吳 楊 賀 俐 黃 勇 張木清

(1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)院，吉安 343009； 2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

利用pmi標(biāo)記基因篩選培育轉(zhuǎn)EaDREB2B基因甘蔗

吳 楊1,2賀 俐1黃 勇1張木清2

(1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)院，吉安 343009；2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

利用已構(gòu)建的植物表達(dá)載體prd29a-dreb-hyg，通過(guò)酶切連接到含有磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)的表達(dá)質(zhì)粒pZMLR14上，構(gòu)建植物表達(dá)載體pDREB-PMI。利用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷，經(jīng)過(guò)甘露糖篩選，共獲51株抗性苗，轉(zhuǎn)化再生頻率為4.25%。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明有8株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因無(wú)性系。氯酚紅試驗(yàn)表明標(biāo)記磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因在轉(zhuǎn)基因株系中均有表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因T1代甘蔗植株進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明EaDREB2B基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系T1代中穩(wěn)定遺傳。該結(jié)果為進(jìn)一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基礎(chǔ)。

甘蔗；pmi基因；甘露糖

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，但干旱是造成我國(guó)甘蔗單產(chǎn)低、品質(zhì)差的主要原因之一。根據(jù)發(fā)達(dá)國(guó)家的生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育抗旱性強(qiáng)、水分利用率高的作物或品種是提高農(nóng)業(yè)水分效率的最有效措施之一[1]。甘蔗無(wú)性繁殖，高度多倍性，遺傳背景復(fù)雜的特點(diǎn)使其利用常規(guī)雜交育種方法實(shí)現(xiàn)遺傳改良十分困難。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一困難提供了新途徑，使在優(yōu)良品種中導(dǎo)入目的基因進(jìn)行品種遺傳改良成為可能[2～3]。同時(shí)，甘蔗在世界上大部分地區(qū)不開(kāi)花，轉(zhuǎn)基因植株所帶來(lái)的抗性基因不會(huì)隨花粉發(fā)生“基因漂流”而對(duì)環(huán)境造成危害，而且作為生產(chǎn)蔗糖和乙醇的工業(yè)原料，經(jīng)高溫?zé)捴?，用外源轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的甘蔗新品種對(duì)環(huán)境和食品基本沒(méi)有潛在威脅，因此也是理想的開(kāi)展轉(zhuǎn)基因育種的作物。

轉(zhuǎn)錄因子DREB是AP2/EREBP(APETALA2/ethylene responsive element binding protein)基因家族的一個(gè)亞家族，在脅迫應(yīng)答基因表達(dá)中起著重要作用。自Stockinger等[4]從擬南芥中分離出編碼DRE結(jié)合蛋白的cDNA以來(lái)，已經(jīng)從多種植物中分離出許多基因。研究表明，利用轉(zhuǎn)錄因子提高植物抗逆性，能獲得較為理想的效果，一個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(dá)[5]。逆境條件下，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)DREB基因植株，脯氨酸含量、可溶性糖明顯高于對(duì)照，說(shuō)明過(guò)表達(dá)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游基因，并且與游離脯氨酸、可溶性糖等功能蛋白基因的合成有關(guān)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因株系的抗逆能力[6]。李墨野等[7]通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)LbDREB基因大青楊的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因各株系在生長(zhǎng)和生理指標(biāo)上較對(duì)照具有明顯優(yōu)勢(shì)，且LbDREB基因瞬時(shí)表達(dá)顯著升高，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性顯著增強(qiáng)。Chen[8]等在綠豆中克隆得到一個(gè)DREB2A基因(VrDREB2A)，過(guò)表達(dá)該基因可以增強(qiáng)玉米的抗熱性。Mizoi等[9]從大豆中分離得到一個(gè)新的DREB2基因(GmDREB2A;2)，該基因在干旱脅迫下具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中能調(diào)控大量脅迫基因的表達(dá)，從而顯著增強(qiáng)植物的抗旱性。

