趙日紅，白紀紅，劉 曼，黃 艷

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.新生兒科；2.研究生科；3.教學管理部，廣西桂林 541000)

重組人紅細胞生成素對新型支氣管肺發(fā)育不良早產(chǎn)鼠模型血管內皮生長因子表達的影響

趙日紅1，白紀紅2△，劉 曼1，黃 艷3

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.新生兒科；2.研究生科；3.教學管理部，廣西桂林 541000)

支氣管肺發(fā)育不良；紅細胞生成素，重組；血管內皮生長因子

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產(chǎn)兒的一種嚴重慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其病死率及致殘率極高，是威脅早產(chǎn)兒健康和生命的重要疾病之一，目前其發(fā)病機制尚不清楚。研究表明，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相關信號通路的異常在其發(fā)病過程中起著重要的作用[1]。根據(jù)文獻報道及課題組前期研究，發(fā)現(xiàn)重組人紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)對新型BPD大鼠模型具有保護作用[2-4]；而紅細胞生成素(EPO)也可刺激血管內皮細胞增殖和血管形成，二者能以協(xié)同作用發(fā)揮血管效應[5-6]。本實驗通過觀察rhEPO對新型BPD早產(chǎn)鼠模型肺組織中VEGF表達的影響，初步探討B(tài)PD的發(fā)生、發(fā)展與VEGF的關系，并為rhEPO的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SD雌鼠60只(體質量220～250 g)，SD雄鼠20只(體質量250～300 g)，均由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格證號：SCXK桂2007-0001)。雌雄鼠按3∶1合籠交配，次日清晨觀察雌鼠孕栓或取雌鼠陰道分泌物涂片，鏡檢見精子，當日記為妊娠第1天。

1.1.2主要藥物與試劑 脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；rhEPO(協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社)；VEGF反轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；β-actin、VEGF引物(美國Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及分組[3-4]孕鼠隨機分為兩組，磷酸鹽緩沖液(PBS)組和LPS組，于孕第15天(70%胎齡)給予10%水合氯醛(0.3 m/kg)腹腔麻醉后，打開孕鼠腹腔，LPS組用微量加樣器將LPS(30 ng/mL)注射于孕囊內，每個孕囊5 μL；PBS組注入等量PBS。于孕21 d(孕產(chǎn)期為22 d)將早產(chǎn)鼠剖宮娩出，對所有早產(chǎn)鼠進行編號。并于生后6 h內再將所有早產(chǎn)鼠分為以下5組：(1)PBS+空氣組，47只；(2)PBS+高氧組，47只；(3)PBS+高氧+rhEPO組，48只；(4)LPS+高氧組，71只；(5)LPS+高氧+rhEPO組，70只。其中每組取14只早產(chǎn)鼠用于生存分析觀察，其余早產(chǎn)鼠用于其他指標檢測。

1.2.2高氧干預 將早產(chǎn)鼠于出生6 h內連同母鼠及鼠籠一同置于氧箱內，氧濃度維持在60%，氧濃度每天定時監(jiān)測4次，氧箱內放置鈉石灰吸收二氧化碳，無水氯化鈣吸收水分。每天定時開箱2 h，更換墊料、鈉石灰和無水氯化鈣，同時添加飼料和水?？諝饨M早產(chǎn)大鼠與母鼠置于空氣中飼養(yǎng)。

1.2.3rhEPO干預 各rhEPO干預組早產(chǎn)大鼠于高氧暴露6 h后開始第1次背部皮下注射rhEPO，劑量1 200 IU/kg，隔天1次，共7次。

1.2.4肺組織標本的處理 將上述5組早產(chǎn)鼠均于生后1、7、14 d分別抽取8只，以5%水合氯醛進行腹腔注射(0.6 mL/100 mg)麻醉。打開胸腔，暴露心肺，分離雙肺，電子天平上稱質量；做肺組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察肺組織病理變化；收集其余肺組織，置于RNase的Eppendorf管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質印跡法(Western blot)和RT-PCR檢測肺組織VEGF表達水平。

1.2.5生存分析 每組大鼠生存率估計使用Kaplan-Meier法，因實驗需要處死大鼠，按結尾數(shù)據(jù)處理。以生存時間為橫坐標，日生存率為縱坐標，作生存曲線。

1.2.6肺組織病理觀察 肺組織切片經(jīng)HE染色，具體流程：脫蠟、水化、染色、封片，光學顯微鏡下觀察，每組各時間點分別選取不同的動物組織切片2張，每張切片于光鏡下(×200)觀察5個視野，進行肺形態(tài)結構觀察。

