王彩云 ， 潘 登 ， 范奎奎 ， 張召議 ， 李 婷 ， 李 強(qiáng) ， 杜晨光,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 包頭 014109)

SHU9119對(duì)小鼠發(fā)情周期中Ghrelin表達(dá)的影響

王彩云1， 潘 登1， 范奎奎1， 張召議1， 李 婷1， 李 強(qiáng)1， 杜晨光1,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 包頭 014109)

為了研究SHU9119與ghrelin之間的潛在的生理學(xué)關(guān)系，本試驗(yàn)選擇4周齡的C57BL/6小鼠下丘腦和卵巢組織為研究材料，對(duì)小鼠發(fā)情周期中SHU9119介導(dǎo)的ghrelin mRNA在下丘腦和卵巢部位表達(dá)水平進(jìn)行研究。結(jié)果表明，正常生理?xiàng)l件下小鼠間情期下丘腦保持較高水平的ghrelin mRNA表達(dá)，而在卵巢內(nèi)其表達(dá)水平相對(duì)較低；腹腔注射SHU9119 (50 μg/kg體重)可極顯著抑制下丘腦中g(shù)hrelin mRNA的表達(dá)(P<0.01)，同時(shí)顯著促進(jìn)小鼠間情期卵巢Ghrelin mRNA的表達(dá)(P<0.05)。然而，SHU9119并未引起小鼠發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期ghrelin mRNA表達(dá)量的顯著差異。上述結(jié)果表明，SHU9119可能通過MC4R系統(tǒng)調(diào)節(jié)間情期小鼠ghrelin的變化，而不參與其他性周期ghrelin mRNA表達(dá)量的相關(guān)調(diào)控。

小鼠 ； 下丘腦 ； 卵巢 ； Ghrelin ； SHU9119

作為胃腸道產(chǎn)生的28氨基酸多肽類激素[1]，Ghrelin為生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體，其在促進(jìn)生長(zhǎng)激素(GH)分泌的同時(shí)，也可直接調(diào)控能量代謝和能量平衡，如促進(jìn)脂類沉積，體重增加[2]。SHU9119作為一種人工合成的黑素皮質(zhì)素4型受體(Melanocortin-4 receptor, MC4R)，在研究MC4R和能量代謝方面被廣泛使用[3]。

研究結(jié)果表明，MC4R基因缺失小鼠表現(xiàn)出食欲旺盛、體重增加和肥胖等癥狀[4]，而且肥胖后生殖能力的嚴(yán)重下降也引起了人們廣泛的關(guān)注[5]，例如，除Ghrelin能量平衡效應(yīng)外，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明其可直接影響卵巢生理活動(dòng)[6]。Ghrelin在生長(zhǎng)、能量代謝和生殖之間存在著復(fù)雜的生物學(xué)功能，且其功能性受體GHS-R1a廣泛分布于下丘腦-垂體-性腺軸[7]，提示ghrelin可能是通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生殖調(diào)控的關(guān)鍵因子。然后研究表明,ghrelin不能刺激MC4R基因敲除小鼠的采食量增加，提示ghrelin的作用部分是通過下丘腦黑皮質(zhì)素受體系統(tǒng)作用[8]。同時(shí)ghrelin可刺激正常小鼠采食行為并促進(jìn)下丘腦黑皮質(zhì)素受體的表達(dá)。

SHU9119作為MC4R特異的受體擷抗劑，可干擾MC4R的采食調(diào)控作用[9]?；趃hrelin受體-GSHR與MC4R均為7次跨膜藕聯(lián)蛋白[10]，均與能量代謝息息相關(guān)，生殖與能量代謝之間具有緊密關(guān)系。因此，本試驗(yàn)通過對(duì)不同性周期的雌性小鼠腹腔注射SHU9119，以下丘腦和卵巢為試驗(yàn)材料，通過RT-qPCR技術(shù)探究SHU9119對(duì)下丘腦和卵巢中g(shù)hrelin mRNA水平表達(dá)的影響，為研究SHU9119參與雌性小鼠能量代謝和生殖提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料獲取 雌性C57BL/6 (4周齡)小鼠(n=30)，購(gòu)自北京維通利華公司。試驗(yàn)前一周每天定時(shí)進(jìn)行腹腔注射生理鹽水，避免試驗(yàn)時(shí)應(yīng)激。使用陰道涂片法將其分為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期4組，選擇體重和健康狀況相同的雌鼠共24只，每組各6只。 其中，3只用于生理鹽水注射，3只用于SHU9119(50 μg/kg體重)的腹腔注射。注射后1 h，脊椎脫臼法處死以獲取下丘腦和卵巢材料，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小鼠性周期鑒定 選取體重健康狀態(tài)相近的小鼠(n=24)，使用50 μL室溫的生理鹽水對(duì)小鼠的陰道上皮細(xì)胞進(jìn)行沖洗，之后將小鼠的陰道上皮細(xì)胞滴加在防脫載玻片上，待液體自然風(fēng)干后，滴加95%的乙醇進(jìn)行固定10 min，之后使用蒸餾水進(jìn)行沖洗。自然風(fēng)干后向其中滴加1%龍膽紫溶液，作用10 min，沖洗干凈后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察(奧林巴斯XSP-2C)。

