王 通 ， 崔曉旭 ， 李春艷 ， 張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

高脂誘導(dǎo)對(duì)小鼠血清中脂肪酸含量的影響

王 通 ， 崔曉旭 ， 李春艷 ， 張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

本試驗(yàn)采用氣相色譜方法檢測(cè)小鼠血清中脂肪酸的含量，研究高脂誘導(dǎo)對(duì)小鼠血清中脂肪酸含量的影響。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為野生型對(duì)照組(WT-ND)和野生型高脂組(WT-HFD)，每組10只，采用高脂飼料連續(xù)飼喂6周后眼球采血收集血液，分離血清，皂化衍生后采用氣相色譜檢測(cè)脂肪酸含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，飼喂高脂后小鼠血清中C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2和C20∶3的含量呈上升趨勢(shì)，而C17∶0、C20∶4和C22∶6呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，高脂誘導(dǎo)能使血清中脂肪酸含量發(fā)生明顯變化，會(huì)加重脂肪酸代謝類(lèi)疾病發(fā)展過(guò)程。

脂肪酸 ； 氣相色譜 ； 野生型ICR小鼠 ； 高脂飼料

脂肪酸是天然油脂與水發(fā)生分解反應(yīng)生成的脂肪族羧酸化合物，是脂類(lèi)的重要組成部分。目前發(fā)現(xiàn)的天然脂肪酸有200多種，廣泛存在于動(dòng)植物油脂中[1]。根據(jù)碳原子雙鍵的數(shù)目(飽和度)，可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)；根據(jù)甲基端第一個(gè)雙鍵所連接碳原子的編號(hào)可分為n-3 族、n-6 族、n-7 族、n-9 族[2]。

其中n-3族系列主要包含α-亞麻酸(C18∶3)、C20∶5(EPA)、C22∶5(DPA)和C22∶6(DHA)[3]。n-6族系列主要包含亞油酸(C18∶2)、γ-亞麻酸(C18∶3)和花生四烯酸(C20∶4，ARA)。兩個(gè)系列都具有改善脂質(zhì)代謝、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗癌等作用，但是n-3族系列效果顯著[1]。大量文獻(xiàn)研究指出，n-6族和n-3族系列脂肪酸的比值會(huì)對(duì)脂代謝及免疫功能產(chǎn)生不同影響，因此確定合適的n-6族和n-3族比例是研究動(dòng)物免疫功能的關(guān)鍵[4]。

脂肪酸去飽和酶存在于大多數(shù)生物中，在PUFA生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到重要作用。主要有Δ9、Δ6和Δ5 3種，分別在長(zhǎng)鏈脂肪酸的特定位置去飽和變成雙鍵[5]。目前直接測(cè)量去飽和酶的活性比較困難，但是去飽和酶在不同脂肪酸系列的代謝途徑催化不同的去飽和反應(yīng)，利用脂肪酸生成物與前體的比值評(píng)估去飽和酶的活性，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明該方法的準(zhǔn)確性[6]。

Δ9-16去飽和酶=[16∶1(n-7)/16∶0] Δ9-18去飽和酶= [18∶1(n-9)/18:0] Δ6去飽和酶=[18∶3(n-6)/18∶2(n-6)] Δ5去飽和酶=[20∶4(n-6)/20∶3(n-6)] 脂肪生成指數(shù)=[18∶2(n-6)/16∶0]

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 8周齡野生型ICR雄性小鼠，體重18～20 g，SPF級(jí)，20只，購(gòu)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：008702。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食。

1.1.2 試驗(yàn)藥品與試劑 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和13%BF3-甲醇溶液由美國(guó)Sigma公司提供；色譜級(jí)正己烷由天津市化學(xué)試劑六廠(chǎng)分廠(chǎng)提供。

1.1.3 主要儀器 氣相色譜儀(日本島津公司)；N2吹干儀(美國(guó)OA-SYS公司)；梅特勒萬(wàn)分之一天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.1.4 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0、C22∶0、C23∶0、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶6脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品各3 mg直接皂化衍生，所得脂肪酸甲酯用氮?dú)獯蹈刹⒚芊猓?20 ℃冰箱中備用，臨用前用正己烷溶解。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高脂飼料制作 按照普通飼料68.5%、豬油15%、膽固醇1%、膽鹽0.5%和糊精15%的比例稱(chēng)取各種成分后，采用等量倍增的方法，將膽固醇與膽鹽和普通飼料粉末混合均勻，加入經(jīng)檢驗(yàn)合格的豬體脂肪熬制好的豬油，待混合均勻后，加入糊精和一定比例的水固形，用制粒機(jī)壓制成粒，烘干備用。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 試驗(yàn)購(gòu)進(jìn)小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)進(jìn)行分組，對(duì)照組小鼠飼喂普通飼料(Normal Diet, ND)，高脂組小鼠飼喂高脂飼料(high fat diet, HFD)；連續(xù)飼喂6周取材，自由采食，分別表示為WT-ND，WT-HFD。分組情況及處理如上表1。

表1 動(dòng)物分組與處理

1.2.3 血清樣本的采集與處理 試驗(yàn)開(kāi)始后，在6周(w)末隔夜禁食，次日以眼球采血，全血37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min后，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃凍存。

皂化衍生方法：精密稱(chēng)取100 μL凍存血清樣本，加入0.5 mol/LKOH-甲醇溶液1 mL，充氮?dú)饷芊猓?0 °C水浴10 min，加13%BF3-甲醇1.5 mL，60 ℃水浴30 min，取出置冷，加正己烷1.5 mL，渦流30 s提取。加飽和氯化鈉2 mL，3 000 r/min離心10 min。取上層液，氮?dú)獯蹈桑?20 ℃冰箱中備用。臨用前加1 mL正己烷全溶，1 μL進(jìn)樣，氣相色譜分析。

