李多慧+田甲申+羅耀明+王麗梅+鹿志創(chuàng)+王秀艷

摘 要：為研究丙烯酸對仿刺參（Apostichopus japonicus）的免疫酶活性的影響，采用半靜水式毒性測試方法，分別用3種不同濃度（0.84、4.20、21.00 mg/L）丙烯酸處理24、48、72、96 h后，檢測仿刺參體腔液中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，各濃度丙烯酸處理24 h后，ACP、CAT酶活性無顯著差異，SOD酶活性顯著上升；中、低濃度處理組AKP酶活性顯著上升。48 h后，隨著丙烯酸處理濃度升高，ACP、AKP、SOD酶活性上升，具有劑量-效應(yīng)正相關(guān)性；與對照組相比，中、低濃度處理組CAT活性顯著降低，高濃度處理組CAT活性顯著上升。72 h后，隨著丙烯酸處理濃度升高，SOD酶活性下降，具有劑量-效應(yīng)負(fù)相關(guān)性。96 h后，ACP、AKP酶活性與對照組無顯著差異，高濃度組SOD酶活性極顯著降低。上述結(jié)果表明：0.84～21.00 mg/L的丙烯酸處理0～96 h對仿刺參體腔液ACP、AKP、SOD和CAT等免疫指標(biāo)有一定程度的影響。

關(guān)鍵詞：丙烯酸；仿刺參（Apostichopus japonicus）；酸性磷酸酶；堿性磷酸酶；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶

中圖分類號：S968.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

丙烯酸為具辛辣氣味的無色酸性液體，可溶于水、乙醚、乙醇，是強(qiáng)酸并且具腐蝕性。丙烯酸屬于危險化學(xué)品，被收錄于《危險化學(xué)品目錄（2015版）》，腐蝕性極強(qiáng)，幾乎對所有的生物都有毒害性[1]。丙烯酸在光、氧和高溫同時存在的條件下，發(fā)生聚合反應(yīng)，引起動物中毒，毒性機(jī)理為影響胸腺嘧啶進(jìn)入DNA，進(jìn)而阻止了尿嘧啶進(jìn)入RNA，最后抑制蛋白質(zhì)的合成[2]。丙烯酸及其酯類在化纖、造紙、紡織、膠粘劑等[3-6]領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是現(xiàn)代化工的重要基礎(chǔ)原料。在生產(chǎn)丙烯酸及丙烯酸酯的過程中會產(chǎn)生大量廢水，該廢水含有丙烯酸等高濃度有毒有機(jī)物[7]，化學(xué)需氧量高，毒性大，傳統(tǒng)方法較難處理[8]。

仿刺參（Apostichopus japonicus）是黃、渤海重要底棲生物類群，主要攝食底泥中細(xì)菌、底棲硅藻和有機(jī)質(zhì)碎屑，作為我國重要海水增養(yǎng)殖品種之一，其生物學(xué)數(shù)據(jù)基本完備、并且取材方便，是海洋底棲環(huán)境污染物生物毒性評價的理想受試生物[9-10]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于化學(xué)品對仿刺參免疫酶活性影響的研究大多集中在重金屬、有機(jī)污染物及常用藥物等方面[11-14]，有關(guān)丙烯酸對仿刺參免疫酶活性影響的研究尚未見報道。為此，本文通過測定3種不同濃度丙烯酸處理組的仿刺參體腔液中4種免疫酶的活性，研究丙烯酸對仿刺參免疫酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參購于大連金州區(qū)某育苗場，體質(zhì)量527±0.86 g，馴養(yǎng)7 d后，挑選健康的仿刺參用于試驗，馴養(yǎng)期間每天換水1次，隔日投餌1次。

1.2 儀器與試劑

儀器：多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan），CT15RE型臺式微量高速離心機(jī)（日本 Hitachi）。

試劑：丙烯酸為化學(xué)純（中國國藥有限公司），酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和總蛋白定量測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 毒性試驗

參考羅耀明等[15]研究結(jié)果，將丙烯酸設(shè)置3個不同處理濃度（0.84 mg/L、4.20 mg/L、21.00 mg/L），在10 L的玻璃缸中配置10 L不同濃度丙烯酸處理液，同時設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置3個平行樣，每個平行樣中隨機(jī)放入仿刺參20頭，試驗期間不投餌，水溫14.5 ℃，溶氧為5.0 mg/L以上，鹽度30.0‰，pH 7.9。每天換水1次，換水量10 L。試驗開始后0、24、48、72、96 h分別取樣，每次每缸隨機(jī)取3只仿刺參放于冰盒上，用生理鹽水清洗仿刺參體表，并用濾紙吸干體表水分，迅速解剖并收集仿刺參的體腔液，4℃、3 000轉(zhuǎn)/min離心20 min后，收集上清液，迅速分裝1.5 mL凍存管，放入-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于后續(xù)的酶活性檢測。

