趙丹陽(yáng)，王衛(wèi)東，張嘉程，馬翎健

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥新型Avenin-like type b基因克隆、功能預(yù)測(cè)及品質(zhì)相關(guān)分析

趙丹陽(yáng)，王衛(wèi)東，張嘉程，馬翎健

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為進(jìn)一步明確Avenin-like type b基因的功能特性，以小麥品種西農(nóng)188為材料，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆小麥Avenin-like type b基因，對(duì)克隆得到的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分析編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)域分析探討其可能具有的功能特性，同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行體外原核表達(dá)及品質(zhì)功能相關(guān)分析。結(jié)果表明，從西農(nóng)188克隆得到4條序列，Genbank登錄號(hào)為KY794919～KY794922，其中KY794922在信號(hào)肽區(qū)段堿基缺失導(dǎo)致移碼突變。KY794919～KY794921序列與Avenin-like type b家族中大麥、柱穗山羊草、二穗短柄草及節(jié)節(jié)麥的同源性較高。蛋白序列分析表明，Avenin-like type b編碼氨基酸序列具有較高的保守性，其Cys的數(shù)目及位置也較為保守，具有兩個(gè)典型的AAI結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能為一類(lèi)具有α-淀粉酶抑制劑活性的蛋白。亞細(xì)胞定位顯示，該類(lèi)蛋白可能在合成加工后通過(guò)運(yùn)輸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外行使功能。SDS-PAGE分析表明，KY794919～KY794921體外原核表達(dá)成功。通過(guò)純化表達(dá)產(chǎn)物及摻粉試驗(yàn)表明，KY794919～KY794921編碼蛋白對(duì)小麥面粉品質(zhì)均具有顯著正向效應(yīng)，但僅有KY794919可顯著提高面粉吸水量進(jìn)而延長(zhǎng)面筋擴(kuò)展時(shí)間，說(shuō)明其可能在品質(zhì)功能研究資源中更具有優(yōu)越性。

Avenin-like type b；克??；功能預(yù)測(cè)；原核表達(dá)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的糧食作物之一，具有獨(dú)特的黏彈特性，在食品加工中應(yīng)用廣泛[1-2]。小麥籽粒貯藏蛋白是影響小麥加工品質(zhì)的重要因素[3]，它主要由谷蛋白與醇溶蛋白兩大類(lèi)組成。谷蛋白是一種多鏈蛋白，依據(jù)SDS-PAGE中遷移率大小可將谷蛋白亞基進(jìn)一步分為HMW-GS和LMW-GS，其組分氨基酸多為極性，可通過(guò)分子間二硫鍵交聯(lián)聚合構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，賦予面筋彈性[4]。醇溶蛋白是一種單體蛋白，它通過(guò)分子間二硫鍵與氫鍵共同作用構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由非共價(jià)鍵橋接在谷蛋白骨架上，從而賦予面筋黏性[5-6]。籽粒貯藏蛋白中二硫鍵的數(shù)量及類(lèi)型與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)[7-8]。

近年來(lái)，在小麥胚乳中發(fā)現(xiàn)了一種新型貯藏蛋白，其編碼基因與燕麥蛋白基因相似，因此命名為Avenin-like蛋白。該類(lèi)蛋白以其富含半胱氨酸(Cys)殘基的特性被廣泛關(guān)注。由于半胱氨酸(Cys)是形成蛋白質(zhì)二硫鍵的基礎(chǔ)，其位置及數(shù)量影響了二硫鍵的形成[9]，研究Avenin-like蛋白對(duì)小麥品質(zhì)改良具有重要意義。依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)差異可將其分為type a、type b兩種亞型，其基因長(zhǎng)度分別為450和855 bp，各含有148和265個(gè)氨基酸殘基，分子量約為16 kDa 和 30 kDa[10]。有研究表明，b型Avenin-like蛋白比a型多一個(gè)中間重復(fù)區(qū)，可形成比a型Avenin-like蛋白更多的分子間二硫鍵，該類(lèi)型蛋白對(duì)于小麥品質(zhì)研究意義更大[11]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于Avenin-like type b蛋白的研究仍處于起步階段，雖然目前已有研究對(duì)Avenin-like type b基因的時(shí)空表達(dá)特性、編碼蛋白特點(diǎn)、Cys殘基的分布等進(jìn)行了闡述，證明了其在小麥近緣種中的廣泛存在性[12-14]，但是對(duì)于小麥主栽培品種中Avenin-like type b遺傳結(jié)構(gòu)特性及功能特點(diǎn)的研究較少，因此有必要對(duì)其進(jìn)一步探討。

本研究以小麥主栽培品種西農(nóng)188為材料，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆小麥Avenin-like type b基因，結(jié)合生物信息學(xué)手段對(duì)克隆得到的基因進(jìn)行序列分析、同源性比對(duì)，分析編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特性，對(duì)編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域分析，探討其可能具有的功能特性。同時(shí)，對(duì)該基因進(jìn)行體外原核表達(dá)，通過(guò)純化表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合摻粉試驗(yàn)對(duì)其品質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行鑒定，以期為該基因的調(diào)控及作用機(jī)理的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試材料為小麥品種西農(nóng)188及中國(guó)春，由國(guó)家小麥改良中心楊凌分中心品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室提供。

