陳剛，馬曉，郝苗青，趙奇

（1.鄭州師范學(xué)院，河南鄭州450044；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450046）

“鳳丹”牡丹果皮多糖提取研究

陳剛1，馬曉2，郝苗青1，趙奇1

（1.鄭州師范學(xué)院，河南鄭州450044；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450046）

以水酶法提取"鳳丹"牡丹果皮多糖，以提取溫度、提取液pH值、纖維素酶用量、提取時(shí)間為考察因素，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果表明多糖提取的最優(yōu)提取條件組合為提取溫度55℃、提取液pH 4.5、纖維素酶用量0.8%、提取時(shí)間80 min時(shí)，牡丹果皮多糖得率達(dá)到最大，為（34.196±0.379）mg/g。

"鳳丹"牡丹果皮；多糖；提取工藝；正交試驗(yàn)

牡丹籽油在2011年被認(rèn)定為新資源食品，“鳳丹”牡丹（Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’）是榨取牡丹籽油常用的品種之一，隨著牡丹籽油的急性肝損傷保護(hù)[1]、抗糖尿病[2]、降血脂[3]、降血糖[4]、防曬[5]等保健功能[6-8]逐漸被人們重視，其種植面積將逐年擴(kuò)大，其副產(chǎn)物——果皮也將大量產(chǎn)生，為果皮資源的再利用提供技術(shù)支持是非常迫切的。牡丹葉片[9]、根皮[10]、種仁[11]等部位的多糖提取工藝均有研究，而牡丹果皮多糖提取工藝卻未見報(bào)道，本文擬對(duì)“鳳丹”牡丹果皮提取工藝進(jìn)行初步研究，以期對(duì)牡丹果皮資源開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

“鳳丹”牡丹果皮：將2016年8月采收的五年生實(shí)生苗“鳳丹”牡丹果皮置于室內(nèi)陰干，9月于鼓風(fēng)干燥箱60℃烘干后用旋風(fēng)磨制粉，過100目篩，干粉貯于棕色瓶內(nèi)備用。

葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖：sigma公司；濃硫酸、濃鹽酸：河南東科化工產(chǎn)品銷售有限公司；蒽酮：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；纖維素酶（酶活力為400 U/mg）：南京都萊生物技術(shù)有限公司。

DHG-9140型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T6型紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JA3003N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；FOSS SCINO CT410旋風(fēng)磨：杭州嘉維創(chuàng)新科技有限公司；MINI型超純水機(jī)：湖南科爾頓水務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考王婉冰[12]的方法，有改進(jìn)。用天平稱取50 mg的混糖（葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖，每種各10 mg）放入燒杯，加蒸餾水，攪拌，待溶解后定容至100 mL。用移液槍量取混和溶液于7支試管中，在試管上分別編號(hào)1至7號(hào)，7只試管分別量取含 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g 混標(biāo)糖體積的混合液，向7只試管中加入蒸餾水，使每支試管的溶液體積均達(dá)到1.0 mL，蒽酮硫酸比色法[13]測(cè)吸光度，擬合線性回歸方程。

1.2.2 牡丹果皮多糖的提取

牡丹果皮多糖提取試驗(yàn)于燒杯中加入0.4 g“鳳丹”牡丹果皮干粉，加入10 mL相應(yīng)pH值的鹽酸緩沖液振蕩均勻后再加入不同用量的纖維素酶，搖勻后置于相應(yīng)溫度的水浴鍋中提取相應(yīng)時(shí)長，自然冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并用相應(yīng)pH值的鹽酸緩沖液定容，4 000 r/min離心5 min后，取上清液備用。

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

在提取液pH4、纖維素酶用量為0.5%、提取70min的條件下，考察提取溫度為 45、50、55、60、65、70 ℃時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

在提取溫度50℃、纖維素酶用量為0.5%、提取70 min的條件下，考察提取液 pH 為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

在提取溫度50℃、提取液pH 4、提取70 min的條件下，考察纖維素酶用量分別為果皮質(zhì)量的0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

在提取溫度50℃、提取液pH 4、纖維素酶用量為0.5%的條件下，考察提取時(shí)間為 50、60、70、80、90、100 min時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)提取溫度、提取液pH值、纖維素酶用量和提取時(shí)間等4個(gè)因素的條件進(jìn)行優(yōu)化，方案設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.3 多糖得率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取“鳳丹”牡丹果皮干粉提取液1 mL，用蒽酮-硫酸比色法測(cè)吸光度，將結(jié)果代入制作好的混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)，根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果。多糖得率計(jì)算公式如下：

式中：C為根據(jù)測(cè)定吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中多糖濃度，mg/mL；V為提取上清液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為果皮質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of sugar mixture

根據(jù)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及其對(duì)應(yīng)的吸光度，擬合線性方程為y=0.822 4x+0.014 8，R2=0.993 5，式中：y為吸光度值；x為混標(biāo)糖含量。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響

提取溫度對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of extaction temperature on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由圖2可知，提取溫度對(duì)多糖的得率影響較大。45℃到55℃范圍內(nèi)，多糖得率隨著提取溫度的增加而增加，提取溫度為55℃時(shí)多糖得率為23.494 mg/g，達(dá)到最大值，這可能是由于提取溫度的升高，促進(jìn)了多糖在反應(yīng)溶液中的溶出，提高了多糖得率；但當(dāng)提取溫度為55℃到70℃范圍內(nèi)時(shí)，多糖得率反而逐漸降低，這可能是由于提取溫度過高，導(dǎo)致多糖在高溫環(huán)境中有部分被破壞。方差分析結(jié)果表明，提取溫度為55℃時(shí)的多糖得率顯著（p＜0.05）大于其他幾個(gè)處理水平的多糖得率。因此，選取50、55、60℃3個(gè)水平用于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.2 提取液pH值對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響

