郭亞璐，馬曉飛，史佳楠，張柳，張劍碩，黃騰，武鵬程，康昊翔，耿廣薈，陳浩，魏健，竇世娟，李莉云，尹長城，劉國振

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轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測

郭亞璐1，馬曉飛2，史佳楠1，張柳1，張劍碩1，黃騰1，武鵬程2，康昊翔2，耿廣薈2，陳浩2，魏健1，竇世娟1，李莉云1，尹長城2，劉國振1

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，北京101318）

【】制備抗CAS9蛋白質(zhì)的單克隆抗體，建立轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測方法，了解CAS9蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達特征。以帶的質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴增5′端810 bp片段后克隆到pET30a載體中，將酶切驗證且序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌Condon Plus中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達CAS9蛋白質(zhì)（N端270氨基酸），用純化的重組蛋白質(zhì)作為免疫原免疫小鼠，制備單克隆抗體，用免疫印跡分析篩選特異性和靈敏度高的抗體細胞株。用特異性引物PCR擴增轉(zhuǎn)基因水稻的，用免疫印跡檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的CAS9蛋白質(zhì)。將重組CAS9蛋白質(zhì)和帶有CAS9的水稻苗期葉片蛋白質(zhì)進行平行免疫印跡分析，用Image J軟件采集信號繪制CAS9蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而對水稻葉片中的CAS9蛋白質(zhì)進行定量分析。提取單粒稻米的總蛋白質(zhì)，稀釋后用免疫印跡分析CAS9蛋白質(zhì)的檢測下限，提取多個時期、部位的水稻材料的總蛋白質(zhì)，包括苗期的地上部和地下部，分蘗期的莖、莖節(jié)、葉鞘、葉片等，用SDS-PAGE分離后免疫印跡檢測比較CAS9蛋白質(zhì)的表達特征。通過體外克隆、誘導(dǎo)表達獲得了純化的重組CAS9蛋白質(zhì)N端片段，免疫小鼠后得到42株陽性雜交瘤細胞株，經(jīng)篩選鑒定到#12D2細胞株對水稻樣品的檢測具有較好的特異性和靈敏度。用該抗體通過免疫印跡檢測了轉(zhuǎn)基因水稻，所建立的免疫印跡方法對重組CAS9蛋白質(zhì)的檢測下限約為0.25 ng。在水稻苗期葉片中，CAS9蛋白質(zhì)約占鮮重的0.00005%，可檢出單粒稻米8%樣品（約2 mg）中的CAS9蛋白質(zhì)。在苗期地上部CAS9蛋白質(zhì)的表達豐度高于地下部，分蘗期莖和葉片中表達量較高，根和葉鞘表達量較低?！尽揩@得特異性強、靈敏度高的抗CAS9單克隆抗體，建立了檢測轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印記方法，揭示了CAS9蛋白質(zhì)在水稻不同部位的表達特征，并展示了在其他植物中的應(yīng)用潛力。