目前在甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記基因有抗除草劑和抗生素基因，但是這兩類基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境和人類健康潛在的安全性問(wèn)題越來(lái)越引起全世界的關(guān)注，制約著轉(zhuǎn)基因甘蔗的商業(yè)化生產(chǎn)。因此，開(kāi)發(fā)利用安全的篩選體系對(duì)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。以糖代謝酶基因磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase，PMI)基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的方法，對(duì)人體健康和環(huán)境安全無(wú)危害[10]。磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因來(lái)自大腸桿菌，自然界中除肉桂和大多數(shù)豆類含有磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因外大多數(shù)植物都不含有該基因[11]，但在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物及人體中磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因廣泛存在，目前已經(jīng)從這些生物中克隆到Pmi基因。將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峁荹12]，在以甘露糖為單一碳源的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化子可以正常生長(zhǎng)，非轉(zhuǎn)化子因?yàn)闊o(wú)法利用甘露糖不能正常生長(zhǎng)[13]。自從1998年Joersbo等將PMI/甘露糖陽(yáng)性篩選系統(tǒng)用于篩選甜菜轉(zhuǎn)基因植物以來(lái)，現(xiàn)已用于不同植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選中[14～15]。

為了獲得抗旱且對(duì)環(huán)境安全的轉(zhuǎn)基因甘蔗，本研究以福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗研究所選育的早熟高糖高產(chǎn)品種福農(nóng)95-1702為材料，利用從甘蔗近緣屬斑茅中克隆得到的EaDREB2B基因構(gòu)建以pmi基因(manA)為選擇標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，以期培育出抗旱行強(qiáng)且對(duì)環(huán)境具有安全性的轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系。

1 材料和方法

1.1 材料

甘蔗品種福農(nóng)95-1702(SaccharumofficinarumL.)由福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗研究所提供。大腸桿菌(E.coli)DH5α由農(nóng)業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。真核表達(dá)載體pZMLR14由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良與生理生態(tài)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供；pRd29a-dreb-hyg植物表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；用于本研究的其他工具酶和生化試劑等購(gòu)自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體pDREB-PMI的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pRd29a-dreb-hyg表達(dá)載體用HindⅢ進(jìn)行酶切，回收純化含EaDREB2B基因的表達(dá)框，連接到用同樣內(nèi)切酶切開(kāi)的載體pZMLR14中。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，利用氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取單菌落接種于300 μL含80 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 150 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng)。以10 μL菌液為模板，在EaDREB2B基因上設(shè)計(jì)引物DP1:5′-CCAAGGAGATGGAGTTAGAG-3′，DP2：5′-GAATCATTACCACCAGGCT-3′，兩引物之間片段大小約為650 bp，檢測(cè)EaDREB2B基因是否插入到表達(dá)載體中，在此基礎(chǔ)上提取質(zhì)粒并用HindⅢ進(jìn)行酶切以驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。

1.2.2 甘露糖對(duì)甘蔗愈傷組織分化的影響

選取生長(zhǎng)旺盛、直徑約2 mm的愈傷組織塊為試驗(yàn)材料，接種到不同質(zhì)量濃度甘露糖和蔗糖配比的分化培養(yǎng)基中，每個(gè)試驗(yàn)濃度接種3瓶，每瓶15塊材料。設(shè)置6種甘露糖和蔗糖的質(zhì)量配比，記錄分析甘蔗愈傷分化對(duì)甘露糖的敏感性。設(shè)定甘露糖和蔗糖的總含量為30 g·L-1，甘露糖的質(zhì)量濃度分別為0、1、2、3、4和5 g·L-1。35天后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷的分化情況，選擇最佳的甘露糖篩選濃度。

