邢瑩瑩，李青春，韓艷艷，李小琳

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是生殖功能障礙與糖代謝異常并存的一種特殊疾病。多以高雄激素血癥、持續(xù)性無(wú)排卵或排卵障礙、胰島素抵抗和高脂血癥為主要特點(diǎn)[1]。目前對(duì)PCOS的研究多借助于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，PCOS的造模方法有很多，其中脫氫表雄酮(dehydroepi androsterone，DHEA)造模是比較理想的造模方法[2]，從生殖和代謝方面全面評(píng)估模型動(dòng)物的表型特征，為PCOS模型的建立奠定研究基礎(chǔ)。

微小RNA(miRNA)是一類約由19～25個(gè)核苷酸組成內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)或促進(jìn)靶基因mRNAs降解發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3]。每個(gè)miRNA都可以調(diào)控上百個(gè)基因的表達(dá)，據(jù)推測(cè)，人類基因組上約有1/3基因的表達(dá)都受到miRNA的調(diào)控[4]。近年來(lái)，血液中的miRNA又稱為循環(huán)miRNA，血清中miRNA含量豐富，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐核酸酶并且容易檢測(cè)到[5-6]，在疾病的早期篩查、區(qū)分高危人群等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。循環(huán)miRNA的含量變化可作為多種疾病的診斷標(biāo)志物。本文旨在研究miRNA-93及靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor, VEGFA)在PCOS大鼠模型血清中的表達(dá)及相關(guān)作用，以期為PCOS的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用3周齡雌性SD清潔級(jí)大鼠40只，體質(zhì)量(50±20) g，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院新區(qū)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于IVC專用籠，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用水使用大鼠專用水，籠內(nèi)墊料每周更換2次，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心溫度維持在(22±1) ℃，濕度為50%左右，明暗交替周期設(shè)為12 h。

1.1.2主要試劑及儀器DHEA購(gòu)于索萊寶公司，注射用大豆油購(gòu)于RUBIO公司。miRNA提取試劑盒、miRNA Cdna Synthesis Kit、miRNA qPCR Assay Kit，均購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司。50%葡萄糖注射液大鼠胰島素(insulin,INS)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，大鼠VEGFA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，INS酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。熒光定量PCR儀器(美國(guó)伯樂(lè)公司，Thermo Heraeus Multifuge X1R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。羅氏優(yōu)越型血糖儀(德國(guó)ROCHE公司)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建動(dòng)物模型將40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組20只，觀察組大鼠每日頸背部皮下注射DHE6 mg·100 g-1體質(zhì)量+0.2 mL無(wú)菌注射用油，對(duì)照組每日頸背部皮下注射0.2 mL無(wú)菌注射用油劑。均于上午10時(shí)，連續(xù)皮下注射28 d。

1.2.2標(biāo)本取材在造模28 d結(jié)束后，5%水合氯醛腹腔注射麻醉后摘眼球法，取5～10 mL血，室溫放置1 h，以2 000 r·min-1離心10 min，分離血清后進(jìn)行解剖，取雙側(cè)卵巢，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)溶液清洗，顯微鏡下分離卵巢多余的脂肪組織，并稱重。固定于中性福爾馬林溶液中，進(jìn)行石蠟包埋切片，用于HE染色。

1.2.3觀察內(nèi)容及方法①每日記錄大鼠體質(zhì)量，解剖后用電子體質(zhì)量測(cè)量?jī)x、電子精密天平及游標(biāo)卡尺測(cè)量子宮、卵巢質(zhì)量。卵巢質(zhì)量為左、右卵巢之和。②動(dòng)情周期：連續(xù)2個(gè)周期(每個(gè)周期4～5 d)進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，采用巴氏染色法觀察大鼠動(dòng)情周期。③酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒(購(gòu)于武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)檢測(cè)大鼠血清INS、VEGFA。④觀察兩組大鼠雙側(cè)卵巢大體解剖，石蠟包埋卵巢組織，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察其組織形態(tài)。⑤口服胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test,ITT)：大鼠禁食不禁水12 h，分別以0.5 U·kg-1的劑量腹腔注射50%胰島素，鼠尾尖取血，用羅氏優(yōu)越型血糖儀(德國(guó) ROCHE 公司)測(cè)定大鼠灌胰島素后0、15、30、60、120 min的血糖值。⑥口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)：大鼠禁食不禁水12 h，以3 g·kg-1劑量灌服50% 葡萄糖溶液，尾尖取血，用血糖儀測(cè)定大鼠灌糖后0、15、30、60、120 min的血糖值。⑦計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：HOMA-IR=空腹血糖(mmol·L-1)×空腹胰島素(mIU·L-1)/22.5。⑧血脂測(cè)定：應(yīng)用全自動(dòng)免疫發(fā)光儀(西門(mén)子DPC IMMULITE 2000)測(cè)定大鼠黃體生成激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇 (E2)及代謝指標(biāo)血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。⑨RT-PCR檢測(cè)大鼠血清miRNA-93表達(dá)引物借助https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì)，委托上海生工有限公司合成。具體步驟按miRNA提取試劑盒、miRNA Cdna Synthesis Kit、實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)操作(均購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司)，miRNA-93上游引物：5’-TGCGCCAAAGTGCTGTTCGTGCA-3’，miRNA-93下游引物為試劑盒通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為：100bp，內(nèi)參為U6，上游引物為5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游為5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為：110 bp，采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量、腹圍、卵巢、子宮質(zhì)量及比較觀察組大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠腹圍、卵巢模型組略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠體質(zhì)量，腹圍，卵巢、子宮質(zhì)量及比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。