水稻；轉(zhuǎn)基因植物；CAS9蛋白質(zhì)；單克隆抗體；免疫印跡

0 引言

【研究意義】CRISPR/CAS9一般被稱為第3代基因編輯技術(shù)，該技術(shù)操作方便、編輯效率高、適應(yīng)性廣，被認(rèn)為是生物學(xué)研究中最具影響力的研究方法。該技術(shù)自問世以來迅速應(yīng)用于不同物種上，在主要農(nóng)作物上也得到了應(yīng)用，并產(chǎn)生了巨大的科技和社會影響。在CRISPR/CAS9技術(shù)中，要實現(xiàn)對目標(biāo)基因的編輯，需要兩個條件，一個是sgRNA，負責(zé)特異性選擇靶基因；另一個是CAS9蛋白質(zhì)，負責(zé)對靶基因DNA進行切割。CAS9蛋白質(zhì)表達特征與基因編輯效率有直接的關(guān)系，所以，檢測CAS9蛋白質(zhì)具有重要的理論意義和實用價值?！厩叭搜芯窟M展】在細菌與古細菌中天然存在的CRISPR/CAS（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associated）發(fā)揮著免疫系統(tǒng)的作用，其功能是抵抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR是高度保守的重復(fù)序列（Repeat）與間隔序列（Spacer）相間排列組成的，CAS存在于CRISPR附近，編碼的蛋白質(zhì)具有核酸酶活性，可以切割DNA。CRISPR/CAS免疫系統(tǒng)的作用機制有3個步驟，第一是從外源性DNA獲取CRISPR間隔序列整合到自身基因組中；第二是crRNA前體的轉(zhuǎn)錄與crDNA的加工；第三是crRNA與tracrRNA及CAS蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體對外源性DNA進行剪切[1]。目前，基因編輯技術(shù)中最常用CAS9來自鏈球菌（），屬于Ⅱ型CRISPR/CAS系統(tǒng)。CAS9由1 377個氨基酸組成，分子量為169 kD，全長的蛋白質(zhì)有幾個主要結(jié)構(gòu)域，包括-螺旋形成的識別區(qū)（REC）、由RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域組成的核酸酶區(qū)以及位于C端的PAM結(jié)合區(qū)。HNH負責(zé)對sgRNA的互補鏈進行切割，RvcC負責(zé)對非互補鏈的切割，酶切后使靶基因產(chǎn)生平末端的DNA雙鏈斷裂。對RuvC和HNH兩個剪切功能域的關(guān)鍵氨基酸進行突變（RuvC，D10A；HNH，H840A），可使CAS9核酸內(nèi)切酶突變成DNA單鏈切口酶，如果設(shè)計兩個sgRNA的靶位點，在兩條DNA鏈上分別形成切口，可降低基因編輯的脫靶率[2]。CRISPR/CAS9技術(shù)在多種生物中開展了廣泛的應(yīng)用，在人類中的研究甚至有可能實現(xiàn)對腫瘤和遺傳性疾病的治療[3]。在人的誘導(dǎo)干細胞研究中，用CRISPR/CAS9工具結(jié)合piggyBac轉(zhuǎn)座子，矯正了來自地中海貧血病人的誘導(dǎo)多能干細胞基因組中人血紅蛋白基因的突變[4]。用CRISPR/CAS9技術(shù)可有效地將骨肉瘤細胞系中與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的沉默表達，可抑制骨肉瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[5]。在模式植物和重要作物中，也都開展了CRISPR/CAS9的應(yīng)用研究。在水稻中，用CRISPR/CAS9技術(shù)定點突變水稻中的，導(dǎo)致基因功能的缺失，轉(zhuǎn)基因株系均出現(xiàn)葉片下垂的表型[6]。用CRISPR/CAS9技術(shù)獲得了水稻的純合突變體，呈現(xiàn)矮小的表型[7]。以水稻、和3個靶基因為目標(biāo)開展基因編輯，在T1代株系中的突變效率為5%，其余2個基因的突變效率達26%—84%[8]。Xu等[9]以水稻為靶標(biāo)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，在基因編輯后獲得的90個獨立的轉(zhuǎn)基因株系中，發(fā)現(xiàn)14個株系發(fā)生了基因突變。在玉米中，利用CRISPR/CAS9進行基因編輯雙等位基因和，觀察到了突變表型[10]。為了保證CAS9蛋白質(zhì)在不同物種中的表達，一般要對編碼CAS9的DNA序列進行偏愛密碼子優(yōu)化。在斑馬魚中，比較了2種密碼子優(yōu)化的的敲除效率[11]。在對水稻基因組的定點編輯過程中，用人偏愛密碼子優(yōu)化的CAS9蛋白質(zhì)效率明顯低于水稻偏愛密碼子優(yōu)化的CAS9蛋白質(zhì)[9]。在玉米原生質(zhì)體的瞬時表達突變中，也證明玉米偏愛密碼子優(yōu)化的CAS9蛋白質(zhì)效率更高[12]。但值得指出的是，目前密碼子優(yōu)化實驗中大部分只提供的轉(zhuǎn)錄水平改變結(jié)果，并沒有提供直接的CAS9蛋白質(zhì)表達豐度的數(shù)據(jù)。隨著CRISPR/CAS9技術(shù)在植物中的應(yīng)用，對植物基因編輯過程的檢測和跟蹤也隨之展開。對轉(zhuǎn)基因植物的檢測一般可借助PCR技術(shù)對DNA進行擴增，該技術(shù)具有極高的靈敏度，操作也比較方便，但由于PCR擴增的高靈敏度，試驗結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。對蛋白質(zhì)的檢測主要是通過免疫學(xué)方法，其核心是利用抗體的特異性檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)，該方法也具有很高的靈敏度，且假陽性率低。具體到對CAS9蛋白質(zhì)的檢測，因為DNA的存在并不能保證蛋白質(zhì)的表達，且DNA的存在也不能反應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度等特征信息，所以用免疫學(xué)方法對CAS9蛋白質(zhì)的檢測更具重要性。Howden等[13]用CAS9抗體檢測了H9細胞SpCas9和其突變體的表達量。Lin等[14]用CAS9抗體檢測了載體進入果蠅細胞后是否有酶的活性。目前，在動物細胞中有多篇用商業(yè)抗體檢測CAS9蛋白質(zhì)的報道，但到目前為止，尚未見轉(zhuǎn)基因植物中用免疫方法直接檢測CAS9蛋白質(zhì)的報道。在對玉米的基因編輯實驗中，ZHU等[15]在CAS9蛋白質(zhì)的N端添加了3×FLAG的標(biāo)簽序列，然后用抗FLAG的抗體檢測了轉(zhuǎn)基因玉米中CAS9蛋白質(zhì)的表達量?！颈狙芯壳腥朦c】CAS9蛋白質(zhì)具體執(zhí)行對靶基因DNA的切割，該蛋白質(zhì)的表達豐度與基因編輯的效率有直接的關(guān)系。免疫技術(shù)是蛋白質(zhì)檢測中最為常用的方法，其中抗體是最為核心的材料。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)與生物信息學(xué)實驗室先后獲得了針對水稻內(nèi)源的HSP蛋白質(zhì)[16]以及外源的GUS[17]、NPT-II[18]、PMI[19]、HPT[20]和CP4-EPSPS[21]的單克隆抗體，并調(diào)查了它們在水稻植株中的表達特征，為橫向比較這些蛋白質(zhì)在水稻中的表達豐度等特征打下了基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定獲得可用于轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)檢測的抗體，進而建立免疫印跡方法，調(diào)查CAS9在水稻不同部位的表達特征。制備鑒定CAS9蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體，建立具有應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測方法，了解轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時期不同組織中CAS9的表達特征。