2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)、pEASY-T1 克隆載體、pEASY-Blunt E1表達(dá)載體、Trans1-T1 Phage Resistant克隆感受態(tài)細(xì)胞、Trans BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞、KIO3溶液、DTT溶液、15 mmol·L-1咪唑以及Ni-IDA蛋白層析柱均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。OMEGA質(zhì)粒小量提取試劑盒由美國(guó)OMEGA公司提供。Promega Wizard凝膠回收試劑盒由美國(guó)PROMEGA公司提供。Clear First-3000 Purifier系統(tǒng)由上海閃譜生物科技公司提供。Mixolab2混合實(shí)驗(yàn)儀購(gòu)自法國(guó)Chopin Technologies公司。

1.2 克隆及表達(dá)引物

利用Primer premier 6.0軟件，參照小麥7D染色體上的Avenin-like type b基因(EU096549)編碼區(qū)序列[12]設(shè)計(jì)克隆引物avclongF/avclongR(avclongF:5′-ATGAAGGTCTTCATCCTGG CTC-3′，avclongR:5′-CTAGCACGCACCACC AGT-3′)。表達(dá)引物同克隆引物。所有引物均由南京金斯瑞公司合成。

1.3 方 法

1.3.1 基因組DNA的提取

取培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～8 d的小麥嫩葉，采用CTAB法[15]提取基因組DNA。

1.3.2 Avenin-like type b基因的克隆

以基因組DNA為模版，利用特異引物avclongF/avclongR對(duì)Avenin-like type b基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25 μL)： DNA模版2 μL(包含90 ng目的基因片段)，2×EasyTaqPCR Super Mix(+dye) 12.5 μL，上下游引物(0.2 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選擇目的條帶區(qū)域，切膠回收，再經(jīng)Promega Wizard凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物與克隆載體pEASY-T1連接過(guò)夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1 Phage Resistant，于42 ℃水浴鍋熱激轉(zhuǎn)化45 s，35 ℃、200 r·min-1搖床孵育1.5 h。取200 μL轉(zhuǎn)化后菌液，均勻涂布于含AMP的LB固體培養(yǎng)基中過(guò)夜，使用克隆載體通用引物M13進(jìn)行菌落PCR(反應(yīng)條件同目的基因擴(kuò)增)，最終選取陽(yáng)性單克隆送南京金斯瑞生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 基因序列分析

將所獲得的基因序列登錄至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Gene Structure Display Server分析Avenin-like type b基因的結(jié)構(gòu)[16]。用ORF Finder(NCBI工具：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)定位ORF信息。利用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4 蛋白質(zhì)序列分析及功能預(yù)測(cè)

利用DNAMAN 6.0進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯及多序列比對(duì)。利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)及ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白理化性質(zhì)。利用SMART在線服務(wù)器(http://smart.embl-heidelberg.de/)與IBS(http://ibs.biocuckoo.org/index.php)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。利用Signal P(www.cbs.dtu.dk/services/signalp)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)及PSORTⅡ(http://www.genscript.com/psort.html)對(duì)編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)進(jìn)行BLAST分析。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用引物avclongF/avclongR對(duì)含有陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為15 μL：菌液2 μL，上下游引物各1 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix(+dye) 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)條件同基因克隆。

0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收目的片段，并與pEASY Blunt E1表達(dá)載體連接，PCR中25 ℃連接反應(yīng)10 min。轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞， 熱激(同1.3.2)，將產(chǎn)物于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使用OMEGA質(zhì)粒小量提取試劑盒重組質(zhì)粒。利用通用引物T7P與克隆引物avclongR對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，挑選陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序以確定目的片段插入方向的正確性及ORF的完整性。

1.3.6 Avenin-like type b蛋白的體外表達(dá)及SDS-PAGE分析

依據(jù)測(cè)序結(jié)果，選擇目的片段插入方向正確且具有完整開(kāi)放閱讀框的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，接種在含AMP的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6，取菌液1 mL作為對(duì)照，向其余菌液中加入IPTG誘導(dǎo)3～6 h。取對(duì)照及誘導(dǎo)樣品各1 mL，通過(guò)12%SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果。

1.3.7 原核表達(dá)產(chǎn)物分離純化及品質(zhì)相關(guān)功能鑒定

取誘導(dǎo)菌液500 μL，于4 ℃、8 000 r·min-1離心6 min，棄上清液。經(jīng)4 ℃超聲破碎處理，加入15 mmol·L-1低濃度咪唑洗滌，通過(guò)Ni-IDA柱過(guò)柱純化。所得產(chǎn)物經(jīng)ClearFirst-3000 Purifier系統(tǒng)透析24 h，低溫冷凍干燥后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?2% SDS-PAGE檢測(cè)分離純化效果。

