羅 婭，俞 捷，楊雪峰，楊雪松，楊 靜，許 潔△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563099)

孕期和哺乳期暴露壬基酚對(duì)仔鼠肝臟細(xì)胞色素P450 2E1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響*

羅 婭1，俞 捷1，楊雪峰2，楊雪松1，楊 靜1，許 潔1△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563099)

壬基酚；孕期；哺乳期；肝臟；細(xì)胞色素P450

壬基酚(nonylphenol，NP)作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors，EEDs)的典型代表之一，主要應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)，其對(duì)環(huán)境的污染極為廣泛。NP的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌二醇相似，具有擬雌激素作用，可以通過不同途徑進(jìn)入機(jī)體，例如污染的水源、食物或經(jīng)皮膚吸收，還可以透過胎盤屏障、通過乳汁進(jìn)入下一代體內(nèi)，產(chǎn)生毒性作用[1-3]。細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是肝臟內(nèi)的主要代謝酶，參與體內(nèi)激素的合成、降解及外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化，在肝臟第一相反應(yīng)代謝過程的解毒功能中起關(guān)鍵作用。CYP450 2E1(CYP2E1)屬于CYP450基因家族，主要參與激素的調(diào)控，其在肝臟中的表達(dá)水平與肝臟內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化物的生成有顯著的相關(guān)性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，孕期和哺乳期暴露NP對(duì)仔鼠肝臟有脂質(zhì)過氧化損傷，但其影響機(jī)制尚未明確[4]。故本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)CYP2E1 mRNA的表達(dá)，并利用免疫組織化學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)CYP2E1蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討NP對(duì)肝臟的氧化損傷機(jī)制。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雌性SD大鼠80只，雄性大鼠40只，體質(zhì)量185 g左右，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005]。飼養(yǎng)條件：室溫22 ℃，自由飲水、進(jìn)食，每5天換墊料1次。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 R2245型組織石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica儀器公司)，BX53型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，RT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，DM 2500型圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica儀器公司)，恒溫培養(yǎng)箱HPX-9082MBE(上海博訊公司)，手持式勻漿機(jī)(上海弗魯克科技發(fā)展有限公司)，制冰機(jī)(常熟雪科電器有限公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 一抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，貨號(hào)：GB13044，武漢谷歌生物科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(貨號(hào)：K5007，丹麥DAKO公司)。CYP2E1和β-actin引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成(貨號(hào)：GENERAY，ID：140929 A25)。CYP2E1一抗(貨號(hào)：19937-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，NP灌胃試劑(成都西亞試劑有限公司)，玉米油。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌鼠和雄鼠以2∶1的比例合籠，發(fā)現(xiàn)陰栓的雌鼠定為妊娠0 d，依次收集交配成功的孕鼠。根據(jù)孕鼠妊娠日期分層后隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組(未進(jìn)行NP染毒)和低、中、高劑量染毒組(NP 50、100、200 mg·kg-1·d-1)，共64只受孕成功的母鼠，對(duì)照組和各染毒組每組16只，從受孕第6天到出生后21 d灌胃染毒NP。仔鼠出生后第90天，10%水合氯醛麻醉下處死，取血，檢測(cè)肝功能指標(biāo)，取肝臟，分為4個(gè)部分：(1)用10%多聚甲醛固定，觀察肝臟病理學(xué)變化并進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析；(2)放入冰上預(yù)冷的Trizol中，測(cè)定肝組織CYP2E1 mRNA水平；(3)直接放入冰存管測(cè)定肝組織勻漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平。

1.2.2仔鼠指標(biāo)觀測(cè) 從妊娠0 d開始記錄，稱量孕鼠體質(zhì)量，每周1次，并觀察孕鼠的一般健康狀況。仔鼠出生后，每周稱體質(zhì)量，記錄仔鼠的一般生長(zhǎng)情況。

1.2.3主要觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.2.3.1肝功能指標(biāo)測(cè)定 腹主動(dòng)脈結(jié)扎后取血，3 000 r/min離心，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟按丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測(cè)說明書操作完成。