1 材料與方法

試驗于2017年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)稻竹園試驗田完成。

1.1 材料

帶有CaMV-35S驅(qū)動的的轉(zhuǎn)基因水稻由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱立煌教授提供。帶有的質(zhì)粒由北京大學(xué)瞿禮嘉教授惠贈。轉(zhuǎn)基因水稻在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)稻竹園實驗田中種植，取材后用液氮速凍，然后置于-70℃保存待用。

1.2 Cas9的克隆

全長為4 131 bp，擴增了5′-端810 bp片段，利用PrimerCE軟件[22]，設(shè)計特異性引物（上游引物序列為5′-GATGGACAAGAAGTACAGCAT CGGCC-3′，下劃線為RⅠ酶切位點，下游引物序列為5′-CCGGGTGTCCTTGCTCAGCTGCA GC-3′，下劃線為Ⅰ酶切位點）。以帶的質(zhì)粒DNA為模板擴增，對PCR產(chǎn)物和pET30a載體進行雙酶切并切膠回收，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5后，提取重組質(zhì)粒DNA，雙酶切驗證后送北京華大基因研究中心有限公司進行測序。

1.3 CAS9重組蛋白質(zhì)的表達及抗體制備

將測序后確認(rèn)正確的pET30a-質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到表達菌Condon Plus中，挑取單菌落過夜培養(yǎng)，按照 1﹕10 000的比例轉(zhuǎn)入到含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，將菌液全部轉(zhuǎn)接到500 mL的培養(yǎng)基中大量誘導(dǎo)表達，至OD600為0.6，加入0.5 mmol·L-1IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h后收菌，用20 mL 10 mmol·L-1TRIS-HCl（pH 8.0）將菌液懸浮，超聲破碎（500 W，60次，每次10 s，間隔15 s，超聲破碎儀：JY98-IIN，寧波新芝生物科技有限公司，中國）后12 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀加入1 mL的10 mmol·L-1TRIS-HCl（pH 8.0）溶液重懸，再加5 mL含8 mol·L-1尿素的10 mmol·L-1TRIS-HCl（pH 8.0）溶液溶解純化蛋白質(zhì)，以純化后的重組CAS9蛋白質(zhì)做免疫原，免疫小鼠制備單克隆抗體，抗體的制備在北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進行。

1.4 CAS9蛋白質(zhì)定量分析

CAS9蛋白質(zhì)的定量分析采用Bradford法[23]，具體步驟為配制BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，終濃度依次為0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05和0 mg·mL-1，在試管中加入考馬斯亮藍G-250測定工作液，緩慢搖勻，室溫放置10 min，用分光光度計測定每個樣品的吸光度（OD595），用蛋白質(zhì)提取液調(diào)整待測水稻葉片的CAS9蛋白質(zhì)樣品的濃度至測定范圍內(nèi)，按照上述步驟測定其相對吸光值，取3次測定的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出水稻葉片中CAS9蛋白質(zhì)的濃度。

1.5 基因組DNA提取及PCR檢測

參考樓巧君等[24]的方法提取植物基因組DNA，略有改動。以基因組DNA為模板，擴增，上游引物序列：5′-CTGATCGCCCAACTTCCGGGC-3′，下游引物序列：5′-GTCGAACTTCCTCTGGGTGATG-3′，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.6 植物葉片總蛋白質(zhì)提取及免疫印記（Western blot，WB）檢測

將葉片樣品置于預(yù)冷的研缽中，用液氮充分研磨，保持研缽充分低溫，將粉末轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，按照樣品和蛋白質(zhì)提取緩沖液（62.5 mmol·L-1TRIS-HCl pH 7.4、10%甘油、2% SDS、1 mmol·L-1PMSF、2 mmol·L-1EDTA、5%-巰基乙醇）的比例為3﹕8加入，充分混勻后置于冰上放置10 min，每隔2 min劇烈振蕩30 s，12 000 r/min，4℃離心30 min后取上清即為植物總蛋白質(zhì)。將總蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進行WB分析，具體步驟參考文獻[25-26]，WB試驗至少重復(fù)3次，并用抗HSP抗體的檢測信號作為加樣量的內(nèi)參[16]。用化學(xué)發(fā)光成像儀（MiniChemi610，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）檢測，Image J軟件[17]進行信號采集。

2 結(jié)果

2.1 Cas9克隆

全長4 131 bp，編碼1 377個氨基酸，其N端270個氨基酸包含RuvC-I結(jié)構(gòu)域及部分Recognition lobe，具有較好的免疫原性和唯一性，所以從制備抗體的角度出發(fā)，選擇擴增了5′端的810 bp。以帶的質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計引物并進行PCR特異性擴增，擴增得到單一條帶（圖1-A），將PCR產(chǎn)物和載體pET30a進行雙酶切，切膠回收后連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5中，獲得重組表達質(zhì)粒pET30a-，提取質(zhì)粒DNA進行雙酶切，得到5.4 kb的pET30a線性片段和約810 bp的片段（圖1-B），重組子經(jīng)測序鑒定表明獲得了正確的片段。

