鄭玉軍+王明吉+王雷+代璐璐+李顏君

【摘要】 目的 探討晚期肺癌患者外周血中淋巴細胞亞型表面程序性死亡受體1（PD-1）的表達水平。方法 30例晚期肺癌患者， 采用流式細胞儀檢測外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+T細胞（調(diào)節(jié)性T細胞， Tregs）及CD8+T細胞表面PD-1（CD8+CD279+T）百分比， 并與30例健康人的血液標本進行對比。結果 與健康人比較， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+T細胞水平有所降低， 但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；晚期肺癌患者CD8+T細胞水平為（27.70±12.87）%， CD8+CD279+T細胞水平為（2.03±1.35）%較健康人的（22.67±5.88）%、（1.26±0.83）%顯著升高， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；晚期肺癌患者CD4+CD25+T細胞數(shù)量（2.01±1.26）%顯著高于健康人（0.98±0.55）%， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 晚期肺癌外周血CD4+CD25+T細胞數(shù)量顯著高于健康人。

【關鍵詞】 晚期肺癌；外周血；淋巴細胞亞型百分比

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.26.008

【Abstract】 Objective To investigate the expression level of programmed peripheral death receptor-1 （PD-1） in peripheral blood lymphocyte subtype of patients with advanced lung cancer. Methods The percentage of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， CD4+CD25 + T cells （regulatory T cells， Tregs） and percentage of PD-1 （CD8+CD279+T） on CD8+T cells surface in peripheral blood of 30 patients with advanced lung cancer were detected by flow cytometry， and they were compared with 30 cases of healthy blood samples. Results Compared with healthy people， patients with advanced lung cancer had lower CD4+， CD4+/CD8+T cell level， but the difference was not statistical significant （P>0.05）. Patients with advanced lung cancer had higher CD8+T cell level as （27.70±12.87）% and CD8+CD279+T cell level as （2.03±1.35）% than （22.67±5.88）% and （1.26±0.83）% in healthy people， and the different was statistically significant （P<0.05）. Patients with advanced lung cancer had obviously higher number of CD4+CD25+T cell as （2.01±1.26）% than （0.98±0.55）% in healthy people ， and the different was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The number of CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients with advanced lung cancer is significantly higher than that of healthy people.

【Key words】 Advanced lung cancer； Peripheral blood； Percentage of lymphocyte subtype

肺癌已成為發(fā)病率和病死率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤， 晚期肺癌5年生存率僅有10%～15%。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫系統(tǒng)密切相關， 尤其是與免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關。盡管最近臨床發(fā)現(xiàn)應用阻斷細胞毒T淋巴細胞抗原4（CTLA4）[1]及PD-1[2]的抗體對轉移性腫瘤進行免疫治療， 可以獲得持久的緩解， 但針對免疫抑制狀態(tài)的治療有效率最高也只有20%左右。另外， 也有研究顯示， 肺癌基因突變負荷或聯(lián)合免疫標志物的檢測可能預測患者可能從PD-1的抑制中獲益[3， 4]， 本文根據(jù)白細胞表面抗原分化簇（clusters of differentiation， CD）， 以健康成年人作對照， 以期為肺癌提供進一步的預后及療效預測標志?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 因本院肺癌病例尚不充足， 故僅收集30例2014年8月～2016年8月在大連市友誼醫(yī)院住院治療的局部晚期或轉移性肺癌， 其中男16例， 女14例；年齡46～86歲， 中位年齡70歲；排除嚴重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。另選取同期來本院體檢的30例健康成年人作為對照， 年齡、性別均與肺癌患者匹配。對全部肺癌患者進行電話隨訪， 隨訪截止日期為2016年8月10日， 19例尚未出現(xiàn)事件， 無失訪者。

1. 2 腫瘤分期及分類 所有研究病例均經(jīng)纖維支氣管鏡、腫塊穿刺活檢及手術明確診斷為肺癌， 排除嚴重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。腫瘤分期根據(jù)纖維支氣管鏡、胸部CT、B超等檢查結果， 采用國際抗癌聯(lián)盟（international union against cancer， UICC）2010年肺癌第7版的TNM分期標準；病理類型采用2004年WHO肺癌病理分類。30例局部晚期不可手術及轉移性肺癌， 包括ⅢC期8例、Ⅳ期22例；鱗癌4例， 腺癌13例， 小細胞肺癌4例， 大細胞癌1例， 未知8例。對化療患者2 周期后再評估外周血細胞亞群（1例）。endprint