1.2.7Western blot檢測肺組織VEGF蛋白表達水平 各組分別提取肺組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白質定量，再采用Western blot檢測肺組織VEGF蛋白表達水平，在暗室中進行化學發(fā)光，膠片曝光顯影后分析結果。以目的蛋白與β-actin的灰度比值表示蛋白相對表達水平。

1.2.8RT-PCR檢測肺組織VEGF mRNA表達水平 嚴格按試劑盒步驟操作提取肺組織總RNA，反轉錄成cDNA，PCR擴增。擴增VEGF引物序列：上游5′-GCT CTC TTG GGT GCA CTG GA-3′，下游5′-CAC GCC TTG GCT TGT CAC A-3′；內參β-actin引物序列：上游5′-GGA TTC CTA TGT GGG GGA CG-3′，下游5′-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG-3′。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。得到的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，JS-780全自動凝膠成像分析儀凝膠成像(上海培清科技公司)，通過SensiAnsys凝膠圖像分析軟件(上海培清科技公司)讀取產(chǎn)物電泳條帶的吸光度掃描值，將VEGF條帶與內參照β-actin條帶吸光度掃描值的比值作為VEGF相對表達水平。

2 結 果

2.1各組早產(chǎn)鼠生存分析 各組生存率分別為：PBS+空氣組92.9%，PBS+高氧組64.3%，LPS+高氧組42.9%，PBS+高氧+rhEPO組85.7%，LPS+高氧+rhEPO組57.1%，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)，見圖1。

圖1 各組早產(chǎn)鼠生存曲線

2.2各組早產(chǎn)鼠體質量、肺質量及肺質量/體質量比值的變化 與PBS+空氣組比較：PBS+高氧組在生后14 d體質量減輕，肺質量增加(P<0.05);LPS+高氧組在生后1、7、14 d體質量減輕，生后7、14 d肺質量增加(P<0.05)；經(jīng)rhEPO干預后體質量及肺質量變化有所改善，尤其以生后14 d明顯改善(P<0.05)。隨著日齡的變化肺質量/體質量比值也有明顯的降低趨勢，PBS+高氧組和LPS+高氧組在生后1 d和7 d降低，但在生后14 d比值增加，經(jīng)rhEPO干預后肺質量/體質量比值的變化有所改善，尤其以生后14 d明顯，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3肺組織病理形態(tài)學改變 PBS+空氣組肺泡結構正常，肺泡間隔無水腫、炎癥及纖維組織增生，肺泡腔無明顯滲出，隨日齡的增加，肺泡漸規(guī)整，大小趨向均一，終末氣腔變小，數(shù)量增多，進行性肺泡化。PBS+高氧組和LPS+高氧組早期肺血管增生明顯，肺間質水腫，炎性細胞浸潤；隨著高氧暴露時間延長，肺組織正常結構局灶性破壞，局部肺結構紊亂，肺間隔加寬，小灶或多灶狀實變，小肺泡數(shù)量更少，肺間質出現(xiàn)少量膠原沉積。上述變化以LPS+高氧組出現(xiàn)更早且更嚴重。PBS+高氧+rhEPO組和LPS+高氧+rhEPO組上述改變明顯減輕，肺組織炎性滲出減少、結構紊亂及肺泡化程度均有所改善，見圖2。

2.4Western blot檢測各組早產(chǎn)鼠肺組織VEGF蛋白表達水平 隨日齡增加，PBS+空氣組VEGF蛋白表達水平呈增加趨勢，PBS+高氧組和LPS+高氧組出現(xiàn)先升后降的趨勢。與PBS+空氣組比較，在生后7、14 d，PBS+高氧組和LPS+高氧組VEGF蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)；PBS+高氧+rhEPO組與PBS+高氧組比較及LPS+高氧+rhEPO組與LPS+高氧組比較，均在生后7 d和14 d VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，見表2、圖3。

表1 不同時間點各組早產(chǎn)鼠體質量、肺質量和肺質量/體質量比值比較

*：P<0.05，與PBS+空氣組比較；#：P<0.05，與PBS+高氧組比較；△：P<0.05，與LPS+高氧組比較

A:PBS+空氣組； B：PBS+高氧組；C：LPS+高氧組；D：PBS+高氧+rhEPO組；E：LPS+高氧+rhEPO組

圖2各組早產(chǎn)鼠生后14 d肺組織病理學形態(tài)(HE染色，×200)