提取液pH值對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響見圖3。

圖3 pH值對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of pH on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由圖3可知，pH4.5時(shí)，多糖得率最大，為23.465 mg/g，這是因?yàn)槊阜肿踊钚圆课换鶊F(tuán)受pH值影響。在最適pH值時(shí)，底物最適與酶分子上活性基團(tuán)結(jié)合。pH值高于或低于最適pH值時(shí)，活性基團(tuán)的解離狀態(tài)將發(fā)生改變，酶和底物的親和力降低，表現(xiàn)為酶促反應(yīng)速度降低。因此，選用pH 4.0、4.5、5.0進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.3 纖維素酶用量對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響

纖維素酶用量對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響見圖4。

圖4 纖維酶素用量對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響Fig.4 Effect of cellulase content on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由圖4可知，隨著纖維素酶用量的增加，多糖得率是逐漸上升的。在0.4%到0.7%的區(qū)間內(nèi)多糖得率增加最快，可能是由于添加了纖維素酶后有利于果皮中纖維素的降解，促進(jìn)了果皮中多糖的溶出，提高了多糖得率；當(dāng)纖維素酶用量為0.7%到0.9%時(shí)，多糖得率增加速度緩慢，這可能是由于纖維素酶添加量過高，纖維素酶水解纖維素的功能不能得到充足的表現(xiàn)，對(duì)多糖溶出的促進(jìn)作用表現(xiàn)不明顯。方差分析結(jié)果表明，0.7%、0.8%和0.9%3個(gè)處理水平之間沒有顯著性（p＞0.05）差異。故選取0.6%、0.7%和0.80%3個(gè)水平用于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響Fig.5 Effect of extaction time on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由圖5可以看出，不同的提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響是不同的。提取時(shí)間在50 min到80 min范圍內(nèi)時(shí)，多糖的得率是逐漸上升的，可能是由于提取時(shí)間的延長，有較多的多糖溶解到溶液中；提取時(shí)間為80、90、100 min 時(shí)，多糖的得率分別為 23.860、24.322、24.466 mg/g，且此3個(gè)水平之間沒有顯著性差異（p＞0.05），這可能由于多糖在較高的溫度條件下保持時(shí)間較長而被破壞，抵消了由于提取時(shí)間的延長而對(duì)多糖得率增加的緣故。通過單因素試驗(yàn)選取70、80、90 min 3個(gè)處理水平用于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test L9（34）

續(xù)表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal test L9（34）

由表2可知，影響“鳳丹”牡丹果皮干粉多糖得率的主次順序?yàn)樘崛囟扔绊懽畲?，其次是提取液pH值，再次是提取時(shí)間，最后是纖維素酶用量。

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of ANOVA

由表3可知，提取溫度、提取液pH值、提取時(shí)間3個(gè)試驗(yàn)因素均達(dá)到顯著（p＜0.05）水平，表明試驗(yàn)中的提取溫度、提取液pH值、提取時(shí)間均顯著（p＜0.05）地影響多糖的得率。而纖維素酶用量對(duì)多糖得率的影響未達(dá)到顯著性（p＞0.05）水平。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)極差分析可知，當(dāng)組合為A2B2C3D2，即提取溫度55℃、提取液pH 4.5、纖維素酶用量0.8%、提取時(shí)間80 min時(shí)，“鳳丹”牡丹果皮多糖得率將達(dá)到最大。由于此組合未出現(xiàn)在上述正交試驗(yàn)組合中，故按此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出最優(yōu)組合提取條件下的多糖得率為（34.196±0.379）mg/g，高于正交試驗(yàn)中任一提取工藝組合的多糖得率。

3 討論

本研究采用水酶法從“鳳丹”牡丹果皮中提取多糖，考察了提取溫度、提取液pH值、纖維素酶用量、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)“鳳丹”牡丹果皮多糖得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出“鳳丹”牡丹果皮多糖提取的最優(yōu)條件為提取溫度55℃、提取液pH 4.5、纖維素酶用量0.8%、提取時(shí)間80 min，按此提取工藝，多糖的得率為（34.196±0.379）mg/g，大大提高了多糖得率，節(jié)約了能源，提高了效率，本試驗(yàn)可以為“鳳丹”牡丹果皮資源開發(fā)提供依據(jù)，為“鳳丹”牡丹果皮的再利用提供理論支持。

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Extraction of Polysaccharide in Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’Pericarp

CHEN Gang1，MA Xiao2，HAO Miao-qing1，ZHAO Qi1
（1.Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，Henan ，China；2.Henan Polytechnic College，Zhengzhou 450046，Henan，China）

The aqueous enzymatic extraction of polysaccharides of peony （Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’）pericarp was studied.The extraction temperature，pH of extraction solution，cellulose amount，extraction time on the extraction yield of polysaccharides was assessed with an orthogonal test to confirm the optimal extractive parameters.The orthogonal test results showed that the optimal process combination was extraction temperature 55℃，pH 4.5 of extraction solution，cellulose amount 0.8%，extraction time 80 min with the maximum yield of polysaccharides of（34.196±0.379）mg/g.

Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp；polysaccharide；extraction technology；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.009

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（172102110219）；鄭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（153PKJGG148）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16B550008）

陳剛（1979—），男（漢），講師，碩士研究生，主要從事生物活性物質(zhì)提取及功能研究工作。

2017-03-30