1.2.4 色譜條件 毛細(xì)管色譜柱采用DB-23(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氮?dú)?99.999%)；進(jìn)樣l μL；分流比為1∶20；進(jìn)樣器溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度260 ℃；柱溫程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持2 min，升溫速率20 ℃/min，升到170 ℃保持1 min，2 ℃/min升至240 ℃保持10 min。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SD)表示，用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行有關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析，兩組間采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間試驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的考察 17種脂肪酸線(xiàn)性關(guān)系良好；小鼠血清中平均回收率在81.53%～100.72%；精密度在0.53%～9.85%；脂肪酸的檢測(cè)限在100～300 ng/mL；定量限在150～500 ng/mL。說(shuō)明本方法測(cè)定組織中脂肪酸準(zhǔn)確度好、重現(xiàn)性穩(wěn)定、靈敏度較高，可以用于實(shí)際檢測(cè)。

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間與色譜圖 混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品分離度(R>1.5)較好，出峰順序依次為C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶0、C23∶0、C22∶6，相應(yīng)的保留時(shí)間依次為9.650、11.408、12.513、13.794、15.233、16.860、17.291、18.129、19.268、20.527、21.085、22.079、22.517、22.821、24.238、26.117、28.423 min。

2.3 血清中脂肪酸的色譜圖 對(duì)照組小鼠血清中脂肪酸分離度較好，出峰順序依次為C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶0、C22∶6，相應(yīng)的保留時(shí)間依次為9.711、11.482、12.594、13.882、15.334、16.983、17.398、18.272、19.392、21.056、22.027、22.591、22.945、24.345、28.637 min。

高脂組小鼠血清中脂肪酸分離度較好，出峰順序依次為C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶0、C22∶6，相應(yīng)的保留時(shí)間依次為9.658、11.411、12.510、13.797、15.240、16.857、17.294、18.170、19.289、20.431、20.938、21.924、22.490、22.839、24.345、28.535 min，如圖3。

2.4 血清中各種脂肪酸含量的檢測(cè) 飼喂高脂后，血清中C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2和C20∶3的含量呈上升趨勢(shì)，而C17∶0、C20∶4和C22∶6呈下降趨勢(shì)。

表2 血清中飽和脂肪酸的含量

注:高脂組與對(duì)照組相比，A代表P<0.01，a代表P<0.05,下表同

表3 血清中不飽和脂肪酸的含量

3 討論

采用氣相色譜方法，我們共檢測(cè)了17種脂肪酸，在本檢測(cè)條件下能檢測(cè)到的有14種，分別是C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4和C22∶6，其中飽和脂肪酸有6種，不飽和脂肪酸有8種，而C20∶0、C22∶0和C23∶0的含量低于最低檢測(cè)限，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。與對(duì)照組相比，小鼠血清中C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3的含量在飼喂高脂飼料后都顯著增多，而C17∶0、C20∶4和C22∶6顯著減少。

高濃度的C16∶0和C18∶0可能是由于高脂飼料中含有15%的豬油，豬油含有豐富的SFA特別是C16∶0和C18∶0[7]。Barreyro等人發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中過(guò)多的SFA(C16∶0和C18∶0)積累可誘導(dǎo)Bim和FasL的表達(dá)，增加的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[8]。

有文獻(xiàn)報(bào)道脂質(zhì)中不飽和的脂肪酸越多，就會(huì)產(chǎn)生越多的活性氧，使細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體的通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡/壞死[9]。本試驗(yàn)中與對(duì)照組相比，高脂組MUFA C18∶1 和C20∶1的含量增加，又通過(guò)C18∶1與C18∶0比值，我們估算出Δ9去飽和酶的活性在飼喂高脂飼料后升高。同樣，較對(duì)照組比較，高脂組小鼠血清中PUFA也增多，如C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、和C20∶3。

有試驗(yàn)證明，較低的n-6族與n-3族 PUFA的比例是預(yù)防NAFLD[11]的有效指標(biāo)。本試驗(yàn)中二者比值升高，也是疾病進(jìn)行的表現(xiàn)。

綜上所述，高脂誘導(dǎo)能使血清中脂肪酸含量發(fā)生明顯變化，同時(shí)會(huì)加重脂肪酸代謝類(lèi)疾病發(fā)展過(guò)程。

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Effectsofhighfatonfattyacidcontentinserumofmice

WANG Tong , CUI Xiao-xu , LI Chun-yan , ZHANG Xiu-ying

(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

In this study, the content of fatty acids in serum was measured by gas chromatography, and the effects of high fat on serum fatty acid content were studied. The mice were randomly divided into two groups: wild-type control group (WT-ND) and wild-type high-fat group (WT-HFD). 10 rats in each group were fed with high-fat diet for six weeks. Blood was collected. The content of fatty acids was determined after saponification. The results showed that C12∶0, C14∶0, C15∶0, C16∶0, C18∶0, C18∶1, C18∶2, C18∶3,C20∶1，C20∶2 and C20∶3 were increased when compared with the control group, while C17∶0, C20∶4 and C22∶6 showed a decreasing trend. The results showed that high fat induction could change the content of fatty acids in serum and aggravate the development of fatty acid metabolic diseases.

fatty acid; gas chromatography; wild type ICR mice; high-lipid diet

ZHANG Xiu-ying

R458.5

A

0529-6005(2017)09-0100-03

2017-03-15

王通(1982-)，男，博士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail:1173136824@qq.com

張秀英，E-mail:zhangxiuying@neau.edu.cn