表2 不同時間點各組早產(chǎn)鼠肺組織VEGF蛋白表達水平比較

*：P<0.05，與PBS+空氣組比較；#：P<0.05，與PBS+高氧組比較；△：P<0.05，與LPS+高氧組比較

1：PBS+空氣組； 2：PBS+高氧組；3：LPS+高氧組；4：PBS+高氧+rhEPO組；5：LPS+高氧+rhEPO組

圖3 Western blot檢測各組大鼠肺組織VEGF蛋白表達水平

表3 不同時間點各組早產(chǎn)鼠肺組織VEGF mRNA表達水平比較

*：P<0.05，與PBS+空氣組比較；#：P<0.05，與PBS+高氧組比較；△：P<0.05，與LPS+高氧組比較

2.5RT-PCR檢測肺組織VEGF mRNA表達水平 隨日齡增加，PBS+空氣組VEGF mRNA表達水平呈增加趨勢，PBS+高氧組和LPS+高氧組出現(xiàn)先升后降的趨勢。PBS+高氧組與PBS+空氣組VEGF mRNA表達水平在生后7、14 d比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與PBS+空氣組比較，LPS+高氧組在1、7、14 d VEGF mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)；PBS+高氧+rhEPO組與PBS+高氧組比較及LPS+高氧+rhEPO組與LPS+高氧組比較，均在生后7、14 d VEGF mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

3 討 論

隨著新生兒重癥監(jiān)護技術的改進，以及機械通氣和肺泡表面活性物質等的應用，早產(chǎn)兒及極低體質量兒的存活率有了明顯提高，BPD的發(fā)生率亦在逐漸上升，成為嬰兒期最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，并可增加成年后患肺部及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的概率[7]。目前認為宮內感染、早產(chǎn)、長時間吸氧及機械通氣等是BPD的主要危險因素[8]。因此，課題組前期應用孕囊內注射LPS，于孕21 d(孕產(chǎn)期為22 d)剖宮娩出，并用60%的高氧干預，模擬宮內感染及生后高氧暴露建立新型BPD模型，并在此基礎上做進一步的實驗研究，取得良好的效果[3-4]。本實驗結果顯示：高氧損傷及LPS+高氧損傷明顯降低了早產(chǎn)鼠的生存率(分別為64.3%和42.9%)，病理損傷明顯加重，并且以LPS+高氧損傷更為明顯；經(jīng)rhEPO干預后生存率有所提高(分別為85.7%和57.1%)，病理損傷減輕。與PBS+空氣組比較，PBS+高氧組和LPS+高氧組體質量減輕、肺質量增加(P<0.05)；經(jīng)rhEPO干預后體質量及肺質量變化有所改善，尤其以生后14 d明顯(P<0.05)。隨著日齡的變化肺質量/體質量比值也有明顯的降低趨勢，PBS+高氧組和LPS+高氧組在生后1、7 d降低，但在生后14 d比值增加，經(jīng)rhEPO干預后肺質量/體質量比值的變化有所改善，尤其以生后14 d明顯，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果表明rhEPO能有效改善BPD模型大鼠肺組織損傷及整體變化。

肺是表達VEGF最為豐富的臟器之一。VEGF是誘導肺血管發(fā)生的重要因子，作用于血管內皮細胞的有絲分裂原，通過受體介導，對內皮細胞起著遷徙、生存、增殖和分化的作用，在整個胚胎期、胎兒期和出生后肺血管生長與維持中起著至關重要的作用，在建立正常的肺形態(tài)和功能中發(fā)揮重要作用，參與了新生兒高氧肺損傷的發(fā)生[9-10]。

rhEPO受體在多個器官都有表達，肺是其靶器官之一，有抗凋亡、抗炎、抗氧化，以及促進血管生成等多重作用，已成為BPD防治研究的熱點之一[2，11]。EPO可刺激血管內皮細胞增殖和血管形成[5，12]。EPO刺激血管形成作用與其促進骨髓內皮前體細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移動，歸巢至缺血組織有關[13]。EPO能與VEGF協(xié)同作用發(fā)揮血管效應[6]。因此，在課題組前期研究的基礎上，觀察rhEPO對新型BPD早產(chǎn)鼠模型肺組織中VEGF表達的影響。結果顯示：隨日齡增加，肺組織VEGF蛋白及mRNA的表達水平均呈增加趨勢；經(jīng)高氧和LPS+高氧干預后，與PBS+空氣組比較表達水平均明顯降低(P<0.05)；經(jīng)rhEPO干預后，在生后7、14 d VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。肺組織VEGF mRNA表達水平與其蛋白表達水平有相應的趨勢。