1.2.3 甘露糖對(duì)甘蔗無(wú)菌苗生根的影響

選取生長(zhǎng)旺盛長(zhǎng)勢(shì)一致，株高4～5 cm的分化苗為試驗(yàn)材料，接種到含有不同質(zhì)量濃度(同1.2.2)甘露糖的生根培養(yǎng)基中，每個(gè)試驗(yàn)濃度接種3瓶，每瓶15棵苗。35天后觀察統(tǒng)計(jì)無(wú)菌苗生根情況，確定甘蔗無(wú)菌苗生根培養(yǎng)基中的甘露糖最佳篩選濃度。

1.2.4 甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化

本試驗(yàn)采用基因槍轉(zhuǎn)化法，轟擊前挑選生長(zhǎng)旺盛的甘蔗胚性愈傷組織接種于高滲培養(yǎng)基(MS+2 mg·L-12,4-D+0.2 mol·L-1山梨醇+0.2 mol·L-1甘露醇+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂粉，pH5.8)中進(jìn)行預(yù)處理。基因槍為Bio-Rad公司PDS-1000/He型，轟擊前將預(yù)處理的愈傷組織集中在培養(yǎng)皿的中心位置，每皿轟擊1次。本研究選擇28英寸汞柱真空度，1 100 psi的轟擊壓力和6 cm的轟擊距離作為轟擊參數(shù)。具體步驟參照儀器操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轟擊后將愈傷組織繼續(xù)滲透處理18h，然后轉(zhuǎn)接至不含甘露糖的繼代培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)1周，最后接種到誘導(dǎo)不定芽的甘露糖篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，待不定芽長(zhǎng)至2 cm時(shí)接到添加最適濃度甘露糖的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.5 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

PCR檢測(cè)：采用CTAB法提取甘蔗基因組DNA，在rd29A啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)上游引物S1:5′-CGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTC-3′和目的基因處設(shè)計(jì)下游引物S2:5′-CCTTTACCTTTCATACAGCCTTTC-3′，兩引物之間片段大小為364 bp，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸50 s，循環(huán)40次；72℃延伸反應(yīng)7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在成像系統(tǒng)下拍照分析。

點(diǎn)雜交檢測(cè)：提取PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的甘蔗植物總DNA作模板，采用地高辛標(biāo)法對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，具體操作方法參照Roche DNA Labeling and Detection Kit雜交試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

RT-PCR檢測(cè)：參照Invitrogen Trizol Reagent RNA提取試劑盒方法提取葉片總RNA，采用TakaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，使用引物DP1、DP2進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因甘蔗的氯酚紅檢測(cè)

配制1/2MS+3 g·L-1甘露糖+50 g·L-1氯酚紅溶液，過(guò)濾滅菌后滴至無(wú)菌的2 mL離心管中，并分別放入面積、鮮質(zhì)量相當(dāng)，苗齡相同的轉(zhuǎn)基因葉片和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~片，密封后置于27℃培養(yǎng)箱，暗培養(yǎng)4 d后觀察氯酚紅溶液顏色的變化，具體操作方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1植物表達(dá)載體pDREB-PMI的構(gòu)建及重組鑒定

將prd29a-dreb-hyg質(zhì)粒用HindⅢ酶切，通過(guò)瓊脂糖電泳回收DREB基因整個(gè)表達(dá)框；同時(shí)利用HindⅢ酶切pZMLR14表達(dá)載體把環(huán)狀表達(dá)載體打開(kāi)，電泳回收載體片段。將線性DREB表達(dá)框和切開(kāi)后pZMLR14表達(dá)載體相連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用基因特異性引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示，重組表達(dá)載體擴(kuò)增條帶大小約為650 bp，與預(yù)期結(jié)果一致；將得到的陽(yáng)性重組菌提取質(zhì)粒后，經(jīng)HindⅢ酶切電泳后，得到大小約為1 920 bp的片段，與預(yù)期一致(圖2)。由此可以證明pDREB-PMI植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 重組菌pDREB-PMI的PCR鑒定 M. DL2000(TakaRa)；1.陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒DNA)；2.空白對(duì)照；3～16.重組菌Fig.1 PCR Identification of Recombinant bacteria pDREB-PMI M. DL2000(TakaRa); 1.Plasmid DNA(Postive control); 2.Blank control; 3-17.Recombinant bacteria