M：分子量標(biāo)記；PCR：Cas9的PCR擴增產(chǎn)物；RE：用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗證重組質(zhì)粒

2.2 CAS9蛋白質(zhì)的表達、純化及抗體制備

將重組質(zhì)粒pET30a-轉(zhuǎn)化到表達菌株Condon Plus中，挑取單克隆，培養(yǎng)后進行大量表達，離心收集細菌后超聲破碎，分離上清和沉淀，用少量10 mmol·L-1TRIS-HCl（pH 8.0）溶液重懸后用8 mol·L-1尿素溶液溶解純化蛋白質(zhì)。SDS-PAGE分離和考馬斯亮藍染色檢測（圖2-A）。由圖可見，在誘導(dǎo)表達后的上清和沉淀中都有符合分子量預(yù)期（N端270AA，37 kD）的誘導(dǎo)條帶，但上清中表達量低。由于所表達的CAS9蛋白質(zhì)帶有His標(biāo)簽，用抗His抗體進行WB檢測可見，在誘導(dǎo)后的上清、沉淀以及純化蛋白質(zhì)樣品中，均檢測到陽性條帶（圖2-B）。用純化的CAS9蛋白質(zhì)為免疫原，免疫小鼠后共獲得42株陽性雜交瘤細胞株，篩選能識別重組和水稻中表達的CAS9蛋白質(zhì)的細胞株，經(jīng)比較確定編號為#12D2的細胞株具有較高的靈敏度和特異性，選定該抗體為后續(xù)檢測所用。用#12D2抗體對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻及重組CAS9蛋白質(zhì)進行平行免疫印記檢測（圖2-C），結(jié)果表明在非轉(zhuǎn)基因水稻樣品中沒有可見的信號，在轉(zhuǎn)基因CAS9水稻中，有分子量約為169 kD的特異條帶，重組蛋白質(zhì)樣品中可檢測到37 kD的條帶，這一結(jié)果表明獲得了具有良好特異性的CAS9抗體，該抗體既能識別體外重組的蛋白質(zhì)又能識別水稻中表達的蛋白質(zhì)。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

為探究所制備的抗體和建立的WB方法是否可用于轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定，進行了轉(zhuǎn)基因水稻的PCR和WB的比較分析（圖3）。對2個轉(zhuǎn)基因line共8株水稻（每個line 4株）的PCR分析表明（圖3-A），2個line中各有3株陽性，1株陰性，對這8株樣品的WB分析（圖3-B）表明，PCR陽性植株均表現(xiàn)WB陽性，PCR陰性植株也表現(xiàn)WB陰性，2個結(jié)果相互符合。本研究結(jié)果進一步支持了用WB分析鑒定轉(zhuǎn)基因植物的可行性。一般來講，PCR條帶性狀為共顯性，不能區(qū)分純合和雜合個體，而拷貝數(shù)的變化有可能影響蛋白質(zhì)表達的豐度，從而有可能根據(jù)蛋白質(zhì)的豐度區(qū)分純合和雜合個體[19]。本研究WB分析結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)豐度差別，所以不能提供純合或雜合的線索。當(dāng)然，本研究中分析的個體數(shù)較少，或許對更多轉(zhuǎn)基因材料的分析能提供有效的數(shù)據(jù)。另外，用WB方法檢測了轉(zhuǎn)的玉米，也獲得了預(yù)期的陽性結(jié)果。對非轉(zhuǎn)基因的擬南芥、煙草、大豆和小麥進行檢測，WB結(jié)果中均無明顯背景信號（數(shù)據(jù)未附），說明該抗體具有較高的特異性，除應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻和玉米的檢測外，也有望用于其他植物中轉(zhuǎn)基因CAS9蛋白質(zhì)的檢測。

A：在細菌中表達CAS9N蛋白質(zhì)，細菌破碎后，SDS-PAGE分離后用考染檢測；B：用抗His抗體檢測細菌中表達CAS9N+6×His融合蛋白質(zhì)；C：CAS9 蛋白質(zhì)特異抗體的鑒定；HSP：用抗HSP抗體的檢測信號標(biāo)定上樣量。M：分子量標(biāo)志。U：未誘導(dǎo)；S：上清；Pe：沉淀；Pu：純化；Rice：水稻樣品；Re-CAS9N：重組表達的CAS9N蛋白質(zhì)

A：PCR擴增轉(zhuǎn)基因水稻中的Cas9，從轉(zhuǎn)基因水稻中提取基因組DNA，Cas9特異引物進行PCR擴增，預(yù)期擴增片段長度為1 530 bp；B：WB檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的CAS9蛋白質(zhì)，Line 1和Line 2為2個轉(zhuǎn)基因line，每個line 4株（1—4）。M：分子量標(biāo)志

2.4 水稻葉片中CAS9蛋白質(zhì)含量分析

為了獲得WB檢測的靈敏度信息，用WB分析了不同濃度CAS9重組蛋白質(zhì)（0.25、0.5、1、2、4、8和16 ng）（圖4-A），由圖可見，在最低濃度下（0.25 ng）仍然可以清晰的檢測到條帶，隨著上樣量的提高檢測信號強度也成比例上升，采集各泳道的灰度值，計算3次重復(fù)試驗的平均值及方差，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得了線性回歸方程（圖4-B）。

