常超越 , 張召興 , 龐洪澤 , 李蘊(yùn)玉 , 張香齋 , 賈青輝 , 李佩國(guó)

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066604)

23味中藥對(duì)雞白痢沙門菌地方株體外抑菌試驗(yàn)

常超越 , 張召興 , 龐洪澤 , 李蘊(yùn)玉 , 張香齋 , 賈青輝 , 李佩國(guó)

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066604)

為了研究23種中藥對(duì)雞白痢沙門菌地方株S1、S2及標(biāo)準(zhǔn)株的體外抑菌試驗(yàn)效果。方法：利用平板瓊脂打孔法和試管二倍梯度稀釋法分別測(cè)定抑菌圈直徑大小、最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明：雞白痢沙門菌地方株S1、S2對(duì)黃芩、連翹、五倍子等8種藥物極度敏感;對(duì)其他的藥物存在不同程度的敏感性。本試驗(yàn)研究為雞白痢沙門菌地方株中藥防治提供理論基礎(chǔ)。

雞白痢 ； 沙門菌 ；中藥 ； 體外抑菌試驗(yàn)

雞白痢是由雞白痢沙門菌(SalmonellaPullrum)引起不同階段的雞的一種細(xì)菌性疾病，尤其對(duì)雛雞易感，該菌通過(guò)水平傳播，嚴(yán)重危害著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[1-3]。該菌易產(chǎn)生耐藥性，在養(yǎng)雞過(guò)程中抗生素的不合理使用，使SalmonellaPullrum的抗藥性問(wèn)題日漸上升，嚴(yán)重威脅人們的健康[4]。中藥具有抗菌消炎、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[5]。中藥的使用可以降低抗生素類藥物殘留，減少耐藥性。

本試驗(yàn)對(duì)從臨床分離的致病性雞白痢沙門菌地方株代表株S1、S2進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13313作為質(zhì)控菌株。利用平板瓊脂打孔法和試管二倍稀釋法，篩選出對(duì)雞白痢沙門菌地方株敏感的中藥，為致病性雞白痢沙門菌中藥防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 致病性雞白痢沙門菌S1、S2為秦皇島地區(qū)流行株，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC13313由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 黃芩、訶子、蘇木、厚樸、五倍子、紫花地丁、夏枯草、五味子、烏梅、秦皮等23種中藥，均購(gòu)自秦皇島民樂(lè)醫(yī)藥有限公司；S.S.營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，均購(gòu)自上海華美生物技術(shù)有限公司；常規(guī)試劑及儀器由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 菌液的制備及計(jì)數(shù) 雞白痢沙門菌地方代表株S1、S2及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13313的菌種復(fù)蘇，接種于S.S.培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑取菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。利用平板菌落計(jì)數(shù)器進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4 中藥藥液的制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)制備中草藥藥液[6]，稱量各單味中藥50 g后，加入5～10倍蒸餾水浸泡1 h，煮開(kāi)后文火煎0.5 h左右，8層紗布過(guò)濾；中藥殘?jiān)尤?倍蒸餾水煮開(kāi)后文火煎0.5 h左右，8層紗布過(guò)濾；把兩次藥液文火濃縮量到50 mL，即每毫升含原生藥1 g，離心取上清，調(diào)整pH值為7.3，121 ℃高壓滅菌后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單味中藥抑菌圈直徑的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[5],采用平板瓊脂打孔法，確定中藥抑菌圈的直徑的大小。通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法將菌液的濃度調(diào)至到107～108CFU/mL，取0.1 mL均勻進(jìn)行涂板，待菌液完全被吸收，用6 mm打孔器，進(jìn)行打孔，每孔內(nèi)加滿中藥藥液。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，測(cè)量抑菌圈直徑，每種藥物的藥敏試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑≥20 mm為極敏；20 mm>抑菌直徑≥15 mm為高敏；15 mm>抑菌直徑≥10 mm為中敏；10 mm以下為低敏[8]。