圖2 植物表達(dá)載體pDREB-PMI酶切鑒定M.TaKaRa Wide Range DNA Marker (500～12 000)；1,3.重組質(zhì)粒pDREB-PMI/HindⅢ；2,4.重組質(zhì)粒Fig.2 Identification of plant expression vector pDREB-PMI by restriction digestionM.TaKaRa Wide Range DNA Marker (500～12 000); 1,3.Recombinant plasmid pDREB-PMI/HindⅢ; 2,4.Recombinant plasmid

2.2 甘蔗對(duì)甘露糖的敏感性試驗(yàn)

2.2.1 甘露糖濃度對(duì)甘蔗愈傷組織分化的影響

為了有效篩選出轉(zhuǎn)化植株，淘汰非轉(zhuǎn)化植物，選取生長(zhǎng)旺盛、直徑約2 mm的甘蔗愈傷組織塊接種到不同質(zhì)量濃度甘露糖和蔗糖配比的分化培養(yǎng)基中，通過(guò)觀察愈傷組織分化情況確定甘露糖的臨界耐受濃度。結(jié)果如圖3，當(dāng)甘露糖質(zhì)量濃度為1 g·L-1時(shí)，愈傷組織分化正常。甘露糖質(zhì)量濃度為2 g·L-1時(shí)，愈傷組織分化受到了嚴(yán)重影響， 只看到少量綠色芽點(diǎn)。甘露糖質(zhì)量濃度為3 g·L-1時(shí)，少量分化的外植體后期黃化死亡。為此，選擇3 g·L-1的甘露糖濃度用于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化分化階段的選擇壓。

2.2.2 甘露糖濃度對(duì)甘蔗無(wú)菌苗生根的影響

甘露糖能抑制無(wú)菌苗生根，轉(zhuǎn)化植株在含有甘露糖的培養(yǎng)基上正常生根，非轉(zhuǎn)化植株將不能生根死亡。為了有效篩選抗性植株，將無(wú)菌苗莖段接種到不同質(zhì)量濃度的甘露糖和蔗糖培養(yǎng)基中。通過(guò)觀察甘蔗無(wú)菌苗生根情況確定甘露糖的臨界耐受濃度。結(jié)果如圖4，當(dāng)甘露糖質(zhì)量濃度為1或2 g·L-1時(shí)，無(wú)菌苗能長(zhǎng)出新根。當(dāng)甘露糖質(zhì)量濃度為3 g·L-1時(shí)，無(wú)菌苗生根受到抑制。隨著甘露糖質(zhì)量濃度的不斷增加，根系無(wú)法生長(zhǎng)，葉片開(kāi)始變黃，基部也開(kāi)始褐化。為此，本研究在進(jìn)行促根篩選時(shí)，以3 g·L-1甘露糖作為篩選濃度。

圖3 甘露糖濃度對(duì)甘蔗愈傷組織分化的影響Fig.3 Results of callus differentiation under different mannose selection pressures

圖4 生根培養(yǎng)對(duì)甘露糖的敏感性Fig.4 Results of rooting under different mannose selection pressures

2.3 轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)

2.3.1 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)

利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)，共轟擊15個(gè)培養(yǎng)皿1 200個(gè)愈傷組織塊，獲得51株幼苗，轉(zhuǎn)化再生頻率為4.25%。對(duì)篩選獲得的抗性植株分別提取葉片DNA，進(jìn)行目的基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果有8株擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性條帶，與質(zhì)粒擴(kuò)增的條帶大小相同，而非轉(zhuǎn)化植株對(duì)照植株中未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶(圖5)。初步證明外源EaDREB2B基因已整合到甘蔗基因組中。