1.4 酶活性測定

仿刺參體腔液的ACP、AKP、SOD、CAT酶活性和總蛋白含量按照試劑盒提供的測定方法，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

ACP活性定義為：每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位。

AKP活性定義為：每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

SOD活性定義為：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位（U）。

CAT活性定義為：每毫克血紅蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件，在P<0.05，P<0.01的置信水平，利用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析處理組與對照組酶活性之間的差異。用Excel 2010軟件作圖，用英文小寫字母標(biāo)注，凡有一個相同標(biāo)記小寫字母的表示差異不顯著，凡沒有相同標(biāo)記小寫字母的表示差異顯著；用英文大寫字母標(biāo)注，凡有一個相同標(biāo)記大寫字母的表示差異不顯著，凡沒有相同標(biāo)記大寫字母的表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 丙烯酸對仿刺參體腔液ACP酶活性的影響

丙烯酸對仿刺參體腔液ACP酶活性的影響結(jié)果見圖1。在24 h和96 h，各處理組的仿刺參體腔液ACP酶活性均與對照組無顯著差異。在48 h，0.84 mg/L處理組的ACP酶活性與對照組無顯著差異，4.20 mg/L、21.00 mg/L處理組的ACP酶活性高于對照組，差異極顯著。在72 h，0.84 mg/L、21.00 mg/L處理組的ACP酶活性與對照組無顯著差異，而4.20 mg/L處理組的ACP酶活性低于對照組，差異極顯著。endprint

2.2 丙烯酸對仿刺參體腔液AKP酶活性的影響

丙烯酸對仿刺參體腔液AKP酶活性的影響結(jié)果見圖2。在24 h，0.84 mg/L、4.20 mg/L處理組的AKP酶活性高于對照組，差異顯著，2100 mg/L處理組的AKP酶活性與對照組無顯著差異。在48 h，4.20 mg/L、21.00 mg/L處理組的AKP酶活性高于對照組，差異極顯著，084 mg/L處理組的AKP酶活性與對照組無顯著差異。在72 h，21.00 mg/L處理組的AKP酶活性高于對照組，差異極顯著，而0.84 mg/L和4.20 mg/L處理組的AKP酶活性與對照組無顯著差異。在96 h，各處理組的AKP酶活性均與對照組無顯著差異。

2.3 丙烯酸對仿刺參體腔液SOD酶活性的影響

丙烯酸對仿刺參體腔液SOD酶活性的影響結(jié)果見圖3。在24 h，各處理組的SOD酶活性均高于對照組，具有非線性的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性。在48 h，21.00 mg/L處理組的SOD酶活性高于對照組，差異顯著，0.84 mg/L、4.20 mg/L處理組的SOD酶活性與對照組無顯著差異。在72 h，各處理組的SOD酶活性均低于對照組，具有劑量-效應(yīng)負(fù)相關(guān)性。在96 h，21.00 mg/L處理組的SOD酶活性低于對照組，差異極顯著。

2.4 丙烯酸對仿刺參體腔液CAT酶活性的影響

丙烯酸對仿刺參體腔液CAT酶活性的影響結(jié)果見圖4。在24 h，各處理組的仿刺參體腔液CAT酶活性均與對照組無顯著差異。在48 h，084 mg/L處理組的CAT酶活性低于對照組，差異顯著。在72 h，21.00 mg/L處理組的CAT酶活性高于對照組，差異極顯著。在96 h，0.84 mg/L、21.00 mg/L處理組的CAT酶活性低于對照組，差異顯著。

3 討論

3.1 丙烯酸對仿刺參體腔液ACP、AKP酶活性的影響

在缺乏特異性免疫球蛋白的低等動物體內(nèi)，ACP、AKP作為溶酶體的重要水解酶，保證了溶酶體有效完成防御和消化的雙重功能，參與細(xì)胞的消化代謝和免疫調(diào)節(jié)[16]。ACP、AKP普遍存在于仿刺參體內(nèi)，它對底物專一性要求低，可以在酸性或堿性條件下將磷酸單脂水解，并能促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[17-18]。仿刺參體腔液的ACP、AKP還可用作指示外源物質(zhì)對其免疫活性的影響。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)8種二價金屬離子中Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cd2+、Cu2+可增強(qiáng)仿刺參體腔液的ACP、AKP酶活性，Ca2+、Mn2+、Pb2+則抑制ACP、AKP酶活性。丙烯酸作為一種強(qiáng)酸對仿刺參的幼參具有低毒性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)0.84 mg/L和4.20 mg/L丙烯酸處理組的仿刺參體腔液ACP酶活性呈誘導(dǎo)—抑制—誘導(dǎo)的趨勢，2100 mg/L處理組的ACP酶活性是先抑制后誘導(dǎo)的趨勢；0.84 mg/L、4.20 mg/L丙烯酸處理組的仿刺參體腔液AKP酶活性是先誘導(dǎo)后抑制，21.00 mg/L處理組的AKP酶活性是先抑制后誘導(dǎo)。而處理96 h后各濃度的ACP和AKP酶活性與對照組無顯著差異，這可能與免疫疲勞有關(guān)[19]。

