蔗糖溶液，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2電泳及染色

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，4種同工酶的編號、緩沖系統(tǒng)和凝膠濃度如表 1所示，電泳在4℃展示柜中進(jìn)行。4種同工酶的染色參照文獻(xiàn)[4～6]的相關(guān)方法并適當(dāng)調(diào)整改進(jìn)，4種同工酶的命名和分析采用文獻(xiàn)[7～9]的方法，以各酶帶的相對遷移率(Rf)從小到大依次命名并順序編號。

表1 4種同工酶的編號、緩沖系統(tǒng)和凝膠濃度

2 結(jié)果與分析

2.1乳酸脫氫酶(LDH)的表達(dá)

烏鱧和雜交鱧的LDH電泳圖譜如圖1所示。由圖1可見，烏鱧和雜交鱧的乳酸脫氫酶表達(dá)基本一致，6種組織中一共表達(dá)出5條遷移速率不同的酶帶，有較強(qiáng)的組織差異性。其中，腎臟和脾臟中共表達(dá)出5條酶帶,心臟、肝臟和眼睛中表達(dá)出3條酶帶，眼睛和心臟中只表達(dá)出2條酶帶，肝臟中表達(dá)出4條酶帶，肌肉中只表達(dá)出2條酶帶。都以LDH-1表達(dá)量最多。烏鱧和雜交鱧LDH同工酶在各組織中的表達(dá)基本相同。

W.烏鱧，Z.雜交鱧；j.肌肉，s.腎臟，g.肝臟，y.眼睛，p.脾臟。圖2～4同。圖1 烏鱧和雜交鱧不同組織中LDH酶的表達(dá)圖譜

2.2蘋果酸脫氫酶(MDH)的表達(dá)

烏鱧和雜交鱧MDH的電泳圖譜如圖2所示。由圖2可見，烏鱧的MDH在心臟、肝臟和腎臟中表達(dá)出4條酶帶,在肌肉和眼組織中表達(dá)出2條酶帶,脾臟中表達(dá)出3條酶帶。而雜交鱧肌肉組織中表達(dá)出3條帶，不同于烏鱧肌肉組織。肝臟和心臟中同樣表達(dá)出4條酶帶，脾臟和眼組織中表達(dá)出2條酶帶，而腎臟表達(dá)出 3條酶帶?？梢?，烏鱧和雜交鱧MDH同工酶在6種組織中的表達(dá)具有明顯的組織特異性，同時(shí)也存在著物種特異性。另外，MDH在雜交鱧中表達(dá)量要高于在烏鱧中的表達(dá)量。

圖2 烏鱧和雜交鱧不同組織中MDH酶的表達(dá)圖譜

2.3乙醇脫氫酶(ADH)的表達(dá)

烏鱧和雜交鱧ADH的電泳圖譜如圖3所示。由圖3可見，烏鱧和雜交鱧中ADH的表達(dá)均具有明顯的組織特異性，且在相同組織中，烏鱧的表達(dá)量要高于雜交鱧的表達(dá)量。另外，烏鱧和雜交鱧相同組織中ADH的表達(dá)酶譜基本相似。腎臟和心臟中表達(dá)出2條酶帶，肝臟和脾臟中只表達(dá)出1條酶帶，而肌肉和眼睛中沒有表達(dá)。

圖3 烏鱧和雜交鱧不同組織中ADH酶的表達(dá)圖譜

2.4過氧化物酶(POD)的表達(dá)

一般認(rèn)為烏鱧POD是由2個(gè)位點(diǎn)控制的四聚體酶。烏鱧和雜交鱧不同組織的POD電泳圖譜如圖4所示。由圖4可見，烏鱧和雜交鱧6種組織中POD酶譜共檢測到3～6條酶帶，其中肝臟中POD表達(dá)為6條譜帶，而肌肉、腎臟、心臟及脾臟中均具有3條酶帶；眼睛中檢測到4條酶帶。

3 討論

對烏鱧和雜交鱧6種組織中LDH、ADH、MDH和POD的研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧和雜交鱧4種同工酶在6種組織中均表現(xiàn)出了一定的組織特異性，同時(shí)在某些同工酶譜中也表現(xiàn)出一定的品種差異性，有的甚至很明顯。如：雜交鱧肌肉組織中表達(dá)出3條帶，而烏鱧肌肉組織中只表達(dá)出2條酶帶；POD-1酶帶只在肝臟中有表達(dá)，而ADH-2酶帶在烏鱧脾臟中表達(dá)，在雜交鱧脾臟中則不表達(dá)。此外，烏鱧和雜交鱧的相同組織中的各種酶的表達(dá)強(qiáng)度也存在差異。同工酶基因的表達(dá)與物種和個(gè)體發(fā)育階段相關(guān)，基因的差別表達(dá)決定了不同品種、不同個(gè)體的發(fā)育過程[10]。

雜交子代基因的表達(dá)通常有父母本基因的同步表達(dá)、非同步表達(dá)和單方親本的基因表達(dá)等，當(dāng)種間同工酶的遷移率相同而活性不同時(shí)，雜交子代的同工酶活性常介于兩親本之間[11]。本研究中，烏鱧和雜交鱧4種同工酶在6種組織中均表現(xiàn)出了一定的組織特異性，同時(shí)雜交鱧的同工酶表達(dá)和烏鱧比較也稍有差異，從這一點(diǎn)上來看，基本符合上述規(guī)律。劉凱等[12]研究了雜交鱧及其親本不同組織的同工酶表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)LDH和MDH 2種同工酶在各自群體內(nèi)具有明顯的組織特異性，其雜交后代親本有一定的相似性，在同工酶酶譜中出現(xiàn)了互補(bǔ)帶和雜交帶，他認(rèn)為符合雜交育種的一般規(guī)律。這與本研究結(jié)果也基本一致。但也存在差異，造成差異的原因是多方面的。如試驗(yàn)樣品取自不同的地理種群，由于其生長環(huán)境不同，不同的地理種群產(chǎn)生的蛋白質(zhì)會在種類和表達(dá)量上發(fā)生變化以進(jìn)行不同的生態(tài)適應(yīng)。此外，由于凝膠濃度、緩沖系統(tǒng)、電泳條件以及染色方法的不同，不同的電泳方法可產(chǎn)生不同的電泳圖像，也會導(dǎo)致不同的分析結(jié)果[13]。

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2017-05-08

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系育種崗位項(xiàng)目(SDAIT-12-01)。

張龍崗(1982-)，男，碩士，助理研究員，主要從事魚類遺傳育種研究，zlg-0302@163.com。

[引著格式]張龍崗,劉羽清,朱樹人,等.烏鱧和雜交鱧4種同工酶的比較研究J.長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2017，14(18)：33～36.

Q959.481；Q55

A

1673-1409(2017)18-0033-04

[編輯] 余文斌