圖5 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) M. 250 bp DNA Ladder Marker(TakaRa)；1.質(zhì)粒DNA(陽(yáng)性對(duì)照)；2.空白對(duì)照；3.未轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照)；4～17.轉(zhuǎn)化甘蔗植株Fig.5 The PCR detection of transformed sugarcane M. 250 bp DNA Ladder Marker(TakaRa); 1.Plasmid DNA(Positive control); 2.Blank control; 3.Nontransformed sugarcane(negative control); 4-17.Transformed sugarcane

2.3.2 轉(zhuǎn)化植株的點(diǎn)雜交(Dot-blotting)檢測(cè)

為了進(jìn)一步確定目的片段整合到甘蔗基因組中，以pDREB-PMI植物表達(dá)載體質(zhì)粒DNA為模板，利用PCR檢測(cè)引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，將獲得的產(chǎn)物片段回收純化用作雜交探針，對(duì)8株P(guān)CR呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在進(jìn)行雜交分析時(shí)，選取2個(gè)PCR檢測(cè)呈陰性的非轉(zhuǎn)基因抗性植株作為質(zhì)控點(diǎn)(圖6)。8株陽(yáng)性植株都出現(xiàn)和質(zhì)粒對(duì)照一樣的雜交信號(hào)，表明目的片段已整合到甘蔗基因組中。

圖6 轉(zhuǎn)化植株的點(diǎn)雜交分析1.質(zhì)粒；2.未轉(zhuǎn)基因甘蔗；3～12.抗性轉(zhuǎn)化植株 3～4、6～7、9～12. PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株Fig.6 Dot blotting analysis of transformed sugarcane1.Plasmid; 2.Non-transgenic sugarcane; 3-12.Putative transgenic sugarcane

2.3.3 轉(zhuǎn)基因甘蔗的RT-PCR檢測(cè)

為了檢測(cè)干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因甘蔗中EaDREB2B基因能否在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A的驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)錄表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)將點(diǎn)雜交呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱脅迫后，對(duì)其葉片提取RNA后進(jìn)行RT-PCR分析。鑒定結(jié)果表明(圖7)：在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因甘蔗中的EaDREB2B基因均能在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。

圖7 轉(zhuǎn)基因甘蔗的RT-PCR分析M. DL2000 Marker(TakaRa)；P.質(zhì)粒；B.空白對(duì)照；CK.未轉(zhuǎn)基因甘蔗；1～8.轉(zhuǎn)基因甘蔗Fig.7 RT-PCR analysis of the EaDREB2B expression in transgenic sugarcaneM.DL2000 Marker(TakaRa)；P.Plasmid；B.Blank control；CK.Untransformed sugarcane(negative control)；1-8.Transformed sugarcane

2.3.4 轉(zhuǎn)基因甘蔗的氯酚紅(CPR)檢測(cè)

氯酚紅染色培養(yǎng)4 d天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖8)表明：在含有甘露糖的液體培養(yǎng)基中，8個(gè)轉(zhuǎn)基因無(wú)性系葉片呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，呈現(xiàn)黃色，在不含有甘露糖的液體培養(yǎng)基中顏色未發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明8個(gè)轉(zhuǎn)基因無(wú)性系具有PMI活性，pmi基因不僅可以作為一種選擇標(biāo)記基因，而且還完全可以象Gus基因一樣，作為轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)告基因，因此pmi基因作為一種標(biāo)記基因，不僅安全，而且檢測(cè)方便，可以減少假陽(yáng)性植株。

圖8 轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片的氯酚紅(CPR)分析 CK1.未轉(zhuǎn)化的組培苗；CK2.空白對(duì)照；1～8.待檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株 第1排液體培養(yǎng)基中含有3 g·L-1甘露糖；第2排液體培養(yǎng)基中不含甘露糖Fig.8 Chlorophenol red asasy of transgenic sugarcane leaf CK1.Nontransformed tissue culture sugarcane；CK2.Blank control；1-8.Transformed sugarcane