綜上所述，VEGF在新生鼠肺發(fā)育過程中起著重要的作用。高氧、宮內感染及早產(chǎn)可導致早產(chǎn)鼠肺組織中VEGF蛋白及mRNA表達下降，其表達的減少參與肺損傷的過程。rhEPO可能通過參與或調節(jié)VEGF的表達，從而對新型BPD大鼠模型發(fā)揮保護作用，減輕肺損傷、提高生存率。

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Effectsofrecombinanthumanerythropoietinontheexpressionofvascularendothelialgrowthfactorinprematureratmodelofthenewtypebronchopulmonarydysplasia*

ZhaoRihong1，BaiJihong2△，LiuMan1，Huangyan3

(1.DepartmentofNeonatology；2.GraduateStudentOffice；3.DepartmentofTeachingManagement,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of recombinant human erythropoietin (rhEPO) on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein and mRNA in lung tissue of premature rat model of the new type bronchopulmonary dysplasia (BPD).MethodsLipopolysaccharide (LPS) or PBS was injected into 60 pregnant rats on the 15th day of gestation.The premature rats by cesarean delivery on the 21th day of gestation were divided into 5 groups:PBS+air group,PBS+hyperoxia group,LPS+hyperoxia group,PBS+hyperoxia+rhEPO group,LPS+hyperoxia+rhEPO group.In rhEPO intervention groups,after 6 h exposure to hyperoxia,rhEPO (1 200 IU/kg) was administrated subcutaneously,once every other day for 7 times.The survival rate,body weight,lung weight and lung weight/body weight ratio and pathological changes of lung tissue were observed,the expression levels of VEGF protein and mRNA in the lung tissue were determined by Western blot and RT-PCR at the 1st,7th and 14th day after hyperoxia exposure.ResultsCompared with the PBS+air group,the survival rate and body weight were decreased,the lung weight was increased,the lung pathological damages were more serious,the expression levels of VEGF protein and mRNA in lung tissue were decreased after hyperoxia exposure.These changes were more notable in the LPS+hyperoxia group (P<0.05).The lung weight/body weight ratio showed an increasing tendency (P>0.05).The above indexes were improved after rhEPO intervention (P<0.05).ConclusionrhEPO could increase the survival rate and produce certain intervention and treatment effects by regulating the VEGF relative pathway in BPD model rats.

bronchopulmonary dysplasia；erythropoietin，recombinant；vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.003

廣西高?？茖W技術研究基金資助項目(KY2015LX254)；廣西自然科學基金資助項目(2014GXNSFAA118152)。

趙日紅(1978-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事兒科及新生兒相關疾病的基礎與臨床研究?！?/p>

，E-mail:bjhemail@163.com。

目的觀察重組人紅細胞生成素(rhEPO)對新型支氣管肺發(fā)育不良(BPD)早產(chǎn)鼠模型肺組織血管內皮生長因子(VEGF)蛋白及mRNA表達的影響。方法60只定期受孕SD大鼠于孕第15天孕囊內注射脂多糖(LPS)或磷酸鹽緩沖液(PBS)，孕第21天剖宮娩出早產(chǎn)鼠，早產(chǎn)鼠于生后6 h內分為5組：PBS+空氣組、PBS+高氧組、LPS+高氧組、PBS+高氧+rhEPO組、LPS+高氧+rhEPO組。rhEPO(1 200 IU/kg)干預組于高氧暴露6 h后開始第1次背部皮下注射，隔天1次，共7次。分別在高氧暴露第1、7、14天處死早產(chǎn)鼠，觀察各組生存率、體質量、肺質量并計算肺質量/體質量比值，觀察肺組織病理變化，采用蛋白質印跡法(Western blot)和反轉錄PCR(RT-PCR)法檢測肺組織VEGF蛋白及 mRNA表達水平。結果與PBS+空氣組比較，經(jīng)高氧干預后早產(chǎn)鼠生存率降低、體質量減輕、肺質量增加，病理損傷加重，肺組織VEGF蛋白及mRNA表達水平降低，并且以LPS+高氧組更明顯(P<0.05)，肺質量/體質量比值增加(P>0.05)；rhEPO干預后上述指標得到相應改善(P<0.05)。結論rhEPO可能通過參與調解VEGF相關通路，對BPD模型早產(chǎn)鼠起到一定的干預和治療作用，提高了生存率。

R722.6

A

1671-8348(2017)29-4040-04

2017-03-19

2017-06-17)