按照國(guó)標(biāo)GB/T14614-93用Mixolab2混合實(shí)驗(yàn)儀(法國(guó)Chopin Technologies)測(cè)定樣品的相關(guān)粉質(zhì)參數(shù)。具體步驟如下：以10 g中國(guó)春小麥粉為基礎(chǔ)面粉，加入150 mg待測(cè)樣品充分混勻，添加適量水及0.5 mL 50 μg·mL-1的DTT溶液，充分揉和2 min后，繼續(xù)加入0.5 mL 50 μg·mL-1的KIO3溶液，揉和反應(yīng)10 min，采集粉質(zhì)儀數(shù)據(jù)，記錄粉質(zhì)曲線，并利用SPSS 21.0中文版對(duì)主要粉質(zhì)參數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Avenin-like type b基因克隆及檢測(cè)結(jié)果

利用引物avclongF/avclongR對(duì)西農(nóng)188的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，得到800～1 000 bp的單一條帶(圖1)。目的片段經(jīng)過(guò)回收、純化，連接至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得7個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序后共獲得4條序列。將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)KY794919～KY794922。

M：Trans2K DNA marker；1～7：7個(gè)陽(yáng)性克隆；箭頭所指為目的片段。

M：Trans2K DNA marker;1-7:Seven positive clones;Arrow indicates taget fragments.

圖1Avenin-liketypeb基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCRamplificationresultsofavenin-liketypebgene

2.2 Avenin-like type b基因序列分析

核酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，克隆得到的4條序列除KY794922外，長(zhǎng)度均為855 bp。序列KY794922在起始密碼子處發(fā)生堿基缺失，導(dǎo)致整個(gè)基因移碼突變，因此預(yù)測(cè)其不具有正常編碼Avenin-like type b蛋白的能力。序列KY794920與KY794921相似度較高(99.88%)，僅在第55位出現(xiàn)T←→G堿基置換，而KY794919與KY794920及KY794921均存在多個(gè)位點(diǎn)的堿基置換。將KY794919、KY794920、KY794921序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，3條序列與大麥(Hordeumvulgare)、柱穗山羊草(Aegilopscylindrica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)及普通小麥(Triticumaestivum)Avenin-like type b基因家族成員相似度較高(均大于95%)，與水稻(Oryzasativa)Avenin-like type b家族成員相似度低于93%；與小麥其他類(lèi)型貯藏蛋白成員(HMW-GS、LMW-GS、醇溶蛋白)相比，一致性均低于50%。

2.3 Avenin-like type b蛋白質(zhì)序列分析

2.3.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用DNAMAN 6.0推導(dǎo) KY794919～KY794921所編碼的氨基酸序列，并通過(guò)ProtParam分析其理化性質(zhì)。結(jié)果表明，KY794919～KY794921所編碼的蛋白質(zhì)分子量在30 kDa左右，理論等電點(diǎn)為7.83～8.26，均編碼284個(gè)氨基酸；在組成該類(lèi)蛋白的20種氨基酸中，Gln的比例最高，而Asp的比例最?。籏Y794919編碼Cys的數(shù)目為19個(gè)，較為少見(jiàn)，而KY794920與KY794921編碼Cys的數(shù)目為18個(gè)；三者編碼蛋白的脂肪指數(shù)較高，KY794919為76.26，KY794920與KY794921為79.68；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于80，說(shuō)明該類(lèi)蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性(GRAVY)值為-0.443～-0.374，為疏水性蛋白。

2.3.2 蛋白質(zhì)信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析

信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果(圖2)表明，KY794919～KY794921編碼蛋白第10位的丙氨酸(Ala)殘基具有最高的信號(hào)肽分值(S-score)：KY794919為0.981，KY794920與KY794921為0.987，第19位的谷氨酰胺(Aln)殘基具有最高的酶切位點(diǎn)分值(C-score)以及綜合酶切位點(diǎn)分值(Y-score)：KY794919分別為 0.684和0.807,KY794920分別為0.658和0.794，KY794921分別為0.543和0.720，最后推算所得信號(hào)肽平均值(S-mean)與D值(S-mean與Y-score的平均值)均大于0.5。因此，推測(cè)該類(lèi)蛋白具有信號(hào)肽，第1位至第18位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域，成熟肽始于第19位氨基酸。

使用TargetP、WoLF PSORT及PSORTⅡ?qū)幋a蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，其中，TargetP顯示該類(lèi)蛋白可能位于分泌通路，WoLF PSORT顯示該類(lèi)蛋白定位于細(xì)胞外的概率最大，PSORTⅡ顯示該類(lèi)蛋白可能存在于運(yùn)輸小泡中。因此，推測(cè)該類(lèi)蛋白可能在合成后通過(guò)運(yùn)輸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外行使功能。

表1 本研究所得Avenin-like type b基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他基因序列的一致性Table 1 Similarity sequences between Avenin-like type b genes obtained in this study and other genes in Genbank database %

C-Score為酶切位點(diǎn)分值;S-score為信號(hào)肽分值;Y-Score為綜合酶切位點(diǎn)分值。

C-Score,S-score and Y-Score indicated the scores of the digestion site,the signal peptide and the restriction site,respectively.

