王 通 ， 崔曉旭 ， 李春艷 ， 張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

高脂誘導(dǎo)對小鼠血清中脂肪酸含量的影響

王 通 ， 崔曉旭 ， 李春艷 ， 張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

本試驗采用氣相色譜方法檢測小鼠血清中脂肪酸的含量，研究高脂誘導(dǎo)對小鼠血清中脂肪酸含量的影響。實驗小鼠隨機分為野生型對照組(WT-ND)和野生型高脂組(WT-HFD)，每組10只，采用高脂飼料連續(xù)飼喂6周后眼球采血收集血液，分離血清，皂化衍生后采用氣相色譜檢測脂肪酸含量。結(jié)果顯示，與對照組相比，飼喂高脂后小鼠血清中C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2和C20∶3的含量呈上升趨勢，而C17∶0、C20∶4和C22∶6呈下降趨勢。結(jié)果表明，高脂誘導(dǎo)能使血清中脂肪酸含量發(fā)生明顯變化，會加重脂肪酸代謝類疾病發(fā)展過程。

脂肪酸 ； 氣相色譜 ； 野生型ICR小鼠 ； 高脂飼料

脂肪酸是天然油脂與水發(fā)生分解反應(yīng)生成的脂肪族羧酸化合物，是脂類的重要組成部分。目前發(fā)現(xiàn)的天然脂肪酸有200多種，廣泛存在于動植物油脂中[1]。根據(jù)碳原子雙鍵的數(shù)目(飽和度)，可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)；根據(jù)甲基端第一個雙鍵所連接碳原子的編號可分為n-3 族、n-6 族、n-7 族、n-9 族[2]。

其中n-3族系列主要包含α-亞麻酸(C18∶3)、C20∶5(EPA)、C22∶5(DPA)和C22∶6(DHA)[3]。n-6族系列主要包含亞油酸(C18∶2)、γ-亞麻酸(C18∶3)和花生四烯酸(C20∶4，ARA)。兩個系列都具有改善脂質(zhì)代謝、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗癌等作用，但是n-3族系列效果顯著[1]。大量文獻研究指出，n-6族和n-3族系列脂肪酸的比值會對脂代謝及免疫功能產(chǎn)生不同影響，因此確定合適的n-6族和n-3族比例是研究動物免疫功能的關(guān)鍵[4]。

脂肪酸去飽和酶存在于大多數(shù)生物中，在PUFA生物轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用。主要有Δ9、Δ6和Δ5 3種，分別在長鏈脂肪酸的特定位置去飽和變成雙鍵[5]。目前直接測量去飽和酶的活性比較困難，但是去飽和酶在不同脂肪酸系列的代謝途徑催化不同的去飽和反應(yīng)，利用脂肪酸生成物與前體的比值評估去飽和酶的活性，大量實驗已經(jīng)證明該方法的準(zhǔn)確性[6]。

Δ9-16去飽和酶=[16∶1(n-7)/16∶0] Δ9-18去飽和酶= [18∶1(n-9)/18:0] Δ6去飽和酶=[18∶3(n-6)/18∶2(n-6)] Δ5去飽和酶=[20∶4(n-6)/20∶3(n-6)] 脂肪生成指數(shù)=[18∶2(n-6)/16∶0]

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 8周齡野生型ICR雄性小鼠，體重18～20 g，SPF級，20只，購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心，合格證號：008702。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水與進食。

1.1.2 試驗藥品與試劑 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和13%BF3-甲醇溶液由美國Sigma公司提供；色譜級正己烷由天津市化學(xué)試劑六廠分廠提供。

1.1.3 主要儀器 氣相色譜儀(日本島津公司)；N2吹干儀(美國OA-SYS公司)；梅特勒萬分之一天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.1.4 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 分別精密稱取C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0、C22∶0、C23∶0、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶6脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品各3 mg直接皂化衍生，所得脂肪酸甲酯用氮氣吹干并密封，-20 ℃冰箱中備用，臨用前用正己烷溶解。

1.2 試驗方法

1.2.1 高脂飼料制作 按照普通飼料68.5%、豬油15%、膽固醇1%、膽鹽0.5%和糊精15%的比例稱取各種成分后，采用等量倍增的方法，將膽固醇與膽鹽和普通飼料粉末混合均勻，加入經(jīng)檢驗合格的豬體脂肪熬制好的豬油，待混合均勻后，加入糊精和一定比例的水固形，用制粒機壓制成粒，烘干備用。

