1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 （廣東 汕頭 515041）

2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科 （廣東 深圳 518036）

楊莉麗1,2 王成文2 鄒 傲2

高通量測序分析腸易激綜合征患者和健康人腸道菌群差異*

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 （廣東 汕頭 515041）

2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科 （廣東 深圳 518036）

楊莉麗1,2王成文2鄒 傲2

目的通過高通量測序方法分析腸易激綜合征患者(Irritable Bowel Syndrome,IBS)和健康人腸道菌群差異。方法采用Illumima系統(tǒng)MiSeq平臺(tái)對(duì)正常組和IBS組糞便進(jìn)行16S rRNA測序。結(jié)果IBS患者的腸道菌群多樣性無顯著變化。在門水平上，F(xiàn)irmicutes豐度顯著增加(P＜0.01)，Bacteroidete的豐度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值下降。在科水平上，正常組和IBS組糞便腸道菌群中檢測到Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae和Fibrobacteraceae，且豐度變化具有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論IBS患者和健康人相比，腸道菌群多樣性未見明顯差異。但某些細(xì)菌菌種存在顯著差異。

腸易激綜合征；腸道菌群；高通量測序；16S rRNA

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一組以腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和糞便性狀改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，癥狀可持續(xù)存在或間歇發(fā)作，是最常見的腸道功能紊亂性疾病[1]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)IBS患者存在腸道菌群的變化，并認(rèn)為IBS的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群變化有關(guān)。本文通過高通量測序細(xì)菌16SrRNA基因序列技術(shù)對(duì)IBS患者腸道菌群分布進(jìn)行分析并觀察其變化情況。

1 資料和方法

1.1 對(duì)象2015年10月至2016年10月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化科門診就診的IBS患者10例，采用羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，排除消化道器質(zhì)性病變。其中男5例，女5例，年齡18～61歲。正常組為10例北京大學(xué)深圳醫(yī)院體檢健康者。全部病例無畏寒發(fā)熱史、胃腸道手術(shù)史，無慢性小腸或結(jié)腸感染史、慢性肝病、糖尿病、甲亢病史，近3月來未使用過抗生素。

1.2 方法

1.2.1 腸道菌群DNA的提?。菏褂脽o菌的離心管收集糞便樣本50g，并用腸道菌群細(xì)菌基因組提取試劑盒提取制備糞便樣本中微生物總DNA，具體方法按說明書進(jìn)行。

1.2.2 16S rDNA的擴(kuò)增與測序：用分光光度計(jì)對(duì)提取的全基因組DNA進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA的V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃變性，30s；50℃退火，30s；72℃延伸，30s。引物為：正向5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'，反向5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'，PCR產(chǎn)物經(jīng)均一化處理后建庫，PCR體系為25μL，測序平臺(tái)為Illumima系統(tǒng)MiSeq。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS16.0軟件對(duì)菌群多樣性進(jìn)行t檢驗(yàn)，使用mothur軟件中metastats命令進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 16S rRNA基因測序分析對(duì)測序后的結(jié)果進(jìn)行分析，正常組和IBS組的有效序列分別為(67246±19467)和(55564±9892)，優(yōu)化后分別得到(67457±19497)和(55742±9888)條優(yōu)質(zhì)序列。在相似度為97%條件下，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行操作單元聚類，共獲得47656個(gè)OTU代表序列，其中綱水平4763個(gè)，科水平47038個(gè)，屬水平46201個(gè)。經(jīng)繪制Observed species指數(shù)稀釋曲線、Chao指數(shù)稀釋曲線，大部分測序的樣品接近平臺(tái)期。分析兩組樣品的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們的覆蓋率均＞97%(P＞0.05)，表示測序深度已基本覆蓋到糞便樣本中絕大多數(shù)物種，見表1。

表1 正常組和IBS組測得的序列數(shù)及覆蓋率

表2 FPE作用前后腸道菌科水平變化

表2 FPE作用前后腸道菌科水平變化

科水平 正常組 IBS組 P值Cryomorphaceae 0.06±0.05 0.01±0.01 0.00 Erysipelotrichaceae 0.04±0.02 0.01±0.01 0.02 Campylobacteraceae 0.06±0.05 0.01±0.01 0.00 Fibrobacteraceae 0.07±0.07 0.01±0.02 0.00

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析對(duì)測序序列與16S rDNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本中細(xì)菌絕大多數(shù)由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria組成，正常組和IBS組Firmicutes序列分別為30467條和39850條，占總菌的比例為67%和73%；Bacteroidetes序列分別為7675條和6203條，占總菌的比例為18%和13%；Proteobacteria序列分別為5462條和6492條，占總菌的比例為11%和13%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)與正常組相比，IBS組樣品的Firmicutes豐度顯著增加(P＜0.01)，Bacteroidete的豐度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值也明顯下降(P＞0.01)，見圖1。