圖2Avenin-liketypeb蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

Fig.2PredictionresultofsignalingpeptideofAvenin-liketypeb

2.3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOPMA軟件預(yù)測(cè)KY794919～KY794921編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)蛋白主要以α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲及延伸鏈組成，其中α-螺旋最多，其次是無(wú)規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角及延伸鏈所占比例較小。

將蛋白序列提交至SMART數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合IBS(http://ibs.biocuckoo.org/index.php)分析其結(jié)構(gòu)域。結(jié)果如圖3所示，KY794919～KY794921所編碼的Avenin-like type b蛋白第1至18位氨基酸為信號(hào)肽，第26至41位氨基酸上存在低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域，在49至145及166至265位氨基酸位置存在典型的AAI結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏AI-LTSS超家族所特有。AAI-LTSS家族由α-淀粉酶抑制劑(AAIs)和種子貯藏蛋白亞家族(SS)組成，它們主要存在于各種植物的種子中。

2.3.4 蛋白質(zhì)同源性比對(duì)及系統(tǒng)演化樹(shù)分析

Sig、Low、AAI和Rep-region分別表示信號(hào)肽、低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域、AAI-LISS家族典型結(jié)構(gòu)域和重復(fù)區(qū)域；圖中數(shù)字為氨基酸位點(diǎn)。

Sig,Low,AAI and Rep-region represent the signal peptide,the low complexity domain,the typical domain of the AAI-LISS famiy and the repeat region in the peptide chain;The numbers indicate the amino acid sites.

圖3Avenin-liketypeb蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

Fig.3ProteindomainanalysisofAvenin-liketypeb

Signal、N-ter、Rep A、Rep B和C-terminal分別表示信號(hào)肽、N端、A重復(fù)區(qū)、B重復(fù)區(qū)、C端；三角形表示半胱氨酸(Cys)的位置。

Signal，N-ter，Rep A，Rep B and C-terminal indicate the signal peptide,the N-terminus,the repeating region A,the repeating region B and the C-terminal of the peptide chain,respectively;The triangle represtnts the position of cysteine(Cys).

圖4Avenin-liketypeb家族序列的比對(duì)

Fig.4ComparisonoftheAvenin-liketypebfamilysequences

將KY794919～KY794921所編碼的氨基酸序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中已知貯藏蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果(圖4)顯示，Avenin-like type b家族編碼氨基酸數(shù)目較為穩(wěn)定，克隆得到的三條序列與其他已知的Avenin-like type b蛋白序列半胱氨酸(Cys)位點(diǎn)均保持穩(wěn)定。該家族序列可劃分為5個(gè)區(qū)域：信號(hào)肽、N端、A重復(fù)區(qū)、B重復(fù)區(qū)和C端。信號(hào)肽區(qū)域最為保守，存在一個(gè)變異位點(diǎn)，僅KY794919在第12位氨基酸出現(xiàn)Ala→Tyr。N端存在4個(gè)變異位點(diǎn)，其中，二穗短柄草的編碼序列KF933298.1出現(xiàn)了罕見(jiàn)的堿基缺失。重復(fù)區(qū)是序列變異的集中區(qū)域，變異類(lèi)型主要為堿基替換，共存在56個(gè)變異位點(diǎn)，其中A重復(fù)區(qū)占78.6%，是變異的核心，B重復(fù)區(qū)占22.4%。C端存在14個(gè)變異位點(diǎn)，靠近C端末尾，KY794919有1處Tyr→Cys，從而導(dǎo)致KY794919所編碼的Avenin-like蛋白包含19個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，而在C端最末尾，KY400765發(fā)生了罕見(jiàn)的Cys→Tyr，導(dǎo)致該編碼產(chǎn)物為僅含17個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基。通過(guò)半胱氨酸(Cys)的位置及數(shù)目發(fā)現(xiàn)，該家族成員編碼Cys的位點(diǎn)主要集中于A重復(fù)區(qū)，信號(hào)肽部分無(wú)編碼位點(diǎn)，N端、C端及B重復(fù)區(qū)只有1-4個(gè)編碼位點(diǎn)，可以看出，Avenin-like type b蛋白家族具有較高的保守性。

將克隆序列與其他已知Avenin-like type b蛋白進(jìn)行同源性分析，利用maximum法構(gòu)建系統(tǒng)演化樹(shù)(圖5)。通過(guò)分析可知，克隆序列與已知Avenin-like type b家族中不同禾本科植物編碼序列均可聚為一類(lèi)。值得一提的是，KY794919蛋白序列相比KY794920、KY794921在進(jìn)化距離上產(chǎn)生了差異，導(dǎo)致其被聚為另一小分支。就Avenin-like type b家族而言，與HMW-GS及Gliadin中的α亞基類(lèi)型親緣關(guān)系較近，可聚合為大的分支，與其他亞基類(lèi)型的Gliadin親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4Avenin-liketypeb基因原核表達(dá)

利用引物avclongF/avclongR對(duì)含KY794919、KY794920、KY794921基因的單克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段回收、純化后連接至pEASY Blunt E1載體，導(dǎo)入Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)培養(yǎng)。測(cè)序檢驗(yàn)重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示目的基因ORF片段保持完整且插入方向正確，表明克隆序列的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為“pEASY-KY794919”、“pEASY- KY794920”、“pEASY-KY794921”。

△表示本研究所得的Avenin-like type b蛋白。

△ indicates the Avenin-like type b protein obtained in this study.