1.2.2 動物分組與處理 試驗購進小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機進行分組，對照組小鼠飼喂普通飼料(Normal Diet, ND)，高脂組小鼠飼喂高脂飼料(high fat diet, HFD)；連續(xù)飼喂6周取材，自由采食，分別表示為WT-ND，WT-HFD。分組情況及處理如上表1。

表1 動物分組與處理

1.2.3 血清樣本的采集與處理 試驗開始后，在6周(w)末隔夜禁食，次日以眼球采血，全血37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min后，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃凍存。

皂化衍生方法：精密稱取100 μL凍存血清樣本，加入0.5 mol/LKOH-甲醇溶液1 mL，充氮氣密封，60 °C水浴10 min，加13%BF3-甲醇1.5 mL，60 ℃水浴30 min，取出置冷，加正己烷1.5 mL，渦流30 s提取。加飽和氯化鈉2 mL，3 000 r/min離心10 min。取上層液，氮氣吹干，-20 ℃冰箱中備用。臨用前加1 mL正己烷全溶，1 μL進樣，氣相色譜分析。

1.2.4 色譜條件 毛細(xì)管色譜柱采用DB-23(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氮氣(99.999%)；進樣l μL；分流比為1∶20；進樣器溫度240 ℃；檢測器溫度260 ℃；柱溫程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持2 min，升溫速率20 ℃/min，升到170 ℃保持1 min，2 ℃/min升至240 ℃保持10 min。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SD)表示，用 SPSS17.0 軟件進行有關(guān)的統(tǒng)計分析，兩組間采用獨立樣本的t檢驗，多組間試驗數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的考察 17種脂肪酸線性關(guān)系良好；小鼠血清中平均回收率在81.53%～100.72%；精密度在0.53%～9.85%；脂肪酸的檢測限在100～300 ng/mL；定量限在150～500 ng/mL。說明本方法測定組織中脂肪酸準(zhǔn)確度好、重現(xiàn)性穩(wěn)定、靈敏度較高，可以用于實際檢測。

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品保留時間與色譜圖 混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品分離度(R>1.5)較好，出峰順序依次為C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶0、C23∶0、C22∶6，相應(yīng)的保留時間依次為9.650、11.408、12.513、13.794、15.233、16.860、17.291、18.129、19.268、20.527、21.085、22.079、22.517、22.821、24.238、26.117、28.423 min。

2.3 血清中脂肪酸的色譜圖 對照組小鼠血清中脂肪酸分離度較好，出峰順序依次為C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶0、C22∶6，相應(yīng)的保留時間依次為9.711、11.482、12.594、13.882、15.334、16.983、17.398、18.272、19.392、21.056、22.027、22.591、22.945、24.345、28.637 min。

高脂組小鼠血清中脂肪酸分離度較好，出峰順序依次為C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶0、C22∶6，相應(yīng)的保留時間依次為9.658、11.411、12.510、13.797、15.240、16.857、17.294、18.170、19.289、20.431、20.938、21.924、22.490、22.839、24.345、28.535 min，如圖3。

2.4 血清中各種脂肪酸含量的檢測 飼喂高脂后，血清中C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2和C20∶3的含量呈上升趨勢，而C17∶0、C20∶4和C22∶6呈下降趨勢。

表2 血清中飽和脂肪酸的含量

注:高脂組與對照組相比，A代表P<0.01，a代表P<0.05,下表同

表3 血清中不飽和脂肪酸的含量

3 討論

采用氣相色譜方法，我們共檢測了17種脂肪酸，在本檢測條件下能檢測到的有14種，分別是C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4和C22∶6，其中飽和脂肪酸有6種，不飽和脂肪酸有8種，而C20∶0、C22∶0和C23∶0的含量低于最低檢測限，無法進行統(tǒng)計計算。與對照組相比，小鼠血清中C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3的含量在飼喂高脂飼料后都顯著增多，而C17∶0、C20∶4和C22∶6顯著減少。