為了檢測水稻葉片中CAS9蛋白質(zhì)的豐度，取新鮮水稻葉片0.02 g，液氮速凍后提取總蛋白質(zhì)，溶解于250 μL緩沖液中，分別用20和40 μL的上樣量與不同濃度的重組蛋白質(zhì)進行平行WB檢測，采集信號后將數(shù)值帶入回歸方程，計算出相應(yīng)的CAS9蛋白質(zhì)含量分別為0.85 ng/20 μL和1.3 ng/40 μL，取二者平均值得到該水稻葉片中CAS9蛋白質(zhì)的含量約為37.5 ng·mL-1，計算得知CAS9蛋白質(zhì)的含量約為鮮重的0.00005%。

A：用WB檢測重組CAS9N和水稻葉片中的CAS9蛋白質(zhì)；B：根據(jù)WB信號強度（A）繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 稻米中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測

食用的稻米是水稻種子去掉穎殼和胚的部分，檢測稻米中外源成分的有無和含量具有重要實際意義。為了解用WB檢測稻米中CAS9蛋白質(zhì)的靈敏度，提取單粒稻米的總蛋白質(zhì)，經(jīng)不同程度稀釋后（32%、16%、8%和4%），用WB進行檢測（圖5），由圖可見，含有單粒稻米的8%的樣品可被檢出陽性。由此可知，經(jīng)制備的抗體和建立的WB體系，只需要單粒稻米的8%就可以判斷其是否為轉(zhuǎn)基因材料。

2.6 CAS9蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因水稻不同部位的表達特征

提取水稻不同組織的全蛋白質(zhì)，用WB檢測CAS9蛋白質(zhì)的豐度（圖6），結(jié)果表明在作為參照的HSP信號接近的情況下，苗期地上部CAS9蛋白質(zhì)的表達量明顯高于地下部，分蘗期的莖和葉片中CAS9表達量較高，在根和葉鞘中表達量低。

HSP：用抗HSP檢測信號作為上樣的內(nèi)參

Seedling：苗期；Tillering：分蘗期；St：Shoot 地上部；Rt：Root根；Stem：莖；Sh：Sheath葉鞘；Leaf：葉片；HSP：用抗HSP檢測信號作為等量上樣的內(nèi)參The abundance of HSP protein was used as loading control

3 討論

本研究通過表達重組CAS9蛋白質(zhì)，免疫小鼠后篩選獲得了特異性強、靈敏度高的抗CAS9單克隆抗體，建立了基于免疫印跡的轉(zhuǎn)基因植物檢測體系，檢測了轉(zhuǎn)基因水稻不同組織中CAS9蛋白質(zhì)的含量，該技術(shù)可檢出單粒稻米8%樣品中的CAS9蛋白質(zhì)。所獲得的抗體和建立的檢測體系在CRISPR/CAS9介導(dǎo)的植物基因編輯研究中將具有重要的應(yīng)用價值。

在生物學(xué)研究中，抗體是無可替代的重要資源。由于CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)具有極為重要的理論與應(yīng)用價值，目前已有多家公司提供商業(yè)銷售的CAS9抗體，包括Abcam、Epigentek和TaKaRa等，這些抗體經(jīng)由不同的免疫原制備，以滿足不同的需求[13-14,27]。但到目前為止，還沒有在植物基因編輯研究中使用CAS9抗體的報道。本研究通過自主設(shè)計和表達的免疫原，獲得了42個免疫細胞株，篩選后獲得了在植物（水稻、玉米）研究中具有較高特異性和靈敏度的抗體，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植物中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測。今后可在此基礎(chǔ)上對不同細胞株開展進一步鑒定，將可能獲得不同用途的抗體。另外，在獲得抗體的基礎(chǔ)上，也可以建立試紙條或酶聯(lián)免疫等其他廣為應(yīng)用的免疫技術(shù)體系，進一步提高檢測的效率。顯然，具備了自主制備的抗體將為國內(nèi)相關(guān)研究，尤其是植物的基因編輯研究和應(yīng)用提供便利。

在不同物種的基因編輯過程中，往往都要對的密碼子進行目標(biāo)物種的偏愛性優(yōu)化，CAS9的表達豐度往往與編輯效率呈正相關(guān)性，但是高豐度的CAS9也可能造成脫靶率提高[28]。為簡化CRISPR/ CAS9編輯系統(tǒng)，可以把穩(wěn)定CAS9蛋白質(zhì)表達的材料作為一個平臺，只需要導(dǎo)入決定靶基因的sgRNA即可實現(xiàn)基因編輯[29]，對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的監(jiān)測將是保證平臺穩(wěn)定的必要條件。CAS9蛋白質(zhì)是在細胞質(zhì)中合成的，但要進入細胞核才能發(fā)揮作用，所以通過抗體定位CAS9也是了解編輯過程及效率的重要方面。為了進行CAS9蛋白質(zhì)的定位，往往是將GFP標(biāo)簽插入基因前后，使兩者融合表達，通過GFP檢測CAS9在玉米細胞中的定位，由于GFP分子量較大，有可能干擾CAS9的遷移和實際定位[30]。在轉(zhuǎn)基因材料中，用CAS9抗體進行pull-down也可以獲得CAS9蛋白質(zhì)的結(jié)合DNA信息，鑒定與CAS9結(jié)合的DNA及蛋白質(zhì)也具有重要意義，這些工作都離不開抗體資源。