圖5Avenin-liketypeb蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

Fig.5PhylogenetictreeofAvenin-liketypebprotein

M：Blue Plus protein marker；1：空載體pEASY；2～4:pEASY-KY794919、pEASY-KY7949120、pEASY-KY794921融合表達(dá)載體；箭頭所示為目的蛋白。

M：Blue Plus protein marker；1：Empty vector pEASY;2-4:The fusion expression veetors pEASY-KY794919,pEASY-KY7949120 and pEASY-KY794921；The arrow indicates the target protein.

圖6經(jīng)IPIG誘導(dǎo)后KY794919～KY794921表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

Fig.6SDS-PAGEanalysisoftheexpressedproductsofKY794919-KY794921inducedbyIPIG

利用OMEGA試劑盒提取質(zhì)粒后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Trans-BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，以IPTG為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因表達(dá)，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。結(jié)果(圖6)顯示，本研究所誘導(dǎo)蛋白的分子量約為50 kDa。pEASY-E1表達(dá)載體含有His-Tag標(biāo)簽，分子量為20.4 kDa，除去標(biāo)簽蛋白，剩余表達(dá)產(chǎn)物分子量約為30 kDa，這與之前的分析結(jié)果相吻合，表明KY794919、KY794920、KY794921基因原核表達(dá)成功。

2.5 蛋白純化及品質(zhì)效應(yīng)鑒定結(jié)果

針對(duì)pEASY Blunt E1載體具有His標(biāo)簽的特點(diǎn)，使用Ni-IDA柱對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，并通過(guò)12% SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖7)顯示，電泳背景清晰，且在50 kDa附近出現(xiàn)單一條帶，說(shuō)明原核表達(dá)產(chǎn)物純化成功。

向10 g 中國(guó)春基礎(chǔ)面粉中加入KIO3及DTT，在氧化還原的基礎(chǔ)上繼續(xù)添加KY794919～KY794921表達(dá)純化產(chǎn)物，記錄粉質(zhì)曲線(圖8A～8D)及主要粉質(zhì)參數(shù)(表2)。由結(jié)果可知，加入Avenin-like type b蛋白后，7個(gè)參數(shù)中除機(jī)械耐力指數(shù)和及線時(shí)間外均有提高。其中，面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間、離線時(shí)間和粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)極顯著提高，機(jī)械耐力指數(shù)極顯著降低，及線時(shí)間中，僅KY794919誘導(dǎo)產(chǎn)物的加入引起參數(shù)極顯著提高，其他兩種產(chǎn)物的加入均導(dǎo)致參數(shù)極顯著降低。值得一提的是，KY794919誘導(dǎo)蛋白在及線時(shí)間與離線時(shí)間上均與KY794920、KY794921誘導(dǎo)蛋白存在極顯著差異。

M：Blue Plus protein marker；1～3：KY794919～KY794920的表達(dá)產(chǎn)物。

M：Blue Plus protein marker；1-3：The expressed products of the KY794919-KY794920.

圖7純化后的原核表達(dá)產(chǎn)物

Fig.7Prokaryoticexpressionproductsafterpurification

3 討 論

小麥種子蛋白中二硫鍵的類(lèi)型和數(shù)量影響著面筋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其黏彈性及強(qiáng)度。Avenin-like type b蛋白中富含半胱氨酸(Cys)，其高含量的半胱氨酸(Cys)殘基使分子內(nèi)或分子間更易形成較多的二硫鍵[17]，因此，研究該基因?qū)τ谛←溒焚|(zhì)改良具有重要意義。

本文使用簡(jiǎn)并引物avclongF/avclongR成功地從小麥材料西農(nóng)188中克隆出4條新型Avenin-like type b序列KY794919～KY794922，其中，KY794922因信號(hào)肽區(qū)段堿基缺失發(fā)生了移碼突變，因而不具備編碼Avenin-like type b蛋白的功能，這在已報(bào)道的Avenin-like序列中較為少見(jiàn)。通過(guò)與Avenin-like type b家族其他禾本科植物序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，KY794919～KY794921序列與水稻(Oryzasativa)的相似度最低，與大麥(Hordeumvulgare)、柱穗山羊草(Aegilopscylindrica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)及節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)的相似度較高。通過(guò)氨基酸序列分析也發(fā)現(xiàn)，KY794919～KY794921序列與這些類(lèi)型基因在Cys殘基及位置排布上也高度相似，因此推測(cè)它們可能在品質(zhì)等功能上也具有相似性。