高濃度的C16∶0和C18∶0可能是由于高脂飼料中含有15%的豬油，豬油含有豐富的SFA特別是C16∶0和C18∶0[7]。Barreyro等人發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中過多的SFA(C16∶0和C18∶0)積累可誘導(dǎo)Bim和FasL的表達，增加的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[8]。

有文獻報道脂質(zhì)中不飽和的脂肪酸越多，就會產(chǎn)生越多的活性氧，使細(xì)胞膜和線粒體的通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡/壞死[9]。本試驗中與對照組相比，高脂組MUFA C18∶1 和C20∶1的含量增加，又通過C18∶1與C18∶0比值，我們估算出Δ9去飽和酶的活性在飼喂高脂飼料后升高。同樣，較對照組比較，高脂組小鼠血清中PUFA也增多，如C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、和C20∶3。

有試驗證明，較低的n-6族與n-3族 PUFA的比例是預(yù)防NAFLD[11]的有效指標(biāo)。本試驗中二者比值升高，也是疾病進行的表現(xiàn)。

綜上所述，高脂誘導(dǎo)能使血清中脂肪酸含量發(fā)生明顯變化，同時會加重脂肪酸代謝類疾病發(fā)展過程。

[1] 鄭淑容. 脂肪酸的營養(yǎng)功能[J]. 畜禽業(yè),2012,09:55-57.

[2] 宋增廷,王華朗,楊榮,等. 脂肪酸功能及其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2015,42(12):3 253-3 260.

[3] 劉睿杰,王莉梅,常明,等. n-6/n-3多不飽和脂肪酸比例對HepG2細(xì)胞脂代謝的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2017,33(01):1-7.

[4] Shapiro H，Tehilla M，Attal-Singer J，etal. The therapeutic potential of long-chain omega-3 fatty acids in nonalcoholic fatty liver disease[J]．Clinical Nutrition，2011，30(1)：6-19．

[5] 王穎. 表達ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因雞的研究[D].新疆：石河子大學(xué),2016.

[6] Warensjo E，Rosell M，Hellenius M-L，etal．Associations between estimated fatty acid desaturase activities in serum lipids and adipose tissue in humans：links to obesity and insulin resistance[J]．Lipids Health Dis，2009，8(37)：10．1 186．

[7] 趙海珍，陸兆新，別小妹，等．高效液相色譜法測定豬油甘油三酯中的脂肪酸位置分布[J]．色譜，2005，23(2)：142-145．

[8] Barreyro F J，Kobayashi S，Bronk S F，etal．Transcriptional regulation of Bim by FoxO3A mediates hepatocyte lipoapoptosis[J]．Journal of Biological Chemistry，2007，282(37)：27 141-27 154．

[9] Catal A．Lipid peroxidation of membrane phospholipids generates hydroxy-alkenals and oxidized phospholipids active in physiological and/or pathological conditions[J]．Chemistry and physics of lipids，2009，157(1)：1-11．

[10] 蔣瑜,熊文珂,殷俊玲,等. 膳食中ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸攝入與心血管健康的研究進展[J]. 糧食與油脂,2016,11:1-5.

Effectsofhighfatonfattyacidcontentinserumofmice

WANG Tong , CUI Xiao-xu , LI Chun-yan , ZHANG Xiu-ying

(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

In this study, the content of fatty acids in serum was measured by gas chromatography, and the effects of high fat on serum fatty acid content were studied. The mice were randomly divided into two groups: wild-type control group (WT-ND) and wild-type high-fat group (WT-HFD). 10 rats in each group were fed with high-fat diet for six weeks. Blood was collected. The content of fatty acids was determined after saponification. The results showed that C12∶0, C14∶0, C15∶0, C16∶0, C18∶0, C18∶1, C18∶2, C18∶3,C20∶1，C20∶2 and C20∶3 were increased when compared with the control group, while C17∶0, C20∶4 and C22∶6 showed a decreasing trend. The results showed that high fat induction could change the content of fatty acids in serum and aggravate the development of fatty acid metabolic diseases.

fatty acid; gas chromatography; wild type ICR mice; high-lipid diet

ZHANG Xiu-ying

R458.5

A

0529-6005(2017)09-0100-03

2017-03-15

王通(1982-)，男，博士生，研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail:1173136824@qq.com

張秀英，E-mail:zhangxiuying@neau.edu.cn