本研究中，利用制備的單克隆抗體，通過免疫印跡檢測了水稻不同組織中的表達特征。發(fā)現(xiàn)在水稻不同部位中CAS9的表達量不同，甚至表達的“帶型”特征也有所不同，主要是地上部表達量較高，而地下部表達量低，提示在今后對CAS9的檢測中要注意時期和部位的選擇，避免選材不當(dāng)影響結(jié)果的判讀。在水稻苗期葉片中，CAS9的絕對量占鮮重的0.00005%，僅為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)與生物信息學(xué)實驗室以前檢測的內(nèi)參蛋白質(zhì)HSP（0.12%）[16]的2.5萬分之一，也遠遠低于外源PMI（0.036%）[19]、GUS（0.002%）[17]、NPT-Ⅱ（0.008%）[18]、和HPT（0.001%）[20]蛋白質(zhì)的豐度，提示其表達量還有相當(dāng)大的上升空間。利用抗體和重組抗原的免疫分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對量，為不同蛋白質(zhì)的含量比較提供了可能。

本研究中，通過免疫印跡檢測鑒定了轉(zhuǎn)基因水稻，獲得的結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果相吻合。免疫印跡對重組CAS9蛋白質(zhì)的檢測靈敏度可達到0.25 ng，與PCR相比，免疫印跡的靈敏度雖然較低，但對實驗環(huán)境和操作的要求也較低，一般不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，WB結(jié)果清晰可靠。對DNA的分析可以判斷的有無，對RNA的分析可以知道轉(zhuǎn)錄信號的多少，但DNA和RNA的信息都是上游過程，并不能直接證明CAS9蛋白質(zhì)的存在，更不能提供表達量的信息，免疫印跡的結(jié)果對了解蛋白質(zhì)的豐度才是最直接可靠的。在特定情形下，免疫印跡的結(jié)果甚至可以幫助判斷植株在遺傳上的雜合或純合狀態(tài)[19]，而這一特征，PCR也是不能實現(xiàn)的。當(dāng)然，手工操作進行免疫印跡分析目前還較為繁瑣，難以對大量樣品進行檢測，但隨著自動化免疫印跡分析儀的快速發(fā)展及應(yīng)用，有望在不遠的將來實現(xiàn)免疫印跡分析的高通量和自動化。

4 結(jié)論

4.1 獲得了重組的CAS9蛋白質(zhì)（N端270AA）。

4.2 篩選鑒定到能夠識別重組和植物中表達的CAS9蛋白質(zhì)的單克隆抗體。

4.3 用WB可檢測到0.25 ng的重組CAS9蛋白質(zhì)。

4.4 轉(zhuǎn)基因水稻苗期葉片中CAS9的豐度約為鮮重的0.00005%。

4.5 在不同組織中CAS9的表達豐度等特征有所不同。

4.6 建立的方法可檢出單粒稻米8%樣品中的CAS9蛋白質(zhì)。

[1] Garneau J E, Dupuis M E, Villion M, Romero D A, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadan A H, Moineau S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA., 2010, 468(7320): 67-71.

[2] Ran F A, Hsu P D, Lin C Y, Gootenberg J S, Konermann S, Trevino A E, Scott D A, Inoue A, Matoba S, Zhang Y, Zhang F. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.,2013, 154(6): 1380-1389.

[3] Lin Y, Yang Z, Xu A, Dong P, Huang Y, Liu H, Li F, Wang H, Xu Q, Wang Y. PIK3R1 negatively regulates the epithelial- mesenchymal transition and stem-like phenotype of renal cancer cells through the AKT/GSK3β/CTNNB1 signaling pathway., 2015, 5: 8977.

[4] Xie F, Ye L, Chang J C, Beyer A I, Wang J, Muench M O, Kan Y W. Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac.,2014, 24(9): 1526-1533.

[5] Feng Y, Sassi S, Shen J K, Yang X, Gao Y, Osaka E, Zhang J, Yang S, Yang C, Mankin H J. Targeting CDK11 in osteosarcoma cells using the CRISPR-Cas9 system., 2015, 33(2): 199-207.

[6] Ikeda T, Tanaka W, Mikami M, Endo M, Hirano H Y. Generation of artificial drooping leaf mutants by CRISPR-Cas9 technology in rice.,2016, 90(4): 231-235.

[7] Zheng X, Yang S, Zhang D, Zhong Z, Tang X, Deng K, Zhou J, Qi Y, Zhang Y. Effective screen of CRISPR/Cas9-induced mutants in rice by single-strand conformation polymorphism.,2016, 35(7): 1545-1554.

[8] Feng Z, Mao Y, Xu N, Zhang B, Wei P, Yang D L, Wang Z, Zhang Z, Zheng R, Yang L. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in.,2014, 111(12): 4632-4637.

[9] Xu R, Li H, Qin R, Wang L, Li L, Wei P, Yang J. Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice.,2014, 7(1): 1-4.