A：中國(guó)春面粉中添加DTT和KIO3；B：中國(guó)春面粉中添加DTT、KIO3和KY794919誘導(dǎo)純化蛋白；C：中國(guó)春面粉中添加DTT、KIO3和KY794920誘導(dǎo)純化蛋白；D：中國(guó)春面粉中添加DTT、KIO3和KY794921誘導(dǎo)純化蛋白；虛線為500 BU稠度標(biāo)準(zhǔn)線。

A:Basic flour added with DTT and KIO3; B:Basic flour added with DTT，KIO3and purified protein encoded by KY794919; C:Basic flour added with DTT，KIO3and purified protein encoded by KY794920; D:Basic flour added with DTT，KIO3and purified protein encoded by KY794921; Dotted lines are the consistency standard of 500 BU.

圖8純化的KY794919～KY794921編碼蛋白對(duì)粉質(zhì)曲線的影響

Fig.8EffectsofpurifiedproteinencodedbyKY794919-KY794921onthefarinographparameters

表2 純化的KY794919～KY794921編碼蛋白對(duì)粉質(zhì)參數(shù)的影響Table 2 Effects of purified protein encoded by KY794919-KY794921 on the farinograph parameters

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示差異在0.01水平上顯著。

Values in the table are averaged from the three replicates；Values marked with different capital letters show significant difference at 1% probability level；DvT：Development time；ST：Stability time；MTI：Mixing tolerance index；AT：Arrival time；DT：Departure time；WC：Width of curve；FQN：Farinograph quality number.

通過(guò)蛋白同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Avenin-like type b家族編碼氨基酸序列具有較高的保守性，信號(hào)肽區(qū)域的保守性暗示其亞細(xì)胞定位的保守，依據(jù)序列特點(diǎn)可將其明顯劃分為5個(gè)區(qū)域，變異的核心部分集中在重復(fù)區(qū)域，該區(qū)域中變異位點(diǎn)較為豐富，半胱氨酸(Cys)的數(shù)目較多且位置極為保守。小麥籽粒蛋白中的半胱氨酸(Cys)影響著二硫鍵的形成及分布，二硫鍵與小麥面筋品質(zhì)關(guān)系密切[18]。因此對(duì)該區(qū)域的研究不僅是挖掘Avenin-like type b變異資源的重點(diǎn)內(nèi)容，同時(shí)也是研究小麥加工品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。本研究克隆得到的KY794919序列在C端末尾有一處Tyr→Cys的堿基突變，使其形成了19個(gè)半胱氨酸(Cys)，半胱氨酸(Cys)的增加促進(jìn)了更多二硫鍵的形成，這會(huì)增加蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)剛性，進(jìn)而影響面筋粘彈性[19-20]，因此該突變對(duì)于面筋品質(zhì)可能會(huì)有正向效應(yīng)。

本研究中，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Avenin-like type b蛋白可能在合成加工后通過(guò)運(yùn)輸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外實(shí)現(xiàn)功能。此前，Yamagata等[21]的研究表明，小麥中的一些貯藏蛋白(如谷蛋白)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上以前體形式被合成后，在高爾基體經(jīng)受體分類(lèi)進(jìn)入運(yùn)輸小泡，最終進(jìn)入蛋白貯藏型液泡，如果受體缺失就會(huì)被分泌到細(xì)胞外。這與本研究結(jié)果相似，但其具體機(jī)理有待深入研究。通過(guò)對(duì)克隆基因編碼的氨基酸系列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，本研究得到的Avenin-like type b蛋白具有兩個(gè)典型的AAI結(jié)構(gòu)域。AAI結(jié)構(gòu)域往往與α-淀粉酶抑制劑的活性相關(guān)，α-淀粉酶抑制劑在植物對(duì)昆蟲(chóng)和病原體的天然防御中發(fā)揮著重要的作用，它們可以通過(guò)抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性,防止植物淀粉和蛋白質(zhì)被消化[22-24]。推測(cè)Avenin-like type b可能是一類(lèi)具有α-淀粉酶抑制劑活性的貯藏蛋白。此前，Kneen等[25]在研究中也表明，小麥種子中確實(shí)存在具有α-淀粉酶抑制劑活性的蛋白。