1.2.3.2血脂檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，檢測(cè)方法為免疫比濁法，按試劑盒說明書操作完成。

1.2.3.3肝臟形態(tài)學(xué)檢查 取各組仔鼠肝臟相同部位以10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝臟的病理變化。

1.2.3.4肝臟SOD、GSH-PX活性及MDA水平測(cè)定 冰上制作肝臟勻漿，按試劑盒方法測(cè)定。

1.2.3.5免疫組織化學(xué)法 仔鼠肝組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5次，除去多聚甲醛，透明、石蠟包埋、切片，行抗原修復(fù)，孵育，PBS洗4次，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，滴加一抗、二抗，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水、樹膠封片，最后顯微鏡鏡檢，進(jìn)行圖像采集分析。

1.2.3.6RT-PCR法檢測(cè)CYP2E1 mRNA表達(dá) 用Trizol-酚-氯仿一步法提取肝組織總RNA，測(cè)定RNA總純度：260 nm與280 nm處吸光度值比值(A260/A280)在1.8～2.0之間，表明純度滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反轉(zhuǎn)錄的cDNA 4 ℃保存。引物設(shè)計(jì)及合成由上海捷瑞生物工程限公司完成，以β-actin作為內(nèi)參。循環(huán)條件：95 ℃ 2 min變性，95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min延伸。收集熒光信號(hào)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換得到各樣品的拷貝數(shù)(Ct值)，以Ct值的均數(shù)反映目的基因的表達(dá)，引物序列見表1。

1.2.3.7Western blot檢測(cè)CYP2E1蛋白的表達(dá) 提取蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白水平，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，稀釋一抗[TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%牛血清清蛋白(BSA)]，4 ℃孵育過夜，二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min，洗滌，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法曝光、顯影，凝膠成像儀掃描，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達(dá)水平作為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1肝功能指標(biāo)變化 各染毒組仔鼠血清ALT、AST水平及AST/ALT比值均升高，且隨染毒劑量的增加呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組肝功指標(biāo)比較

*：P<0.05，對(duì)照組比較

2.2大鼠血脂變化 各染毒組仔鼠血清TG、TC、LDL-C水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而血清HDL-C水平與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組血脂水平比較

*：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.3大鼠肝臟病理變化 肝組織切片鏡下顯示：對(duì)照組仔鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，低劑量染毒組仔鼠肝竇輕度擴(kuò)張，中劑量染毒組仔鼠肝臟輕度炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)和少量小脂滴，高劑量染毒組仔鼠肝臟中度炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)和大量脂滴，見圖1。

A：對(duì)照組；B：低劑量染毒組；C：中劑量染毒組；D：高劑量染毒組

圖1各組仔鼠肝組織HE染色(×200)

2.4大鼠肝組織SOD、GSH-PX活性及MDA水平 各染毒組大鼠肝組織勻漿中SOD、GSH-PX活性明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中、高劑量染毒組MDA水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組肝組織SOD、GSH-PX活力及MDA水平比較

*：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.5仔鼠肝臟CYP2E1 mRNA表達(dá) RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：低劑量染毒組肝臟CYP2E1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量染毒組與對(duì)照組比較，CYP2E1 mRNA表達(dá)水平均增加(P<0.05)，見表5。

2.6仔鼠肝臟CYP2E1蛋白表達(dá) 肝臟組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃色顆粒為CYP2E1陽(yáng)性表達(dá)。各染毒組與對(duì)照組比較，肝組織中央靜脈周圍均有CYP2E1沉積，見圖2；各染毒組A值與對(duì)照組比較均增加(P<0.05)，見表5。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：中、高劑量染毒組CYP2E1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組高，見圖3；灰度值見表5。

表5 各組肝組織CYP2E1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、灰度值及A值(n=5)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較

A：對(duì)照組；B：低劑量染毒組；C：中劑量染毒組；D：高劑量染毒組

圖2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組仔鼠肝臟CYP2E1表達(dá)(×200)