[10] Qi W, Zhu T, Tian Z, Li C, Zhang W, Song R. High-efficiency CRISPR/Cas9 multiplex gene editing using the glycine tRNA- processing system-based strategy in maize.,2016, 16(1): 58.

[11] 張峰華, 王厚鵬, 黃思雨, 熊鳳, 朱作言, 孫永華. 兩種密碼子優(yōu)化的Cas9編碼基因在斑馬魚胚胎中基因敲除效率的比較. 遺傳, 2016, 38(2): 144-154.

ZHANG F H, WANG H P, HUANG S Y, XIONG F, ZHU Z Y, SUN Y H. Two kinds of codon optimization Cas9 encoding genes in the zebrafish embryo knockout efficiency comparison., 2016, 38(2): 144-154. (in Chinese)

[12] Xing H L, Dong L, Wang Z P, Zhang H Y, Han C Y, Liu B, Wang X C, Chen Q J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants., 2014, 14(1): 1-12.

[13] Howden S E, McColl B, Glaser A, Vadolas J, Petrou S, Little M H, Elefanty A G, Stanley E G. A Cas9 variant for efficient generation of indel-free knockin or gene-corrected human pluripotent stem cells.,2016, 7(3): 508-517.

[14] Lin S, Ewen-Campen B, Ni X, Housden B E, Perrimon N. In vivo transcriptional activation using CRISPR/Cas9 in., 2015, 201(2): 433-442.

[15] Zhu J, Song N, Sun S, Yang W, Zhao H, Song W, Lai J. Efficiency and inheritance of targeted mutagenesis in maize using CRISPR-Cas9., 2016, 43(1): 25-36.

[16] Li X, Bai H, Wang X, Li L, Cao Y, Wei J, Liu Y, Liu L, Gong X, Wu L, Liu S, Liu G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting., 2011, 62(14): 4763-4772.

[17] 牛東東, 郝育杰, 榮瑞娟, 韋漢福, 蘭金蘋, 史佳楠, 魏健, 李雪姣, 楊爍, 奚文輝, 武鵬程, 劉麗娟, 吳琳, 劉斯奇, 尹長城, 劉國振. 轉(zhuǎn)基因水稻中GUS蛋白質(zhì)的檢測及其表達特征. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(14): 2715-2722.

NIU D D, Hao Y J, RONG R J, WEI H F, LAN J P, SHI J N, WEI J, LI X J, YANG S, XI W H, WU P C, LIU L J, WU L, LIU S Q, YIN C C, LIU G Z. Detection of GUS protein and its expression pattern in transgenic rice plants., 2014, 47(14): 2715-2722. (in Chinese)

[18] 蘭金蘋, 武鵬程, 郭美岑, 史佳楠, 韋漢福, 榮瑞娟, 郝育杰, 楊爍, 白影影, 李莉云, 吳琳, 劉斯奇, 尹長城, 劉國振. NPTⅡ蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達特征研究. 生物化學(xué)與生物物理進展,2015, 42(3): 268-276.

LAN J P, WU P C, GUO M C, SHI J N, WEI H F, RONG R J, HAO Y J, YANG S, BAI Y Y, LI L Y, WU L, LIU S Q, YIN C C, LIU G Z.The expression properties of NPTⅡprotein in transgenic rice plant, 2015, 42(3): 268-276. (in Chinese)

[19] Rong R, Pengcheng W U, Lan J, Wei H, Wei J, Chen H, Shi J, Hao Y, Liu L, Dou S. Western blot detection of PMI protein in transgenic rice., 2015, 15(4): 726-734.

[20] 楊爍, 郝育杰, 蘭金蘋, 韋漢福, 魏健, 榮瑞娟, 武鵬程, 劉國振, 尹長城, 李莉云. 轉(zhuǎn)基因水稻中HPT蛋白質(zhì)的檢測及表達特征研究. 中國生物工程雜志, 2015, 35(6): 61-67.

YANG S, HAO Y J, LAN J P, WEI H F, WEI J, RONG R J, WU P C, LIU G Z, YIN C C, LI L Y. HPT protein detection and expression pattern in transgenic rice., 2015, 35(6): 61-67. (in Chinese)

[21] 柴帥杰, 武鵬程, 榮瑞娟, 郝育杰, 史佳楠, 郭亞璐, 丁國濤, 韓宇寧, 趙志靜, 魏健, 尹長城, 劉國振. 轉(zhuǎn)基因水稻中CP4-EPSPS蛋白質(zhì)的檢測及其表達特征研究. 核農(nóng)學(xué)報,2017, 31(1): 44-50.

CHAI S J, WU P C, RONG R J, HAO Y J, SHI J N, GUO Y L, DING G T, HAN Y N, ZHAO Z J, WEI J, YIN C C, LIU G Z. Detection and expression characteristics of CP4-EPSPS protein in transgenic rice., 2017, 31(1): 44-50. (in Chinese)

[22] Cao Y, Sun J, Zhu J, Li L, Liu G. PrimerCE: designing primers for cloning and gene expression., 2010, 46(2): 113-117.

[23] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.,1976, 72: 248-254.

[24] 樓巧君, 陳亮, 羅利軍. 三種水稻基因組DNA快速提取方法的比較. 分子植物育種,2005, 3(5): 749-752.

