任建功+王青林+宮春光

摘 要：采用微衛(wèi)星標(biāo)記的方法對(duì)秦皇島海域的野生牙鲆進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)信息含量PIC為0.784～0.949，平均為0.896；12對(duì)標(biāo)記的等位基因數(shù)NA為13～108個(gè)，平均為51；本研究中觀測(cè)雜合度Ho為0.286～0.957，平均為0.764，期望雜合度He為0.809～0.953，平均為0906。結(jié)果表明，秦皇島海域野生牙鲆的遺傳多樣性處于較高水平，是優(yōu)良的牙鲆種質(zhì)資源寶庫。

關(guān)鍵詞：野生牙鲆；微衛(wèi)星標(biāo)記；等位基因；遺傳多樣性

向自然水域投放人工培育的苗種是國(guó)內(nèi)外通行的一種恢復(fù)漁業(yè)種群資源、改善水域生態(tài)環(huán)境和增加漁業(yè)效益的有效手段[1-2]?！掇r(nóng)業(yè)部關(guān)于做好“十三五”水生生物增殖放流工作的指導(dǎo)意見》指出，“十三五”期間將繼續(xù)加大對(duì)水生生物資源的投入力度，每年增殖重要漁業(yè)資源品種的苗種數(shù)量達(dá)到400億單位以上。牙鲆是渤海重要的增殖放流魚類，我國(guó)自20世紀(jì)80年代在該海域進(jìn)行牙鲆的增殖放流活動(dòng)，對(duì)天然漁業(yè)資源的恢復(fù)起到了積極的作用[3]。但是大規(guī)模放流人工培育苗種對(duì)自然群體遺傳多樣性的影響受到人們的關(guān)注[4]?！掇r(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)水生生物經(jīng)濟(jì)物種增殖放流苗種管理的通知》（農(nóng)辦漁[2014]55號(hào)）明確指出用于繁育增殖放流苗種的親本應(yīng)來自該物種原產(chǎn)地天然海域、水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)或省級(jí)以上原種場(chǎng)保育的原種。因此，在分子水平闡明野生牙鲆遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)開展牙鲆增殖放流以及保護(hù)牙鲆種質(zhì)資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)魚為2015-2016年收購的從秦皇島海域捕獲的野生牙鲆（作為放流牙鲆的親魚），共計(jì)231尾，全長(zhǎng)57.73±7.18 cm，體重3 737.55±1 231.55 g，其中雌性109尾，雄性122尾。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集和DNA提取 剪取野生牙鲆胸鰭平鋪于采樣紙上，37 ℃烘干后保存。使用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，DP324）提取基因組DNA。提取完成后，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。

1.2.2 微衛(wèi)星分析 從馬曉冰等（2012）[5]和劉永新等（2013）[6]發(fā)表的72對(duì)牙鲆微衛(wèi)星標(biāo)記中選取12對(duì)多態(tài)性高的標(biāo)記用于本研究。各標(biāo)記的名稱、引物序列、退火溫度等見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括dH2O 7.4 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.3 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性35 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min。PCR擴(kuò)增在PE 9700型PCR儀上進(jìn)行。將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。然后使用3730 XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對(duì)測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置進(jìn)行比較分析，得到片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Genepop 4.0軟件分析分型結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)等位基因數(shù)（NA）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC），并分析群體的Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。

2 結(jié)果和討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)NA、Ho、He、PIC值見表2。其中，12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)信息含量PIC為0.784～0.949，平均為0. 896；12對(duì)標(biāo)記的等位基因數(shù)NA為13～108個(gè)，平均為51；本研究中觀測(cè)雜合度Ho為0.286～0.957，平均為0.764，期望雜合度He為0.809～0.953，平均為0.906。

2.2 討論

多態(tài)信息含量（PIC）為衡量標(biāo)記遺傳信息含量高低的主要參數(shù)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性，即高度多態(tài)；當(dāng)0.25

該研究中平均NA為51，遠(yuǎn)高于馬曉冰等[5]和劉永新等[6]對(duì)該海域野生牙鲆的研究，說明野生群體的遺傳信息含量非常豐富。雜合度包括觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He），是反映微衛(wèi)星標(biāo)記在群體中遺傳變異程度的最優(yōu)參數(shù)[8]，是描述遺傳多樣性的最適參數(shù)。雜合度越高，表明群體內(nèi)遺傳多樣性就越高，遺傳變異程度就越大；反之則群體內(nèi)遺傳變異程度就小[9]。本研究中觀測(cè)雜合度Ho平均為0.764，期望雜合度He平均為0.906，平均He遠(yuǎn)高于邵長(zhǎng)偉等[10]和馬曉冰等[5]研究中的養(yǎng)殖群體和野生群體，說明秦皇島海域野生牙鲆的遺傳多樣性處于較高水平。利用野生牙鲆作為放流親本繁育增殖放流苗種可以改善放流群體的遺傳多樣性。盡管生產(chǎn)中存在牙鲆親本對(duì)后代貢獻(xiàn)率失衡的現(xiàn)象，導(dǎo)致放流群體遺傳多樣性低于親本群體[11]。增加繁殖親本的數(shù)量，或者采用生殖細(xì)胞移植技術(shù)可以有效地解決這個(gè)問題[12-13]。

哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在12個(gè)位點(diǎn)中有8個(gè)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)（P<0.05）。遺傳不平衡現(xiàn)象在已發(fā)表的關(guān)于牙鲆群體的研究中普遍存在，可能的原因很多，包括捕撈、放流以及海區(qū)環(huán)境污染造成野生群體等位基因丟失，無效等位基因，樣本量較小，性別比例失衡，近交衰退，自然選擇等?？紤]到偏離哈迪-溫伯格平衡的位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度和期望雜合度的差異都比較大，我們推測(cè)無效等位基因是引起偏分離的主要原因，但是人為原因?qū)е碌沫h(huán)境污染、過度捕撈以及苗種培育過程中的近親繁殖等因素同樣不能忽視。

綜上，秦皇島海域野生牙鲆群體遺傳信息含量豐富、遺傳多樣性水平較高，是優(yōu)良的牙鲆種質(zhì)資源寶庫，利用野生牙鲆作為放流親魚可以提高放流群體的遺傳多樣性，同時(shí)對(duì)保護(hù)自然種群遺傳多樣性意義重大。

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