此外，本研究將KY794919～KY794921基因連接至pEASY Blunt E1載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得分子量約50 kDa的融合蛋白，除去標(biāo)簽蛋白，基因編碼產(chǎn)物為 30 kDa，與所推導(dǎo)的蛋白分子量一致，表明克隆基因在原核表達(dá)體系中成功表達(dá)。通過(guò)純化誘導(dǎo)蛋白及摻粉試驗(yàn)，研究了該類(lèi)蛋白對(duì)品質(zhì)效應(yīng)的影響。從試驗(yàn)獲得的粉質(zhì)參數(shù)來(lái)看，該類(lèi)蛋白對(duì)小麥面粉流變學(xué)特性具有顯著影響。(1)形成時(shí)間是小麥面粉加水揉和至其稠度為最大值時(shí)所需的時(shí)間，它反映了面筋的質(zhì)量，時(shí)間越長(zhǎng)表明面筋質(zhì)量越高，KY794919～KY794921所誘導(dǎo)的新型Avenin-like type b蛋白的加入，顯著提高了小麥面筋質(zhì)量。(2)穩(wěn)定時(shí)間是粉質(zhì)曲線稠度值首次步入500 BU與首次離開(kāi)500 BU的時(shí)間差，它反映了面團(tuán)的韌性、穩(wěn)定性和耐揉程度，添加KY794919～KY794921誘導(dǎo)蛋白后，面團(tuán)的穩(wěn)定性、韌性、以及對(duì)機(jī)械剪切力的抵抗性顯著提高，這可能與該類(lèi)型蛋白二硫鍵位置及數(shù)目的保守性密切相關(guān)。(3)機(jī)械耐力指數(shù)是粉質(zhì)曲線峰稠度值與峰后5 min稠度值之差，數(shù)值越小表明面粉筋力越強(qiáng)，KY794919～KY794921誘導(dǎo)蛋白的加入使面團(tuán)對(duì)過(guò)度攪拌的耐受力顯著提高，顯著增強(qiáng)了面粉筋力。離線時(shí)間的延長(zhǎng)也反應(yīng)了這一特性。(4)及線時(shí)間是面粉由開(kāi)始加水揉和至稠度為500 BU經(jīng)歷的時(shí)間，其變化反映了面粉吸水量及面筋擴(kuò)展時(shí)間的變化，KY794920與KY794921誘導(dǎo)蛋白的加入均導(dǎo)致面粉吸水量減少、面筋擴(kuò)展時(shí)間縮短，但KY794919誘導(dǎo)蛋白的加入?yún)s截然相反。(5)帶寬是粉質(zhì)曲線的垂直寬度，帶寬越長(zhǎng)表明面筋彈性越大，外源蛋白KY794919～KY794921的加入均引起面筋彈性的顯著增強(qiáng)。(6)粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)衡量了小麥面團(tuán)的綜合質(zhì)量，該類(lèi)型蛋白的加入均引起面團(tuán)綜合質(zhì)量的顯著提高。從整體上看，KY794919～KY794921誘導(dǎo)蛋白對(duì)小麥面粉品質(zhì)具有顯著的正向效應(yīng)。而KY794919與KY794920、KY794921在品質(zhì)效應(yīng)上的差異，可能與其多余的Cys殘基有關(guān)，因?yàn)槎蜴I的形成與Cys的數(shù)目及位置的等有很大的相關(guān)性，形成分子內(nèi)及分子間二硫鍵有助于蛋白質(zhì)的空間聚合，有助于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的形成，進(jìn)而影響面筋的彈性、質(zhì)量及延展性等[26]。相比KY794920、KY794921而言，KY794919在品質(zhì)功能研究資源中更具有優(yōu)越性。

[1]SHEWRY P R,NAPIER J A,TATHAM A S.Seed storage proteins:Structures and biosynthesis [J].PlantCell,1995,7(7):945.

[2]SHEWRY P R,TATHAM A S,LAZZERI P.Biotechnology of wheat quality [J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,1997,73(4):397.

[3]DABRASZCYK B J,MORGENSTERN M P.Rheology and the breadmaking progress [J].JournalofCerealScience,2003,38(3):229.

[4]PAYNE P I.Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on break-making quality [J].AnnualReviewofPlantPhysiology,1987,38(1):141.

[5]MULLER S,WIESER H.Disulphide bonds of α-type gliadin [J].JournalofCerealScience,1995,22(5):21.

[6]MULLER S,WIESER H.The location of disulphide bonds in monomeric γ-gliadins [J].JournalofCerealScience,1997,26(2):169.

[7]TSEN C C,BUSHUK W.Changes in sulphydryl and disulphide contents of doughts during mixing under various conditions [J].CerealChemistry,1963,40:399.

[8]SHEWRY P R,HALFORD N G,BELTON P S,etal.The structure and properties of gluten:an elastic protein from wheat grain [J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyB,2002,357(1418):133.

[9]DE CARO S,FERRANTI S,ADDEO F,etal.Isolation and characterization of Avenin-like protein type-B from durum wheat [J].JournalofCerealScience,2010,52(4):426.

[10]KAN Y,WAN Y,BEAUDOIN F,etal.Transciptome analysis reveals differentially expressed storage protein transcripts in seeds ofAegilopsand wheat [J].JournalofCerealScience,2006,44(1):75.

[11]CHEN X Y,CAO X Y,ZHANG Y J,etal.Genetic characterization of cysteine-rich type-b avenin-like protein coding genes in common wheat [J].ScientificReports,2016,6:30692.

[12]CHEN P,WANG C D,LI K X,etal.Cloning,expression and characterization of novel avenin-like genes in wheat and related species [J].JournalofCerealScience,2008,48(3):734.