2.2大鼠動(dòng)情周期的變化對(duì)大鼠進(jìn)行2個(gè)周期(1個(gè)周期4～5 d)的陰道涂片巴氏染色觀察動(dòng)情周期，觀察組大鼠動(dòng)情周期不規(guī)律，提示無(wú)排卵；對(duì)照組動(dòng)情周期規(guī)律(見(jiàn)圖1)。動(dòng)情前期(A)以小、圓、有核上皮細(xì)胞為主，持續(xù)時(shí)間12 h左右。動(dòng)情期(B)持續(xù)時(shí)間9～15 h以不規(guī)則狀無(wú)核上皮細(xì)胞為主。動(dòng)情后期(C)有核上皮細(xì)胞，無(wú)核上皮細(xì)胞，白細(xì)胞均存在為主，持續(xù)時(shí)間14～18 h。間情期(D)白細(xì)胞為主，持續(xù)時(shí)間60～70 h。

圖1 大鼠動(dòng)情周期的變化(巴氏染色，×200)

2.3大鼠血清FSH、LH、T、E2水平變化觀察組大鼠血清FSH、T、LH水平較對(duì)照組明顯升高，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組LH比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，E2水平較對(duì)照組明顯降低，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠血清 FSH、LH、T水平比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。FSH:促卵泡成熱激素；LH黃體生成激素；T：睪酮；E2:雌二醇。

2.4大鼠血脂變化觀察組大鼠血清甘油三酯(TG)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組與對(duì)照組膽固醇(TC)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠血清TC、TG比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。TG:甘油三酯；TC:膽固醇。

2.5卵巢形態(tài)學(xué)變化觀察組大鼠卵巢表面蒼白，體積增大；鏡下見(jiàn)卵泡多呈囊性擴(kuò)張，變成囊泡即空卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少多為2～3層、排列疏松，各級(jí)卵泡及黃體少見(jiàn)。對(duì)照組大鼠卵巢色澤紅，表面多個(gè)紅點(diǎn)或紫點(diǎn)；鏡下可見(jiàn)各級(jí)發(fā)育卵泡及多個(gè)黃體，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞呈多層，多為8～9層，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠卵巢切片(HE染色，×40)

2.6OGTT與ITT結(jié)果檢測(cè)大鼠0、15、30、60、120 min血糖值。結(jié)果表明與對(duì)照組相比觀察組大鼠不能診斷為糖尿病，而胰島功能受損，結(jié)果見(jiàn)圖3-4。

2.7兩組大鼠空腹血糖、HOMAI-IR比較觀察組空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)值明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，觀察組大鼠空腹胰島素(fasting insulin,FINS)、HOMAI-IR明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明大鼠存在胰島素抵抗，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖3 糖耐量實(shí)驗(yàn)

圖4 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

組 別nFBG/(mol·L-1)FINS/(mIU·mL-1)HOMAI-IR觀察組204.45±0.76①4.14±0.86①0.82±0.41①對(duì)照組203.65±0.50 1.34±0.34 0.22±0.05 t3.776.456.35P0.000.000.00

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。FBG:空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HOMAI-IR：胰島素抵抗指數(shù)。

2.8ELISA檢測(cè)血清中VEGFA的表達(dá)觀察組VEGFA的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：觀察組卵巢組織中VEGFA的表達(dá)增加(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 兩組VEGFA水平比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。VEGFA:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。

2.9大鼠血清miRNA-93的表達(dá)量miRNA-93相對(duì)基因表達(dá)的結(jié)果顯示：觀察組與對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.55∶1；SD為0.097、0.032。與對(duì)照組比較，miRNA-93在觀察組大鼠血清中的表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,n=6)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

A:觀察組；B:對(duì)照組。1：mark；4～8：觀察組；10～14：對(duì)照組。圖6 熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-93結(jié)果