對(duì)高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)一步深入分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組和IBS組腸道菌群主要的科均為Alcaligenaceae、Lachnospiraceae、Rikenellaceae和Ruminococcaceae，分別占總數(shù)的8.5%、41.1.1%、8.1%、23.8%和8.1%、42.4%、7.0%、25.1%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)正常組和IBS組有4個(gè)科Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae、和Fibrobacteraceae的豐度發(fā)生顯著變化，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

3 討 論

近年來，國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)IBS與腸道菌群紊亂密切相關(guān)，很多研究結(jié)果指出腸道菌群失調(diào)可能是IBS發(fā)病的重要機(jī)制。與正常人相比，IBS患者腸道內(nèi)擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌等組成異常,其厚壁門與擬桿菌門比值比正常組高2倍之多[3]。Jalanka-Tuovinen等通過phylogenetic microarray和qPCR實(shí)驗(yàn)研究了IBS和正常人的糞便菌群組成，發(fā)現(xiàn)患者糞便中的擬桿菌門是正常人的12倍，而對(duì)于非培養(yǎng)的梭狀芽孢桿菌，正常組則是處理組的35倍[4]。這些研究結(jié)果提示IBS患者腸道內(nèi)菌群與正常人相比具有較大差異。

本研究通過高通量測序方法，取得正常組和IBS患者的糞便樣品中微生物的結(jié)構(gòu)和豐度，并分析IBS患者腸道菌種的變化。結(jié)果顯示，腸道微生物主要由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacterias構(gòu)成。在IBS患者中，F(xiàn)irmicutes豐度顯著增加(P＜0.01)，Bacteroidete的豐度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值也明顯下降(P＞0.01)。Bacteroidetes與Firmicutes比值是腸道微生態(tài)平衡、腸道健康的重要指標(biāo)，與國外Rajilic-Stojanovic M等的研究結(jié)果一致[5]。此外，對(duì)腸道菌群科水平進(jìn)一步的研究，分析發(fā)現(xiàn)正常人組和IBS組在Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae、和Fibrobacteraceae4個(gè)科的豐度變化明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cryomorphaceae屬于擬桿菌門，在人體腸道內(nèi)的豐富程度與高脂飲食、體育鍛煉等生活有關(guān)[6]。本研究在IBS組中Erysipelotrichaceae明顯下降，Erysipelotrichaceae減少可導(dǎo)致IBS的發(fā)生[7]。Campylobacteraceae屬于變形菌門，與飲食習(xí)慣和身體營養(yǎng)狀況有關(guān)[8]，F(xiàn)ibrobacteraceae常在等多種動(dòng)物的腸道中檢出，如食草類動(dòng)物：牛、羊，F(xiàn)ibrobacteraceae與內(nèi)臟神經(jīng)高敏感性有關(guān)[9]。本研究結(jié)果提示IBS患者和健康人相比，菌群多樣性未見明顯差異。但某些細(xì)菌菌種存在顯著差異。Campylobacteraceae、Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae和Fibrobacteraceae這4科，可能在IBS的診斷和治療中具有積極作用。

因本研究樣本量相對(duì)較少，故未對(duì)IBS亞型進(jìn)行分組研究，IBS亞型對(duì)腸道微生物也有一定影響，因此腸道菌群對(duì)IBS發(fā)病影響的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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High-throughput Sequencing Analysis of Intestinal Microbiota in Patients with Irritable Bowel Syndrome and Healthy Individuals*

YANG Li-li, WANG Cheng-wen,ZOU Ao. Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, China

ObjectiveTo compare differences of intestinal microbiotabetween IBS patients andhealthy by using high-throughput sequencing technology.MethodsThe feces were collected IBS group andhealthy group. The community structure and abundance of intestinal microbiota were examined via analyzing 16S rRNA high throughput sequencing using Illumima System.ResultsThe diversities of intestinal bacteria were no significant differences in IBS group. In phyla level, the abundance of Firmicutes was significantlyincreased (P＜0.01), while the abundance of Bacteroidetesand the ratio ofBacteroidetes/Firmicutes were decreased (P＜0.01). Besides, in family level, cryomorphaceae,erysipelotrichac eae. Campylobacteraceae and fibrobacteraceae were detected in IBS group and healthy group.Their abundance were significantly difference, respectively (P＜0.05).ConclusionNo significantdifferences in the bacterial diversity indices are found, but some bacterial species significantly differbetween the patients with IBS and healthy controls.

Irritable Bowel Syndrome; Intestinal Microbiota; High-throughput Sequencing; 16S rRNA

R378.2

A

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目：No.JCYJ201404151625429

10.3969/j.issn.1009-3257.2017.05.015

楊莉麗，女，消化內(nèi)科專業(yè)，副主任醫(yī)生，主要研究方向：胃腸功能性疾病

王成文

2017-09-21