1. 3 測定方法

1. 3. 1 樣品收集 抗凝全血2 ml搖勻；取兩個1.5 ml EP管中分別加入100 μl全血， 其中一管作為NC對照不加抗體， 其余操作步驟一致；實驗管中加入細胞表面抗原抗體CD4、CD8、CD25、CD279后混勻， 室溫避光孵育20 min；加入1 ml 1×BD PharmLyse紅細胞裂解液， 稍微渦旋， 37℃溫箱避光孵育10 min裂解紅細胞；500×g離心6 min；棄去上清， 加入1 ml 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸細胞， 500×g離心5 min；棄去上清， 加入400 μl PBS重懸細胞。

1. 3. 2 T 細胞亞群檢測 按照流式細胞儀C6（BD）操作手冊開機， 調(diào)試儀器， NC對照圈取淋巴細胞群， 畫門P1收集至少6000個細胞；實驗管對比NC管圈取CD4（APC）陽性， SSC-APC CD4陽性門內(nèi)15000個細胞。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)± 標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

與健康人比較， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+T細胞水平有所降低， 但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；晚期肺癌患者CD8+T細胞水平為（27.70±12.87）%， CD8+CD279+T細胞水平為（2.03±1.35）%較健康人的（22.67±5.88）%、（1.26±0.83）%顯著升高， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；晚期肺癌患者CD4+CD25+T細胞數(shù)量（2.01±1.26）%顯著高于健康人（0.98±0.55）%， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

免疫系統(tǒng)利用復雜的正性及負性信號間的平衡保護機體免受外界干擾而預防自身免疫。這種平衡可被各種病理狀態(tài)打破， 導致免疫系統(tǒng)抑制而發(fā)生腫瘤[5]。眾所周知， 細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中起著主導作用， T淋巴細胞亞群是人體內(nèi)主要的細胞免疫系統(tǒng)， T淋巴細胞的數(shù)量與功能變化與腫瘤的發(fā)生、進展、擴散有一定的相關性[6]。本課題研究Tregs細胞與效應T細胞表面抑制性受體PD-1表達的相關性， 從而為今后靶向Tregs細胞的治療奠定基礎。本研究采用流式細胞術檢測了30例晚期肺癌患者的T淋巴細胞亞群狀態(tài)， 通過表1發(fā)現(xiàn)與健康人比較， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+水平有所降低， 但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 可能與病例數(shù)較少有關；同時， CD8+水平升高， 說明肺癌患者細胞免疫功能處于抑制狀態(tài)， 為病理形態(tài)的發(fā)生提供了免疫環(huán)境的條件。進一步證實上述基礎研究的結論， 認為效應T細胞衰竭是抑制性Treg細胞募集到腫瘤原發(fā)部位， 使效應T細胞表面抑制性受體表達， 導致效應T細胞消耗、細胞免疫衰竭， 使腫瘤細胞免疫逃逸。因此， 為臨床上去除Tregs或封閉其抑制功能可使腫瘤免疫恢復， 提供理論基礎[7-9]。對腫瘤患者免疫功能狀態(tài)的評估有助于判斷腫瘤的發(fā)展及預后， 雖不能直接反映機體抗腫瘤免疫效應， 但對于動態(tài)觀察腫瘤的生長轉移及預后有一定參考價值[10]。必須強調(diào)， 轉移性肺癌患者的免疫系統(tǒng)并不是一個惰性系統(tǒng)， 而是活躍的抑制系統(tǒng)。癌癥免疫治療必須克服負性調(diào)節(jié)機制， 目前最有效的免疫治療方法是選擇性地靶向限速環(huán)節(jié)。最近許多臨床結果一致認為免疫抑制在腫瘤微環(huán)境中起關鍵性作用。因此逆轉免疫抑制成為腫瘤免疫治療的熱點。

參考文獻

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[收稿日期：2017-07-17]endprint