1.6 單味中草藥最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 按照采用試管二倍稀釋法進(jìn)行，確定中藥最小抑菌濃度(MIC)[9]。取無(wú)菌的試管10支進(jìn)行編號(hào)，每管加入營(yíng)養(yǎng)肉湯4 mL,在第1管內(nèi)加入中藥液4 mL，取出4 mL放入第2管，以此類推，稀釋到第9管，棄去4 mL，即藥物的濃度依次為1 g/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL，第10管為空白對(duì)照管，在1～10管加入菌液10 μL(107～108CFU/mL),每種藥做3個(gè)平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌棉簽分區(qū)劃線法將個(gè)稀釋不同梯度的試驗(yàn)菌液接種于普通培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。無(wú)菌生長(zhǎng)的區(qū)域?yàn)樵撍幍淖钚〉囊志鷿舛?MIC)。

2 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 單味中藥抑菌圈直徑的大小結(jié)果 由表1可知，雞白痢沙門菌地方株S1對(duì)黃芩、連翹、厚樸、五倍子、夏枯草、烏梅、秦皮、訶子、蘇木8種藥物極度敏感；地方株S2對(duì)白頭翁、連翹、厚樸、五倍子、夏枯草、五味子、烏梅、秦皮、訶子、蘇木8種藥物極度敏感；地方株S1、S2對(duì)紫花地丁、黃連2種藥物高度敏感；其余的藥物對(duì)雞白痢沙門菌地方株S1、S2及標(biāo)準(zhǔn)菌株均沒(méi)有效果。

表1 中藥對(duì)雞白痢沙門菌體外抑菌試驗(yàn) /mm

2.2 單味中藥最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果 由表2可知，雞白痢沙門菌地方株S1對(duì)五味子、五倍子、烏梅3種藥物的MIC在15.65～31.25 mg/mL之間，對(duì)黃芩、連翹、夏枯草、秦皮、訶子、黃連、厚樸、蘇木8種藥物的MIC在62.5～125 mg/mL之間，對(duì)紫花地丁、白頭翁2種藥物效果較差，MIC在250～500 mg/mL之間；地方株S2對(duì)五倍子、夏枯草、五味子、烏梅4種藥物的MIC的均是 31.25，對(duì)黃芩、連翹、厚樸、秦皮、訶子、蘇木6種藥物的MIC在62.5～125 mg/mL之間，對(duì)白頭翁、黃連、紫花地丁3種藥物的藥物效果較差，MIC在250～500 mg/mL之間；雞白痢沙門菌地方株S1、S2及標(biāo)準(zhǔn)菌株均沒(méi)有效果

表2 中藥對(duì)雞白痢沙門菌地方株的MIC (mg/mL)

3 討論

雞沙門菌病是由沙門菌屬中的一種或多種沙門菌所引起的禽類急性或慢性疾病的總稱[10]。雞白痢可引起不同日齡的級(jí)發(fā)病，主要侵害10～20日齡的雛雞，雛雞主要表現(xiàn)白色的下痢，導(dǎo)致大批的雛雞死亡[11]。成年雞感染后可以長(zhǎng)期帶毒和排毒，不僅可以通過(guò)水平傳播，也可以通過(guò)垂直傳播，導(dǎo)致雞白痢廣泛流行[12]。感染后的禽及其產(chǎn)品經(jīng)過(guò)食物鏈形式傳染給人，引起人類食品源性疾病，危害著人們的健康[13]。目前采用抗生素來(lái)有效控制雞沙門菌病，根據(jù)該菌易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，大大降低了抗生素的治療效果。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)雞白痢沙門菌地方流行株S1、S2進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示，S1、S2對(duì)白頭翁、黃芩、連翹、厚樸、五倍子、烏梅、秦皮、訶子、蘇木9種藥物極度敏感。夏美玲等[14]報(bào)道了黃連、秦皮對(duì)傷寒沙門菌高度敏感，與本試驗(yàn)存在一定的差異性，可能由于不同病原體感染，存在著差異性。代如意等[15]報(bào)道了采用二倍試管稀釋法分別測(cè)定各中藥提取物對(duì)雞白痢沙門菌的MIC，結(jié)果顯示，訶子、紫花地丁、夏枯草等提取物對(duì)雞白痢沙門菌的MIC在62.5～125mg/mL之間，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，其他藥物的MIC也存在一定的差異性，可能由于中藥的制備工藝不同。張德顯等[16]等報(bào)道了黃連、黃芩和烏梅3種中藥對(duì)雞白痢沙門菌的抑菌效果最好。本試驗(yàn)為臨床應(yīng)用中藥防治雞白痢沙門菌地方流行株提供理論基礎(chǔ)。

[1] 徐成剛,樊惠英,曹偉勝,等.2008 年禽病流行狀況及 2009 年流行趨勢(shì)[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2009,5:2-4.

