肖力彬+劉柳+汪聰+蔡亞君

摘 要：本研究分析腐敗希瓦氏菌4H菌株通過海藻酸鈉進行固定化以后對偶氮染料活性艷紅X-3B的處理效果。首先以該菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌體為對象，確定了在CaCl2濃度為1.5%、海藻酸鈉濃度為2.5%、微球粒徑0.6mm時包埋得到的微球性能最佳。用包埋了腐敗希瓦氏菌4H菌體的微球分別在不同的pH、溫度、染料濃度等條件下處理活性艷紅X-3B，在pH為5和9時，微球?qū)?0mg/L活性艷紅X-3B35℃靜置處理8h時的脫色率分別為70.8%和67.7%，而菌懸液只有34.2%和47.6%；在溫度分別為20℃和50℃時，對50mg/L活性艷紅X-3B靜置處理12h時的脫色率分別為73.1%和62.7%，而菌懸液只有57.6%和27.3%；在染料濃度高達1600mg/L和3200mg/L時，微球?qū)H7的活性艷紅X-3B在35℃靜置處理48h時的脫色率分別為95.3%和94.1%，菌懸液為92.3%和91.3%。結(jié)果顯示，腐敗希瓦氏菌4H菌經(jīng)海藻酸鈉包埋固定化后形成的微球?qū)Σ焕h(huán)境的耐受性更強，且多次重復(fù)利用仍具較好的脫色效果，具有更好的實際應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：腐敗希瓦氏菌；固定化；海藻酸鈉；活性艷紅X-3B；脫色

廢水生物處理是主要利用微生物的分解作用去除水中污染物的方法，成本低且無二次污染，是現(xiàn)代廢水處理中應(yīng)用最廣泛的方法之一，但印染廢水由于其有機物含量高、可生化性差、色度深、水質(zhì)變化大，對常規(guī)的活性污泥或生物膜等生物處理系統(tǒng)中的微生物（無論是天然微生物還是投加的功能菌）生長代謝影響大，導(dǎo)致生物處理系統(tǒng)消耗快、效率低。針對這一問題，本研究以一株染料脫色菌株為對象，比較將菌體通過海藻酸鈉固定化技術(shù)包埋在微球里后處理染料廢水時對環(huán)境條件的耐受度和脫色效果，從而分析利用包埋固定化技術(shù)提高印染廢水生物處理系統(tǒng)效率的可行性。

一、材料和方法

1.菌株來源 菌株Shewanella putrefaciens 4H為本實驗室分離篩選。

2.菌株的活化及生長曲線的測定 將保藏菌種接種到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃活化培養(yǎng)，觀察脫色時間，如脫色時間過長則重復(fù)此步驟，直至脫色時間穩(wěn)定之后，將菌液按1：100比例轉(zhuǎn)接至50ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)，定時取樣檢測培養(yǎng)物的OD600和OD525，根據(jù)OD600繪制生長曲線，確定生長曲線中對數(shù)生長期的時間段。同時根據(jù) OD525 計算不同時間的脫色率，確定脫色完全所需時間。

3.海藻酸鈉包埋固定化條件研究 以對數(shù)生長期菌體（無菌水洗滌三次）為對象，將菌體用無菌水懸浮至OD600值為1～2的菌懸液，然后取該菌懸液0.5mL與4.5mL的海藻酸鈉溶液充分混和，在無菌的100mL小燒杯中倒入60mL氯化鈣溶液，用注射器將菌懸液和海藻酸鈉的混合物滴入氯化鈣溶液之中，即可形成固定化微球。此后將燒杯置于4℃的冰箱中，18h之后取出，去除氯化鈣溶液，并用生理鹽水洗滌固定化微球3次，再置于4℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩１容^不同的海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、注射器口徑對制得微球性能的影響，確定最佳的固定化條件。

4.固定化微球?qū)钚云G紅X-3B的脫色研究 將固定化微球在不同溫度、pH、染料濃度的條件下處理活性艷紅X-3B，以等量菌懸液在相同條件下的處理為對照，分析固定化對菌株生長及脫色性能的影響。并對固定化微球的重復(fù)利用效果進行了分析。