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 采用天根生化科技(北京)有限公司RNA提取試劑盒，按說明書提取RNA。反轉(zhuǎn)錄直接將6.5 μL的RNA加入到反轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA。反應(yīng)體系為10 μL，其中5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL(TaKaRa DRR036)。于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，4 ℃。cDNA保存于-20 ℃，并避免反復(fù)凍融。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR) 基因序列及引物信息如下：Ghrelin (163 bp, GenBank accession no. NM_021488.4)上游5′-CAAGAAGCCACCAGCTAA ACT-3′，下游5′-GCCATGCTGCTGATACTGA-3′ ；GAPDH (294 bp, GenBank accession no. XM_004438729.1) 上游5′-AAGGGTGGAGCCAAAAGG-3′ ；下游5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT -3′，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中熒光酶10 μL、上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)、cDNA 2 μL、dH2O 7.2 μL。擴(kuò)增條件為：94.0 ℃預(yù)變性1 min；94.0 ℃變性20 s，64.0 ℃ghrelin/58 ℃GAPDH退火20 s，72.0 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)Ghrelin mRNA表達(dá)量采用2-ΔCT公式進(jìn)行計(jì)算，ΔCT = CTGhrelin-CTGAPDH。

1.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0的統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行T test統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± S.E.M)進(jìn)行表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠陰道涂片上皮細(xì)胞變化特點(diǎn) 試驗(yàn)觀察基本總結(jié)見表1和圖1。

表1 小鼠陰道涂片上皮細(xì)胞變化特點(diǎn)

圖1 不同發(fā)情時(shí)期陰道上皮細(xì)胞變化 (100×)A：發(fā)情前期； B：發(fā)情期； C：發(fā)情后期； D：間情期

2.2 PCR產(chǎn)物特異性 擴(kuò)增效率曲線表明擴(kuò)增效果良好，經(jīng)熔解曲線分析可知ghrelin和GAPDH基因熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在85 ℃和86.5 ℃的熔解溫度處出現(xiàn)單一峰。且凝膠電泳結(jié)果顯示，ghrelin和GAPDH PCR產(chǎn)物分別得到了單一的163 bp和294 bp條帶，故產(chǎn)物大小及預(yù)期TM值與設(shè)計(jì)一致(圖2)。

2.3 小鼠發(fā)情周期內(nèi)下丘腦和卵巢ghrelin mRNA表達(dá)量 從圖3可知，正常生理情況下，下丘腦ghrelin mRNA呈逐漸升高趨勢(shì)，以間情期最高，發(fā)情后期次之。腹腔注射SHU9119后下丘腦中g(shù)hrelin mRNA水平表達(dá)量較對(duì)照組在發(fā)情后期略有下降，但在間情期呈顯著的下降趨勢(shì)(P<0.01)，而發(fā)情前期和發(fā)情期較生理鹽水組均未見顯著性差異。

圖2 Ghrelin的熒光定量PCR電泳結(jié)果(左)和GAPDH的熒光定量PCR電泳結(jié)果(右)注：E-Estrus; P-proestrus; M-metaestrus; D-diestrous; Hy-Hypothalamus; O-Ovary

卵巢正常生理?xiàng)l件下，Ghrelin mRNA呈先低后高，至間情期最低的趨勢(shì)，發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期未見顯著性差異。因試驗(yàn)重復(fù)差異相對(duì)較大，未體現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)差異，但與小鼠，大鼠，綿羊，豬等哺乳動(dòng)物卵巢Ghrelin表達(dá)趨勢(shì)一致。然而，SHU9119處理組較對(duì)照組在間情期可顯著促進(jìn)卵巢中Ghrelin mRNA水平表達(dá)(P<0.01)。

ghrelin mRNA在間情期正常小鼠卵巢中的表達(dá)水平與下丘腦相反，其保持較低的表達(dá)水平。SHU9119處理后，ghrelin mRNA在下丘腦和卵巢均出現(xiàn)了極顯著的逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。其中，SHU9119處理后的下丘腦中Ghrelin mRNA表達(dá)水平與正常生理?xiàng)l件下間情期卵巢的表達(dá)量接近，均處于較低的水平；SHU9119處理后的卵巢中Ghrelin mRNA表達(dá)水平與正常生理?xiàng)l件下間情期小鼠下丘腦的表達(dá)量接近，均處于較高水平。