圖9 第一代轉(zhuǎn)基因甘蔗EaDREB2B基因的PCR檢測(cè) M.DL2000 Marker(TakaRa)；1.質(zhì)粒DNA(陽(yáng)性對(duì)照)；2.空白對(duì)照；3.未轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照)；4～17.轉(zhuǎn)化甘蔗植株Fig.9 The PCR detection of EaDREB2B gene in first generation of transgenci sugarcane M.DL2000 Marker(TakaRa)；1.Plasmid DNA(Positive control)；2.Blank control；3.Nontransformed sugarcane(negative control)；4-17：Transformed sugarcane

圖10 第一代轉(zhuǎn)基因甘蔗EaDREB2B基因的RT-PCR檢測(cè) M.DL2000 Marker(TakaRa)；P.質(zhì)粒DNA；B.空白對(duì)照；CK.未轉(zhuǎn)化甘蔗；1～8.轉(zhuǎn)基因甘蔗Fig.10 RT-PCR detection of EaDREB2B gene in first generation of transgenic sugarcane M.DL2000 Marker(TakaRa)；P.Plasmid DNA；B.Blank control；CK.nontransformed sugarcane；1-8.Transgenic sugarcane

2.3.5轉(zhuǎn)基因甘蔗后代中EaDREB2B基因的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)轉(zhuǎn)基因T1代甘蔗植株遺傳檢測(cè)直接采用PCR擴(kuò)增外源EaDREB2B基因，電泳結(jié)果顯示(圖9)：在轉(zhuǎn)基因甘蔗中仍能檢測(cè)到EaDREB2B基因，而在非轉(zhuǎn)基因甘蔗中未檢測(cè)到目的條帶；同時(shí)，本研究取脅迫處理下T1代各無(wú)性系的葉片提取RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，電泳結(jié)果顯示(圖10)：8個(gè)樣品都擴(kuò)增出陽(yáng)性目的的條帶。以上結(jié)果表明EaDREB2B基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系T1代中穩(wěn)定遺傳。

3 討論

目前使用的抗性標(biāo)記基因大多數(shù)是抗生素或除草劑抗性基因。當(dāng)目的基因?qū)胫参锘蚪M后，標(biāo)記基因就完成了使命[17～18]。隨著轉(zhuǎn)基因植物的商品化，抗性標(biāo)記基因潛在的生態(tài)和食用安全性倍受關(guān)注。植物體內(nèi)的標(biāo)記基因持久表達(dá)不僅給植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，而且給其它有利性狀基因的表達(dá)帶來(lái)不確定的影響。對(duì)于環(huán)境釋放或商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物而言，人們擔(dān)心標(biāo)記基因的抗性遷移會(huì)給目前使用的抗生素和除草劑帶來(lái)挑戰(zhàn)。盡管目前沒(méi)有關(guān)于標(biāo)記基因遷移帶來(lái)危害的報(bào)道[19]，但抗性標(biāo)記基因潛在的生態(tài)環(huán)境和食用安全性一直頗具爭(zhēng)議，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的這些擔(dān)心依舊是制約轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展的一個(gè)因素。

就轉(zhuǎn)基因安全而言，大力發(fā)展正向篩選系統(tǒng)，使用對(duì)生物安全的非抗性標(biāo)記基因是最為有效的辦法[20]。目前，磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)作為有效的正向選擇體系的安全標(biāo)記基因，已經(jīng)在果樹(shù)、水稻、棉花及番茄的遺傳轉(zhuǎn)化篩選中得到了應(yīng)用。Reed等[10]對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和甜菜中pmi基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了全面的分析，認(rèn)為甘露糖篩選體系對(duì)人體健康和環(huán)境十分安全，世界上30多個(gè)獨(dú)立科學(xué)委員會(huì)已認(rèn)可pmi基因的安全性[21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)甘露糖對(duì)甘蔗愈傷組織分化及無(wú)菌苗生根的影響，建立了甘蔗以甘露糖為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體系。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，通過(guò)甘露糖篩選共獲51株抗性苗，經(jīng)分子檢測(cè)其中8株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，多為假陽(yáng)性植株，陽(yáng)性檢出率較低，不排除有其他因素，篩選壓也有待于進(jìn)一步優(yōu)化。此外，本實(shí)驗(yàn)pmi基因的表達(dá)情況能通過(guò)氯酚紅由紫紅色變?yōu)辄S色的顏色變化來(lái)定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)分子雜交相比，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)。因此，除作為標(biāo)記基因外，pmi基因還可在一定程度上行使報(bào)告基因的功能。