[2] 張璞,任芳.雞白痢的流行特點(diǎn)及防治措施[J].畜牧與飼料科學(xué),2015,36(11):120-121.

[3] 賈青輝,李蘊(yùn)玉,李佩國(guó),等.河北省蛋雞主要疫病發(fā)生及流行情況的調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015,(08下)：92-94.

[4] 房海,陳翠珍.中國(guó)食物中毒細(xì)菌[M].北京:科學(xué)出版社,2014：95-100.

[5] 張丁華.中草藥復(fù)方制劑對(duì)雞三種細(xì)菌性疾病的防治研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[6] 向雙云,周珍輝,李玉冰.8種中草 藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015,(05上):167-169.

[7] 陳虹,劉磊,吳潤(rùn),等.中草藥復(fù)方對(duì)畜禽腸道病原的體外抑菌試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2009,37(13):6 005-6 006．

[8] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[ M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:65-87.

[9] 張傳美,劉海生,楊海燕,等.16種中藥對(duì)水貂綠膿桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(12):2 140-2 160．

[10] 房海,陳翠珍,張曉君.腸桿菌科病原細(xì)菌[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2011:170-178.

[11] 李靜怡,崔可器,馮賽祥,等.雞白痢沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性及分子分型研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014,35(2):29-33.

[12] 查華,石火英,吉貞穎,等.雞白痢沙門氏菌分離株的致病性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,44(11),1 812-1 818.

[13] 薛久剛,李瑞香,張亞娟,等.雞白痢的危害及預(yù)防措施[J].畜牧與飼料科學(xué)，2015,35(1):110-111.

[14] 夏美玲,呂麗艷,劉野,等.5種中草藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)的研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,30(24):3 023-3 025.

[15] 代如意,李莉,殷中瓊,等.5味中藥對(duì)雞白痢沙門氏菌的體外聯(lián)合抑菌研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,43(2):34-36.

[16] 張德顯,陳耀楠,南匯珠,等.10種中藥對(duì)雞白痢沙門菌的體外抗菌活性測(cè)定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013,49(3):41-44.

TheinvitroantibacterialeffectofsingleChineseherbalmedicineontheLocalstrainsofSalmonellaPullruminchicken

CHANG Chao-yue , ZHANG Zhao-xing , PANG Hong-ze ， LI Yun-yu , ZHANG Xiang-zhai , JIA Qing-hui , LI Pei-guo

(KeyLaboratorry of preventive Veterinary Medicine in Heibei Province, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066604, China)

In this study, the in vitro antibacterial effect of 23 Chinese herbal medicines on the local strains ofSalmonellaPullrumisolated from chicken, was analyzed. Methods: The diameter of the inhibition zone was measured by the agar diffusion plate method. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the tube serial two-fold dilution method. The results showed that the local strains ofSalmonellaPullrumwas extremely sensitive to 8 kinds of Chinese medicines, such asBaikalSkullcap,ForsythiaandGallnut. Other drugs had different degree of sensitivity to the local strains ofSalmonellaPullrum. Eight kinds of Chinese medicines have good antibacterial effects onSalmonellaPullrumand it provides a theoretical basis on prevention and control ofSalmonellaPullrumby Chinese medicines.

Pullorosis;Salmonella; Chinese herbal medicine ; In vitro antibacterial test

LI Pei-guo

S853.72

A

0529-6005(2017)09-0031-03

2016-11-03

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系技術(shù)研究崗位項(xiàng)目(HBCT2013090203)

常超越(1991-)，女，碩士生，主要從事動(dòng)物病原微生物及其防控方面的研究，E-mail: changchaoyue2016@163.com

張召興(1988-)，男，碩士生，主要從事動(dòng)物病原微生物及其防控方面的研究，E-mail：keshiyjszzx0224@126.com

注：張召興與常超越對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

李佩國(guó)，E-mail: lpeiguo@163.com