3.2 丙烯酸對仿刺參SOD、CAT酶活性的影響

正常生理狀態(tài)下，生物機(jī)體細(xì)胞代謝會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，而SOD作為生物體內(nèi)僅有的以超氧陰離子為作用底物的酶[23]，可以清除體內(nèi)過多的超氧陰離子自由基，使自由基始終保持在較低的水平，避免機(jī)體內(nèi)因氧自由基濃度過高引起的不良反應(yīng)[20]。SOD的增加或減少受基因的調(diào)控，在外界環(huán)境因子（如化學(xué)毒物）的刺激下，機(jī)體受到輕度脅迫時，體內(nèi)自由基生產(chǎn)量會增加，從而誘導(dǎo)抗氧化酶的合成[21-22]，機(jī)體內(nèi)的SOD活性往往會升高，與自由基作用，從而消除自由基對機(jī)體的損害。如果受到重度逆境脅迫超過了機(jī)體自身的防御能力時，就會抑制該類酶的活性，導(dǎo)致生物體內(nèi)積累了過多的活性氧，造成應(yīng)激損傷，機(jī)體隨之發(fā)生生理和病理改變?？梢杂肧OD酶活力的高低來表征生物體是否有病變發(fā)生。本試驗中三個處理組丙烯酸的仿刺參體腔液中SOD酶活性都是先誘導(dǎo)后抑制。0.84 mg/L處理組的SOD酶活性變化不大，只在24 h時應(yīng)激反應(yīng)較大；4.20 mg/L處理組的SOD酶活性在24 h和72 h應(yīng)激反應(yīng)較大；21.00 mg/L處理組的SOD酶活性變化極大，在96 h達(dá)到最低，與對照組差異極顯著，可能該處理組已造成仿刺參氧化損傷。

CAT是酶清除系統(tǒng)的重要組分，能將細(xì)胞內(nèi)H2O2催化分解為H2O和O2，避免細(xì)胞、組織遭受氧化損傷[23]。0.84 mg/L處理組的仿刺參體腔液CAT酶活性受到抑制作用，在48 h和96 h抑制效果顯著；4.20 mg/L處理組的CAT酶活性受到的影響不顯著；21.00 mg/L處理組的CAT酶活性先誘導(dǎo)后抑制，表明在刺激早期可引起仿刺參CAT的應(yīng)激反應(yīng)，但隨著時間的延長，可能會消弱仿刺參CAT的應(yīng)答能力，最終導(dǎo)致仿刺參一定程度的氧化損傷。

以上研究表明，受外部環(huán)境條件改變的影響，仿刺參能夠通過提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力來清除多余的活性氧，與其他無脊椎動物中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力隨水溫升高變化趨勢具有一致性[24]。

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The effects of acroleic acid on the immune enzyme

activity in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

LI Duo-hui1，TIAN Jia-shen2，LUO Yao-ming1，

WANG Li-mei2，LU Zhi-chuang2，WANG Xiu-yan1

（1.Dalian Fisheries Research Institute，Dalian 116019，China； 2.Liaoning Ocean and Fisheries Science

Research Institute，Key Laboratory of Marine Biological Resources and Ecology， Liaoning Province，Dalian 116023，China）

Abstract：In order to study the effects of acroleic acid on the immune enzyme activities （phosphatase （ACP），alkaline phosphatase （AKP），superoxide enzyme （SOD） and catalase （CAT）） of juvenile sea cucumber （Apostichopus japonicus），coelomic fluid samples of sea cucumbers in 3 acroleic acid concentration（AAC） groups （0.84、4.20、21.00 mg/L）， were collected and determined after 24，48，72 and 96 h treatments in terms of semi-hydrostatic toxicity test method.The results showed that， no significant difference was found in ACP and CAT activities after 24 h treatment in all treated groups compared with the control group，however，the SOD activities were significantly increased in 0.84 and 4.20 mg/L AAC groups and similar trend was found on AKP.After 48 h treatment，the ACP，AKP and SOD activities were increased with the increase in AAC，indicating there was a positive correlation between dose and effects.In comparison with the control group，the CAT activities were significantly decreased in 0.84 and 4.20 mg/L AAC groups，whereas the CAT activity was markedly increased in 21.00 mg/L AAC group.After 72 h treatment，the SOD activity was decreased with the increase in acroleic acid concentrations，indicating the negative correlation between dose and effects.After 96 h treatment，no significant difference was found in ACP and AKP activities between experimental groups and the control group.In contrast，the SOD activity was significantly decreased in 21.00 mg/L AAC group.The above results demonstrated that acroleic acid treatment at concentrations of 0.84～21.00 mg/L had，to some extent，effects on the ACP，AKP，SOD and CAT activities in the coelomic fluid of sea cucumber.

Key words：Apostichopus japonicus； acid phosphatase； alkaline phosphatase； superoxide enzyme； catalaseendprint