LOU Q J, CHEN L, LUO L J. Three kinds of rice genome DNA rapid extraction method of comparison., 2005, 3(5): 749-752. (in Chinese)

[25] Xu W, Wang Y, Liu G, Chen X, Porntip T, Pi L, Song W. The autophosphorylated Ser686, Thr688, and Ser689 residues in the intracellular juxtamembrane domain of XA21 are implicated in stability control of rice receptor-like kinase.,2006, 45(5): 740-751.

[26] 蘭金蘋, 李莉云, 賈霖, 曹英豪, 白輝, 陳浩, 劉勝南, 吳琳, 劉國振. 葉綠體基因編碼蛋白質(zhì)在水稻葉片生長過程中的表達研究. 生物化學(xué)與生物物理進展,2011, 38(7): 652-660.

LAN J P, LI L Y, JIA L, CAO Y H, BAI H, CHEN H, LIU S N, WU L, LIU G Z. Expression profiling of chloroplast-encoded proteins in rice leaves at different growth stages., 2011, 38(7): 652-660. (in Chinese)

[27] Yao L, Cengic I, Anfelt J, Hudson E P. Multiple gene repression in cyanobacteria using CRISPRi.,2015, 5(3): 270.

[28] 單奇?zhèn)? 高彩霞. 植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進展. 遺傳,2015, 37(10): 953-973.

SHAN Q W, GAO C X. Research progress of genome editing and derivative technologies in plants., 2015, 37(10): 953-973. (in Chinese)

[29] Chuai G H, Wang Q L, Liu Q. In silico meets: Towards computational CRISPR-based sgRNA design.,2017, 35(1): 12-21.

[30] 朱金潔. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點編輯研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

ZHU J J. Targeted genome editing in maize using CRISPR-Cas9[D]. Beijing: China Agricultural University, 2015. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

Western blot detection of CAS9 protein in transgenic rice

GUO YaLu1, MA XiaoFei2, SHI JiaNan1, ZHANG Liu1, ZHANG JianShuo1, HUANG Teng1, WU PengCheng2, KANG HaoXiang2, GENG GuangHui2, CHEN Hao2, WEI Jian1, DOU ShiJuan1, LI LiYun1, YIN ChangCheng2, LIU GuoZhen1

(1College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2Beijing Protein Innovation Co., Ltd., Beijing 101318)

【】The objective of this study is to generate monoclonal antibodies against CAS9 protein and establish immunological method for the detection of CAS9 protein in transgenic plants, and to understand the characters of the expression patterns of CAS9 protein in transgenic rice. 【】The 5′ fragment (810 bp) ofwas amplified using plasmid DNA confersas template. The amplican was cloned into expression vector pET30a. Restriction enzyme digestion identified recombinant plasmid were sequencing verified. The recombinant plasmid was transformed intoCondon Plus strain. The induced CAS9 protein was purified and used as immunogene to generate monoclonal antibodies. Positive hybridoma cell lines were identified by western blot analysis. PCR amplifications were carried out to identify positive transgenic rice using specific primers of. Western blot was carried out to detect CAS9 protein in rice. The recombinant CAS9 protein and protein samples extracted from rice seedling were analyzed in parallel by western blot, and standard curves were drawn based on Image J software extracted signals. CAS9 protein in rice tissues were analyzed quantitatively based on the standard curve. Total protein of single rice grain was extracted and the sensitivity of CAS9 protein detectable by western blot was analyzed using diluted samples. The abundance of CAS9 protein in different tissues, including shoot and root at seedling stage, stem, node, sheath and leaf at tillering stage, were compared by western blot. 【】Thewas cloned and the plasmid was transformed into. Recombinant N-terminal portion of CAS9 protein was obtained and used as immunogen to inject mice. Forty-two positive hybridoma cell lines were obtained after immunization. Among them, cell line #12D2 showed higher specificity and sensitivity for the detection of CAS9 protein in rice tissues. Western blot analysis was carried out for the detection of transgenic rice via the antibody of #12D2-derived hybridoma cell lines. The lowest amount of recombinant CAS9 protein detectable by the established western blot protocol was about 0.25 ng. It was also revealed that the CAS9 protein accounted for about 0.00005% of fresh weight in rice seedling, and CAS9 protein in 8% of single grain rice (about 2 mg) was detectable. It was also found that the abundance of CAS9 protein in rice shoot tissues at seedling stage was higher than that in root tissues, the abundance in stem and leaves at tillering stage was higher than that in root and sheath tissues. 【】In this study, anti-CAS9 monoclonal antibodies with satisfied specificity and sensitivity were obtained and western blot protocol for the detection of CAS9 protein in transgenic plants was established. The expression patterns of CAS9 protein in different rice tissues were revealed. Moreover, the data also demonstrated the potential of application in other plants.

rice; transgenic plants; CAS9 protein; monoclonal antibody; western blot

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.001

2017-03-20；接受日期：2017-05-03

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20131302110006）

郭亞璐，E-mail：guoyalu_mbb@126.com。馬曉飛，E-mail：maxiaofei@genomics.cn。郭亞璐和馬曉飛為同等貢獻作者。通信作者劉國振，Tel：0312-7528787；E-mail：gzhliu@hebau.edu.cn。通信作者尹長城，Tel：010-80493132；E-mail：yincc@genomics.cn