C：對(duì)照組；L：低劑量染毒組；M：中劑量染毒組；H：高劑量染毒組

圖3 Western blot檢測(cè)各組仔鼠CYP2E1蛋白表達(dá)

3 討 論

肝臟作為人體的重要組織器官，參與機(jī)體的代謝、解毒、排泄、凝血、合成血脂等多種生理功能。AST和ALT是肝臟損傷診斷中重要的檢測(cè)指標(biāo)，肝臟損傷嚴(yán)重與否在很大程度上決定了血脂水平和載脂蛋白水平[5]。本研究中，各染毒組仔鼠血清ALT、AST水平及AST/ALT比值與對(duì)照組比較均升高；病理結(jié)果顯示染毒組肝臟較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中、高劑量染毒組有大小不一的脂滴存在；血脂檢測(cè)結(jié)果顯示各染毒組血清TG、TC和LDL-C水平高于對(duì)照組。說明NP透過胎盤屏障或者通過乳汁進(jìn)入到仔鼠體內(nèi)，并在肝臟中蓄積，推測(cè)孕期和哺乳期暴露NP可能是導(dǎo)致仔鼠肝臟血清酶升高和血脂異常的原因之一。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，也稱為自由基清除劑，它可以對(duì)抗、阻斷自由基對(duì)各種細(xì)胞的損傷，及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。而GSH-PX為生物體內(nèi)廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，可以使由活性氧和羥基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能的完整性。因此，SOD和GSH-PX構(gòu)成了生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)[6]。MDA是大量高活性自由基作用于脂質(zhì)，發(fā)生過氧化反應(yīng)而生成的過氧化終產(chǎn)物，可引起大蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，MDA水平反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷程度[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗氧化指標(biāo)SOD和GSH-PX活性降低，氧化終產(chǎn)物MDA水平增加，提示仔鼠肝細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-PX消耗增加，活性降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，與本課題組前期研究結(jié)果相同，也與本次病理切片顯示的結(jié)果一致：對(duì)照組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，低劑量染毒組仔鼠肝竇輕度擴(kuò)張，中劑量染毒組仔鼠肝臟輕度炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，高劑量染毒組仔鼠肝臟中度炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，并有脂滴存在，說明染毒組仔鼠肝臟發(fā)生了脂質(zhì)代謝紊亂和炎性損傷。

CYP450在肝臟中最豐富，參與廣泛的內(nèi)外源性化合物的合成代謝，可被多種內(nèi)外源化合物誘導(dǎo)和抑制，從而影響其對(duì)特異性底物的催化作用[9]。目前人類確定的CYP450 同工酶有20多種，CYP2E1是最主要的同工酶，在肝臟中占肝細(xì)胞色素酶總量的7%，參與許多低分子有機(jī)化合物及藥物的體內(nèi)代謝，并能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程[10-11]。CYP2E1可引起許多毒物的代謝和激活，催化產(chǎn)生活性氧(ROS)，如超氧陰離子基團(tuán)和過氧化氫等，與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[12]。由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過多的ROS會(huì)增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化程度，從而損傷細(xì)胞生物膜功能，并通過協(xié)同細(xì)胞因子及肝細(xì)胞凋亡使肝細(xì)胞產(chǎn)生炎癥、壞死，肝纖維化加重。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝細(xì)胞內(nèi)CYP2E1表達(dá)增加是ROS產(chǎn)生的主要原因[13-14]。

綜上所述，母鼠孕期和哺乳期暴露NP，其仔鼠肝臟過氧化損傷程度隨染毒劑量增加而加重，且中、高劑量染毒組CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)，說明CYP2E1參與了肝臟脂質(zhì)過氧化損傷，其上調(diào)可能會(huì)進(jìn)一步加劇肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。

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EffectsofnonyphenolexposureduringpregnantandlactationperiodonexpressionsofCYP2E1mRNAandproteinofhepatictissuesinoffspringrats*