3 討論

PCOS是育齡期女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，患病率為5%～10%，占無(wú)排卵性不孕患者的70%～80%[7]。病因至今尚未闡明，研究認(rèn)為其可能是由于某些遺傳基因與環(huán)境因素相互作用所致[8-9]。此外，一些細(xì)胞因子，如VEGFA也與不孕有關(guān)。有研究顯示卵巢血管的生成與PCOS的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[10]。PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)在國(guó)際上一直存在較大的爭(zhēng)議，目前比較廣泛運(yùn)用于臨床的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要有：2003年5月歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會(huì)和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)(ESHRE/ASRM)鹿特丹會(huì)議提出的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科分會(huì)內(nèi)分泌學(xué)組專家學(xué)者制定的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]?，F(xiàn)階段臨床醫(yī)學(xué)關(guān)于PCOS的診斷方法有基礎(chǔ)體溫測(cè)定、B超、診斷性刮宮、腹腔鏡以及內(nèi)分泌測(cè)定等[13]。由于PCOS患者臨床取材困難，大鼠具有價(jià)格低廉、遺傳背景穩(wěn)定、動(dòng)情周期規(guī)律、便于集中管理監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。采用雄激素誘導(dǎo)動(dòng)物使其產(chǎn)生伴有胰島素抵抗的PCOS模型已經(jīng)成為經(jīng)典可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚14]。本實(shí)驗(yàn)采用脫氫表雄酮造模方法構(gòu)建PCOS大鼠模型，結(jié)果顯示模型組中大鼠體質(zhì)量增加、性周期紊亂、卵巢呈多囊狀改變、卵泡成熟障礙，伴有高雄激素血癥的同時(shí)還出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂、血糖紊亂及胰島素抵抗、高胰島素血癥。這與人類PCOS有很多相似之處，與國(guó)內(nèi)外一些研究結(jié)果是一致的。

循環(huán)miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在的miRNA分子，具有差異表達(dá)明顯、檢測(cè)靈敏、取材方便等特點(diǎn)。大量研究表明循環(huán)miRNA在疾病診斷中也具有一定參考價(jià)值，可作為一種新型診斷標(biāo)志物分子。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在子宮、卵巢、輸卵管等女性生殖器官中均有miRNA的表達(dá)，并廣泛參與調(diào)控女性卵泡發(fā)育成熟、受精、著床及胚胎發(fā)育等生理過(guò)程，對(duì)維持女性正常生育功能起重要作用[15]。miRNA在PCOS性激素合成分泌、胰島素抵抗、卵泡發(fā)育及成熟、細(xì)胞凋亡、炎癥等方面均有一定調(diào)節(jié)作用[16]。PCOS患者脂肪組織中miRNA-93的高表達(dá)可導(dǎo)致GLUT4基因的表達(dá)下調(diào)，miRNA-93的高表達(dá)與胰島素抵抗指數(shù)有很大的相關(guān)性[19]。研究表明miRNA-93可通過(guò)結(jié)合靶基因細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑1A(CDKN1A)3′-UTR位點(diǎn)在PCOS患者中呈高表達(dá)，影響卵泡正常發(fā)育及成熟，導(dǎo)致排卵障礙及不孕[18]。PCOS患者血清中miRNAs表達(dá)譜存在差異，其異常的miRNAs表達(dá)通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄后的水平，參與PCOS的發(fā)生發(fā)展。

VEGFA是一種特異的與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮作用的因子，其功能包括誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性[20]。VEGFA對(duì)血管的再生、卵泡血管化、卵泡內(nèi)的氧化都發(fā)揮著重要作用，因此影響卵泡成熟、卵母細(xì)胞質(zhì)量、受孕及胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)數(shù)個(gè)靶基因發(fā)揮不同作用，而一個(gè)靶基因則可被數(shù)個(gè)miRNA調(diào)控，其相互作用的互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜。Long等證實(shí)miRNA-93的靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)[19]。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR、ELISA分別檢測(cè)PCOS大鼠血清中miRNA-93及靶基因VEGFA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示觀察組與對(duì)照組相比血清中miRNA-93及靶基因VEGFA表達(dá)一致呈高表達(dá)，提示VEGFA在卵巢內(nèi)異常表達(dá)、分泌并釋放入血，可能是卵巢間質(zhì)血管化增加的基礎(chǔ)，最終導(dǎo)致PCOS患者無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育的原因之一。miRNA-93可通過(guò)結(jié)合靶基因VEGFA在PCOS患者中呈高表達(dá)，影響卵泡正常發(fā)育及成熟，導(dǎo)致排卵障礙及不孕。

綜上所述，PCOS大鼠模型血清中miRNA-93及靶基因VEGFA表達(dá)上調(diào)，miRNA-93可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致VEGFA蛋白增多，從而參與PCOS的發(fā)生發(fā)展，循環(huán)miRNA-93可許可以作為PCOS的一種新型的非侵入性的診斷標(biāo)志物。然而miRNA在促進(jìn)顆粒細(xì)胞增生、加速顆粒細(xì)胞凋亡、阻礙卵泡正常發(fā)育及成熟、影響性激素合成及分泌和增強(qiáng)胰島素抵抗等方面的作用并不完善，仍需進(jìn)一步深入研究，以揭示miRNA在PCOS中的作用機(jī)理，為今后PCOS的診斷和治療提供新的依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

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