[13]CHEN P,LI R,ZHOU R,etal.Heterologous expression and dough mixing studies of a novel cysteine-rich avenin-like protein [J].CerealResearchCommunications,2010,38(3):406.

[14]MAMONE G,CARO S D,LUCCIA A D,etal.Proteomic-based analytical approach for the characterization of glutenin subunits in durum wheat [J].JournalofMassSpectrometry,2009,44(5):1709.

[15]STACEY J,ISAAC P G.Isolation of DNA from plants [J].MethodsinMolecularBiology,1994,28:9.

[16]GUO A Y,ZHU Q H,CHEN X,etal.GSDS:A gene structure display server [J].YiChuan,2007,29(8):1023.

[17]SHIMONI Y,GALILI G.Intramolecular disulfide bonds between conserved cysteines in wheat gliadins control their deposition into protein bodies [J].TheJournalofBiologicalChemistry,1996,271:18869.

[18]SHEWRY P R,POPINEAU Y,LAFIANDRA D,etal.Wheat glutenin subunits and dough elasticity:Findings of the EUROWHEAT project [J].TrendsinFoodScienceandTechnology,2001,11:433.

[19]MANU B T,RAO U J S P.Influence of size distribution of proteins,thiol and disulfide content in whole wheat flour on rheological and chapati texture of Indian wheat varieties [J].FoodChemistry,2008,110(1):88.

[20]TATHAM A S,SHEWRY P R.Elastomeric proteins:Biological roles,structures and mechanisms [J].TrendsinBiochemicalSciences,2000,25:567.

[21]YAMAGATA H,SUGIMOTO T,TANAKA K,etal.Biosynthesis of storage proteins in developing rice seeds [J].PlantPhysiology,1982,70(4):1094.

[22]MURASHITA T,KUBOTA T,KAMIKUBO Y,etal.Long-term results of aortic valve regurgitation after repair of ruptured sinus of valsalva aneurysm [J].AnnalsofThoracicSurgery,2002,73(5):1466.

[23]GARROW J S,SCOTT P F,HEELS S,etal.A study of starch blockers in man using13C-enriched starch as a tracer [J].HumanNutritionClinicalNutrition,1983,37(4):301.

[24]MAEDA K,KAKABAYASHI S,MATSUBARA H.Complete amino acid sequence of an alpha-amylase inhibitor in wheat kernel(0.19-inhibitor) [J].BiochimicaEtBiophysicaActa,1985,828(3):213.

[25]KNEEN E,SANDSTEDT R M.An amylase inhibitor from certain cereals [J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1943,65(6):1247.

[26]FLAETE N E S,UHLEN A K.Association between allelic variation at the combined Gli-1,Glu-3 loci and protein quality in common wheat(TriticumaestivumL.) [J].JournalofCerealScience,2003,37(2):129.

Cloning,FunctionalPredictionandQuality-RelatedAnalysisofNewAvenin-likeTypebGenesinWheat

ZHAODanyang，WANGWeidong，ZHANGJiacheng，MALingjian

(Agronomy College,Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)

To further clarify the functional properties of Avenin-like type b gene, this experiment took the wheat cultivar Xinong 188 as the material. The Avenin-like type b genes were cloned from the material with degenerate primers. The possible functional properties of the genes were discussed by making a homologously comparison, analyzing physicochemical properties and structural characteristics of their encoded protein, predicting subcellular localization, constructing the phylogenetic tree and analyzing the particular domain. In addition, they were expressed in prokaryocyte and their quality related function was analyzed. The result showed that there were four sequences cloned from Xinong 188,with the Genbank accession number KY794919-KY794922,of which, the base deletion in signal peptide region leads to a frameshift mutation of KY794922. The sequences of KY794919-KY794921 have high homology with Avenin-like type b families inHordeumvulgare,Aegilopscylindrica,BrachypodiumdistachyonandAegilopstauschii.Protein sequence analysis showed that the amino acid sequences encoded by Avenin-like type b genes,as well as the number and position of the cysteine,are more conserative.The Avenin-like type b protein has two typical AAI structural domains, and it may be for a class of protein with alpha amylase inhibitor activity. Subcellular localization showed that the protein may be transported to the extracellular by transport vesicles after processing for functional implementation. SDS-PAGE analysis showed that the prokaryotic expressioninvitroof KY794919-KY794921 is successful. The results of the expression products purification and supple mentation experiment showed that the proteins encoded by KY794919-KY794921 have significant positive effects on wheat flour quality, however, only the protein encoded by KY794919 can significantly increase water absorption of flour and prolong extension time of gluten, which indicating that KY794919 might be more advantageous in quality and function research resources.

Venin-like type b；Cloning； Functional prediction；Prokaryotic expression

時(shí)間：2017-10-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171009.1148.002.html

2017-03-05

2017-06-05

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD04B02)； “948”項(xiàng)目(K312021505)； 陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目(K3320215198)

E-mail：18220585649@163.com

馬翎健(E-mail:mlingjian@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)10-1265-11