圖3 SHU9119對(duì)小鼠發(fā)情周期內(nèi)下丘腦和卵巢Ghrelin mRNA表達(dá)的影響

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是下丘腦，包含主要ghrelin效應(yīng)位點(diǎn)，其中弓狀核區(qū)域是重要的中樞整合核團(tuán)[11]。在該區(qū)域，ghrelin通過傳出神經(jīng)纖維投射到神經(jīng)肽Y/刺鼠相關(guān)肽(NPY/AgRP)神經(jīng)元，促進(jìn)與食欲相關(guān)的肽類物質(zhì)釋放[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SHU9119作為能量代謝關(guān)鍵調(diào)控基因MC4R的擷抗劑，可對(duì)小鼠間情期下丘腦和卵巢ghrelin mRNA進(jìn)行逆向調(diào)控，而在發(fā)情前情和發(fā)情期未見負(fù)反饋調(diào)節(jié)。有報(bào)道表明，ghrelin促進(jìn)體重增加的作用依雌二醇水平而動(dòng)。ghrelin僅在大鼠間情期雌二醇水平較低時(shí)才可促進(jìn)采食，在雄性大鼠中，外源雌二醇的注射可抑制Ghrelin所產(chǎn)生促進(jìn)采食效應(yīng)[13]。但，SHU9119在發(fā)情前情和發(fā)情期未見作用的結(jié)果是否與雌二醇水平有關(guān)尚需驗(yàn)證。

試驗(yàn)結(jié)果可知，正常生理?xiàng)l件下ghrelin在卵巢中表達(dá)未見顯著差異(圖3)，但可hrelin mRNA表達(dá)水平在發(fā)情前期較低，發(fā)情期和發(fā)情后期升高，間情期降低的正態(tài)分布趨勢(shì)，這種趨勢(shì)與人、豬和綿羊等哺乳動(dòng)物相類似[7, 14-15]。

小鼠下丘腦中，ghrelin mRNA表達(dá)卻呈現(xiàn)逐漸升高(從發(fā)情前期到間情期)的過程。SHU9119作為一種能量調(diào)控抑制劑，在下丘腦-卵巢的性腺軸間存在著協(xié)調(diào)一致表達(dá)模式，支持雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)與能量平衡存在著緊密關(guān)系[16]。

是否可以這樣理解，下丘腦中g(shù)hrelin mRNA在間情期維持較高水平即可為啟動(dòng)下一個(gè)發(fā)情期周期進(jìn)行物質(zhì)準(zhǔn)備。正常生理?xiàng)l件下，ghrelin mRNA卵巢中表達(dá)量低較，下丘腦中較高，正是性腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)在控制的結(jié)果。另外，SHU9119作為能量代謝關(guān)鍵基因MC4R的擷抗劑致使間情期ghrelin mRNA表達(dá)水平在下丘腦和卵巢間出現(xiàn)相反的表達(dá)結(jié)果，推測(cè)表達(dá)能量代謝的相關(guān)基因在卵巢周期性變化過程中具有積極作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，能量代謝相關(guān)基因MC4R受體抑制劑SHU9119可做為研究能量代謝與生殖間作用機(jī)理的潛在調(diào)控藥物，同時(shí)SHU9119在雌性小鼠生殖方面可以起到類似正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。生殖系統(tǒng)中激素對(duì)于能量代謝平衡影響積極，且生殖是一個(gè)復(fù)雜且一直圍繞生物體能量代謝的生命活動(dòng)過程，故從下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)去理解ghrelin的功能，是一種研究ghrelin在動(dòng)物體生殖和能量調(diào)控方面具有的潛在作用調(diào)控方向。

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EffectofSHU9119onExpressionoftheGhrelininMiceduringtheEstrousCycle

WANG Cai-yun1, PAN Deng1, FAN Kui-kui1, ZHANG Zhao-yi1, LI Ting1, LI Qiang1, DU Chen-guang1,2

(1.College of Veterinary, Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018 , China; 2.Vocational and Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109 , China)

To confirm the biological role of ghrelin and SHU9119, 4 week old mice were used in our study to check the effects of SHU9119 on ghrelin mRNA expression using the hypothalamus and ovary at different estrous cycle. The results showed that under the normal physiological conditions, mice diestrus hypothalamus maintained higher level of ghrelin mRNA, while in the ovary remain the level was relatively low. SHU9119(50 μg / kg) significantly inhibited the hypothalamic ghrelin mRNA expression (P<0.01), but stimulated ovarian ghrelin mRNA expression in mouse diestrus(P<0.05). Meanwhile, there are no significant differences in mouse proestrus, estrus and metestrus. These results suggest that SHU9119 is as a regulator in mouse diestrus, and the effects of ghrelin are partly mediated by the hypothalamic melanocortinergic system.

Mouse ; Hypothalamus ; Ovary ; Ghrelin ; SHU9119

DU Chen-guang

S856.1+3

A

0529-6005(2017)09-0103-04

2017-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31660701，31160455)；內(nèi)蒙古高校自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(NJZZ049)

王彩云(1969-)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榧倚蠼馄蕦W(xué)E-mail:wangcaiyun688@163.com

杜晨光，E-mail:dcglxj@163.com