本研究成功構(gòu)建含pmi標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗后經(jīng)分子檢測(cè)結(jié)果表明，EaDREB2B基因已經(jīng)整合到甘蔗基因組中，并在轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系T1代中穩(wěn)定遺傳。本實(shí)驗(yàn)為更好的利用該標(biāo)記基因提高轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全性奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步研究EaDREB2B基因在提高甘蔗抗旱性方面奠定了基礎(chǔ)。

1.張木清,陳如凱.作物抗旱分子生理與遺傳改良[M].北京:科學(xué)出版社,2005.

Zhang M Q,Chen R K.Molecular physiological and genetic modified of Corp drought resistance[M].Beijing:Science Press,2005.

2.王自章,張樹(shù)珍,楊本鵬,等.甘蔗根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化海藻糖合酶基因獲得抗?jié)B透脅迫能力增強(qiáng)植株[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(2):140-146.

Wang Z Z,Zhang S Z,Yang B B,et al.Trehalose synthase gene transfer mediated byAgrobacteriumtumefaciensenhances resistance to osmotic stress in sugarcane[J].Scientia Agricultura Sinica,2003,36(2):140-146.

3.姚偉,余愛(ài)麗,徐景升,等.轉(zhuǎn)ScMV-CP基因甘蔗的分子生物學(xué)分析與鑒定[J].分子植物育種,2004,2(1):13-18.

Yao W,Yu A L,Xu J S,et al.Analysis and identification for transgenic sugarcane of ScMv-CP gene[J].Molecular Plant Breeding,2004,2(1):13-18.

4.Stockinger E J,Gilmour S J,Thomashow M F.ArabidopsisthalianaCBF1 encodes an AP2domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE,a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(3):1035-1040.

5.Rehman S,Mahmood T.Functional role of DREB and ERF transcription factors:regulating stress-responsive network in plants[J].Acta Physiologiae Plantarum,2015,37(9):178.

6.劉翠芳,鄒杰,陳信波.DREB轉(zhuǎn)錄因子與植物非生物脅迫抗性研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2010(10):26-30,48.

Liu C F,Zou J,Chen X B.Advances in DREB transcription factors and plant abiotic stress tolerance[J].Biotechnology Bulletin,2010(10):26-30,48.

7.李墨野,王娜,周宇,等.干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)LbDREB基因大青楊瞬時(shí)基因表達(dá)及生長(zhǎng)、生理指標(biāo)變異分析[J].植物研究,2016,36(3):409-415.

Li M Y,Wang N,Zhou Y,et al.Variation analysis of transient gene expression and growth,physiological indicators under drought stress in expressedLbDREBPopulusussuriensiskom[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(3):409-415.

8.Chen H L,Liu L P,Wang L X,et al.VrDREB2A,a DREB-binding transcription factor fromVignaradiata,increased drought and high-salt tolerance in transgenicArabidopsisthaliana[J].Journal of Plant Research,2016,129(2):263-273.

9.Mizoi J,Ohori T,Moriwaki T,et al.GmDREB2A; 2,a canonical dehydration-responsive element-binding protein2-type transcription factor in soybean,is posttranslationally regulated and mediates dehydration-responsive element-dependent gene expression[J].Plant Physiology,2013,161(1):346-361.