二、 結(jié)果與分析

1.菌株S. putrefaciens 4H生長曲線的測定

將S. putrefaciens 4H菌株過夜活化培養(yǎng)后按1：100轉(zhuǎn)接至50ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃、200rpm培養(yǎng)，每2h檢測培養(yǎng)液的OD600值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)繪得該菌在該培養(yǎng)條件下的生長曲線。

2.菌株S. putrefaciens 4H海藻酸鈉固定化研究

將S. putrefaciens 4H菌株過夜活化培養(yǎng)后按1：100轉(zhuǎn)接至50 mL含50 mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃、200rpm培養(yǎng)，8h時將培養(yǎng)液離心取菌體，將菌體用無菌水洗滌三次后用無菌水懸浮至OD600值為1.2。將菌懸液按每份0.5ml等量分裝，在不同海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、注射器口徑的條件下制備固定化微球。

（1） 氯化鈣濃度對固定化微球性能的影響。首先，比較了海藻酸鈉溶液濃度為3.0%、注射器口徑為0.6mm時，氯化鈣溶液濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時制備微球的性能。肉眼觀察到微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后測上清的OD525，計算脫色率。結(jié)果顯示，不同氯化鈣濃度時制備得到的微球最終都能脫色完全，但氯化鈣濃度為1.5%時在整個處理過程中的表現(xiàn)最好。脫色完全之后觀察到的固定化微球的形態(tài)仍然良好，對微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測也顯示無游離菌體的存在。

（2）海藻酸鈉濃度對固定化微球性能的影響。在氯化鈣溶液濃度為1.5%、注射器口徑為0.6mm時，比較海藻酸鈉濃度分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%時制備得到的微球的性能。肉眼觀察到微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后測上清的OD525，計算脫色率。結(jié)果顯示，海藻酸鈉濃度為2.5%時制備得到的微球的脫色效果最好。脫色完全之后觀察到的固定化微球的形態(tài)仍然良好，對微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測也顯示無游離菌體的存在。

（3） 微球直徑對固定化微球性能的影響。在氯化鈣溶液濃度為1.5%、海藻酸鈉濃度為2.5%時，比較注射器口徑分別為0.45mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm時制備得到的微球的性能。肉眼觀察到由口徑為0.5mm、0.6mm、0.7mm的注射器制備得到的微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后測上清的OD525，計算脫色率。結(jié)果顯示，由口徑為0.6mm的注射器制備得到的固定化微球的脫色效果最好。直徑為0.5mm、0.6mm、0.7mm的固定化微球脫色完全之后觀察到的形態(tài)仍然良好，對微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測也顯示無游離菌體的存在；而直徑為0.45mm的微球有部分破碎現(xiàn)象，取樣測定OD600值，也檢測到有部分游離菌的存在。endprint

3.菌株S. putrefaciens 4H固定化微球?qū)钚云G紅X-3B的脫色效果

將固定化微球和等菌量的菌懸液分別轉(zhuǎn)接入不同pH 、含不同濃度活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中，于不同溫度靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后取上清檢測OD525，計算脫色率。

（1）固定化微球?qū)H的耐受性研究。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH分別為5、6、7、8、9的含50mg/L活性艷紅X-3B染料的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測結(jié)果顯示，在pH為6、7、8時，菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球，6h脫色率分別為90%左右和70%-80%；而pH為5時，菌懸液濃度不增加，8h脫色率最高僅34.2%，微球8h脫色率為 70.8%；pH為9時，菌懸液濃度增加少，8h脫色率為47.6%，微球為67.7%。