LuoYa1，YuJie1，YangXuefeng2，YangXuesong1，YangJing1，XuJie1△

(1.SchoolofPublicHealth,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563099,China；2.DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563099,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of nonyphenol (NP)exposure during pregnant and lactation period on expression of cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) mRNA and protein of hepatic tissues in offspring rats.MethodsPregnant rats were assigned to four groups:the exposure groups received gavage with NP at dose levels of 50 mg·kg-1·d-1(low dose group),100 mg·kg-1·d-1(medium dose group),200 mg·kg-1·d-1(high dose group) and the control group was treated with corn oil alone,NP exposure time was limited from gestational day 6 to postnatal day 21.The newborn rats were sacrificed at 90 days after birth,followed by blood collection and serum separation.Then,serum biochemical indicators of liver function and lipid levels were detected.Glutathione peroxidase (GSH-PX),superoxide dismutase (SOD) activities,malondialdehyde (MDA) level and CYP2E1 mRNA and protein levels were determined in hepatic tissues.Pathologic changes in hepatic tissues were observed with HE staining.ResultsCompared with the control group,the aspartate aminotransferase (ALT),alanine aminotransferase (AST) levels and AST/ALT ratio of offspring rats in exposure groups were increased in a dose-dependent manner (P<0.05),as well as serum TG,TC and LDL-C levels were increased (P<0.05).The liver tissue structure of the control group was normal.The hepatic sinus of the medium dose group was showed mild expansion and inflammatory cellular infiltration.Otherwise,the liver of high dose group had a large amount of lipid droplets.Compared with the control group,SOD and GSH-PX activities were obviously decreased,while MDA level was significantly decreased in each exposure group (P<0.05).CYP2E1 mRNA and protein expression levels of medium and high dose groups were higher than those in the control group (P<0.05).ConclusionExposure to NP during gestation and lactation period can induce lipid metabolism disorders and inflammatory lesions in hepatic tissues of offspring rats,and it maybe associated with up-regulation of CYP2E1 expression.

nonylphenol；gestation period；suckling period；liver；cytochrome P450

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360439，81560527)；貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7543，[2015]7521號(hào)，黔科合J字[2014]2177號(hào)，[2014]2185號(hào))；貴州省優(yōu)秀青年科技人才([2017]5612)；貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金 (gzwjkj2016-1-045，gzwjkj2017-1-053)；遵義醫(yī)學(xué)院碩士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(F-835)；遵義醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)基金資助項(xiàng)目(2015)。

羅婭(1983-)，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事預(yù)防醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:xujie60@sina.com。

目的探討孕期和哺乳期暴露壬基酚(NP)對(duì)仔鼠肝臟細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)mRNA和蛋白表達(dá)的影響。方法將孕鼠分為低、中、高劑量染毒組(分別給予50、100、200 mg·kg-1·d-1NP染毒)和對(duì)照組，孕鼠受孕第6天到仔鼠出生21 d灌胃染毒NP。仔鼠出生90 d后處死，檢測(cè)血清肝功能指標(biāo)及血脂水平，觀察肝臟病理學(xué)變化，測(cè)定肝組織谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平，檢測(cè)CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，各染毒組仔鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平及AST/ALT比值均升高(P<0.05)，且隨染毒劑量的增加呈上升趨勢(shì)；血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平均較對(duì)照組升高(P<0.05)。對(duì)照組仔鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，低劑量染毒組仔鼠肝臟肝竇輕度擴(kuò)張，中劑量染毒組仔鼠肝臟有輕度炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，高劑量染毒組仔鼠肝臟有大量脂滴存在。各染毒組仔鼠肝組織SOD、GSH-PX活性明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，MDA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。中、高劑量染毒組與對(duì)照組比較CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。結(jié)論孕期和哺乳期暴露NP，可致仔鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂及炎性損傷，可能與肝臟CYP2E1表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

R114

A

1671-8348(2017)29-4036-04

2017-03-21

2017-06-19)