10.Reed J,Privalle M,Powell L,et al.Phosphomannose isomerase:an efficient selectable marker for plant transformation[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant,2001,37(2):127-132.

11.Lee B T,Matheson N K.Phosphomannoisomerase and Phosphoglucoisomerase in seeds ofCassiacoluteoidesand some other legumes that synthesize galactomannan[J].Phytochemistry,1984,23(5):983-987.

12.Joersbo M,Donaldson I,Kreiberg E,et al.Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet[J].Molecular Breeding,1998,4(2):111-117.

13.Hansen G,Wright M S.Recent advances in the transformation of plants[J].Trends in Plant Science,1999,4(6):226-231.

14.Min B W,Cho Y N,Song M J,et al.Successful genetic transformation of Chinese cabbage using phosphomannose isomerase as a selection marker[J].Plant Cell Reports,2007,26(3):337-344.

15.Wallbraun M,Sonntag K,Eisenhauer C,et al.Phosphomannose-isomerase(pmi) gene as a selectable marker forAgrobacterium-mediated transformation of rapeseed[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2009,99(3):345-356.

16.Jain M,Chengalrayan K,Abouzid A,et al.Prospecting the utility of a PMI/mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane(Saccharumspp.hybrid) plants[J].Plant Cell Reports,2007,26(5):581-590.

17.Hohn B,Levy A A,Puchta H.Elimination of selection markers from transgenic plants[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12(2):139-143.

18.Hare P D,Chua N H.Excision of selectable marker genes from transgenic plants[J].Nature Biotechnology,2002,20(6):575-580.

19.Puchta H.Marker-free transgenic plants[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2003,74(2):123-134.

20.Wright M,Dawson J,Dunder E,et al.Efficient biolistic transformation of maize(ZeamaysL.) and wheat(TriticumaestivumL.) using the phosphomannose isomerase gene,pmi,as the selectable marker[J].Plant Cell Reports,2001,20(5):429-436.

21.Haldrup A,Petersen S G,Okkels F T.Positive selection:a plant selection principle based on xylose isomerase,an enzyme used in the food industry[J].Plant Cell Reports,1998,18(1-2):76-81.

The science and technology support project of Jiangxi Province(20122BBF60135);The science foundation of Jiangxi Provincial education department(GJJ13543)

introduction：WU Yang(1980—),male,doctor,associate professor,major in plant stress physiology and molecular biology.

date:2016-11-14

TransformationofEaDREB2BGeneintoSugarcaneUsingpmiGeneasSelectableMarker

WU Yang1,2HE Li1HUANG Yong1ZHANG Mu-Qing2

(1.School of Life Sceinces,Jinggangshan University,Ji’an 343009；2.Ministry of Agriculture Key Lab of Eco-physiology and Genetic Improvement for Sugarcane,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

The plant expression vector of pDREB-PMI was constructed successfully with expression vector of prd29a-dreb-hyg and pZMLR14 by restriction-ligase reaction. Sugarcane callus were transformed with pDREB-PMI expression vector by bombardment. After mannose selection, 51 regenerated plants were obtained with the transformation rate of 4.25%. All of these 51 seedlings were detected with molecular detection, and the 8 seedlings were positive transgenic sugarcane. Chlorophenol red assay of transgenic sugarcane leaf showed that thepmigene was expressed in transgenic plants. T1-generation transgenic sugarcane were detected by PCR and RT-PCR, and the exogenous geneEaDREB2Bwas stably inherited. The results laid the foundation of further research on the effect ofEaDREB2Bgene in improving sugarcane resistance to drought stress.

sugarcane;pmigene;mannose

江西省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20122BBF60135)；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ13543)

吳楊(1980—)，男，博士，副教授，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:wuyangfenghao@163.com

2016-11-14

* Corresponding author：E-mail:wuyangfenghao@163.com

S566.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.007