（2）固定化微球?qū)囟鹊哪褪苄匝芯?。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH 7的含50mg/L活性艷紅X-3B染料的LB液體培養(yǎng)基中，分別于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測結(jié)果顯示，在溫度為30、35、40℃時，菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球，6h脫色率分別為90%左右和70%左右；而溫度為20℃時，菌懸液濃度增加少，菌懸液12h脫色率最高僅57.6.2%，微球12h脫色率為 73.1%；溫度為50℃時，菌懸液濃度不增加，12h脫色率為27.3%，微球為62.7%。

（3）固定化微球?qū)θ玖蠞舛鹊哪褪苄匝芯俊⒐潭ɑ⑶蚝途鷳乙悍謩e接入5ml pH 7的活性艷紅X-3B濃度分別為50mg/L、100 mg /L、200 mg /L、400 mg /L、800 mg /L、1600 mg /L、3200mg/L的LB培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測結(jié)果顯示，在染料濃度≤800 mg /L時，菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球，如對濃度≤200 mg /L的染料，微球處理6h脫色率均80%左右，菌懸液均90%左右；對400 mg /L的染料，微球處理6h脫色率為60%左右，菌懸液80%左右；對800 mg /L的染料，微球處理6h脫色率為50%左右，菌懸液60%左右。當(dāng)染料濃度為1600 mg/L時，菌懸液對染料的脫色率最初優(yōu)于微球，但是在12h之后微球的脫色效果優(yōu)于菌懸液，48h時微球脫色率為95.3%，菌懸液為92.3%。當(dāng)染料濃度為3200 mg/L時，微球的脫色效果優(yōu)于菌懸液，48h時微球脫色率為94.1%，菌懸液為91.3%。

（4）固定化微球的重復(fù)利用性研究。將微球轉(zhuǎn)接入5ml pH7的含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中，測定起始OD525值及處理6h后OD525值，計算6h脫色率。然后將固定化微球取出后用生理鹽水洗滌三次，再轉(zhuǎn)入新的含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中，檢測6h脫色率。重復(fù)上述步驟，直到固定化微球破損較為嚴(yán)重。

在第6次重復(fù)使用時，其6h脫色率僅比第1次的下降5%左右，脫色性能保持較好，但總體來說隨使用次數(shù)的增加而呈下降趨勢。在前3次重復(fù)使用時固定化微球形態(tài)良好，沒有出現(xiàn)破損，但從第4次開始微球開始出現(xiàn)破損，第6次后固定化微球發(fā)生崩解。

三、討論

本研究結(jié)果顯示，菌株S. putrefaciens 4H通過海藻酸鈉包埋固定化后得到的微球?qū)Σ焕h(huán)境的耐受性增強，且可重復(fù)利用，表明該菌通過包埋固定化后在對溫度、pH、染料濃度等水質(zhì)參數(shù)變化大的印染廢水的生物處理中具有了更好的應(yīng)用前景。而包埋形成的微球之所以能夠在不利環(huán)境中發(fā)揮降解作用，主要是由于固定化載體起到了一個保護屏障的作用，使細胞不直接與外界環(huán)境相接觸，從而可以抵御土著微生物的惡性競爭、防止或減緩噬菌體、毒性物質(zhì)及高滲透壓物質(zhì)的吞噬和毒害等；其次，固定化載體內(nèi)部有較高的孔隙度，可以容納細胞的增殖，同時細胞分泌的胞外酶可經(jīng)過孔隙釋放到外界降解污染物，或細胞本身可將從孔隙進入的低濃度的污染物直接降解而不受到高濃度污染物的毒害。

本研究所用菌株屬于希瓦氏菌屬，該屬菌株呼吸類型多樣，能利用有機物產(chǎn)生能量，能還原金屬鹽[5-10]、硝酸鹽和腐殖酸等有機污染物[7，10]，也能將染料脫色，此外，還發(fā)現(xiàn)多個希瓦氏菌株能產(chǎn)電。目前，希瓦氏菌在醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、電化學(xué)、海洋生物學(xué)等多個領(lǐng)域均得到應(yīng)用，具有很高的研究價值。而本文對希瓦氏菌固定化的研究，也有助于該屬細菌在各個領(lǐng)域的更好應(yīng)用。

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