姥偉，代建寧，景調(diào)平，鄧彩霞，楊海旭

解放軍第五醫(yī)院 a.骨科中心；b.麻醉手術(shù)科；c.高壓氧；寧夏 銀川 750004

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)載體的構(gòu)建及生物學(xué)功能鑒定

姥偉a，代建寧a，景調(diào)平b，鄧彩霞c，楊海旭a

解放軍第五醫(yī)院 a.骨科中心；b.麻醉手術(shù)科；c.高壓氧；寧夏 銀川 750004

目的：從真核細(xì)胞中獲得骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）編碼基因，構(gòu)建其真核表達(dá)載體并進(jìn)行鑒定。方法：提取人HeLa細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用特異性引物擴(kuò)增BMP2編碼區(qū)，連接至pcDNA3.1載體，篩選陽性克隆并進(jìn)行功能學(xué)鑒定。結(jié)果：反轉(zhuǎn)錄PCR獲得1100bp的片段，經(jīng)分子克隆后鑒定序列與BMP2一致，并且在真核細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)Smad1/5/8的磷酸化。結(jié)論：構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-BMP2并驗(yàn)證了其體內(nèi)功能，為后續(xù)探討B(tài)MP2在骨發(fā)育中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；真核表達(dá)載體；Smad1/5/8

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic pro?teins，BMP）家族成員有20種，在結(jié)構(gòu)上相對保守，在骨骼的發(fā)育、再生和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。其中，對BMP2的研究較多。BMP2通過自分泌或旁分泌的方式刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，并進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞[3]。BMP2可以激活細(xì)胞內(nèi)諸多發(fā)育相關(guān)信號通路的活化，如PI3K/Akt通路、Smad通路、WNT通路等。因此，充分明確BMP2的功能及其在骨形成中的作用機(jī)制，對于骨相關(guān)疾病的研究和治療具有重要意義[4-6]。我們利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建了BMP2真核表達(dá)載體，為后續(xù)的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；大腸桿菌TOP10、限制性內(nèi)切酶及連接酶購自TaKaRa公司；pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司；BMP2抗體和磷酸化Smad1/5/8抗體購自Cell Signaling Technology公司；β-actin購自博士德公司。

1.2 pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

提取HeLa細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)BMP2的編碼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為5'-GAATTCATGGTGGCCGGGACCCGC-3'，酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ；下游引物為5'-CTCGAGC?TAGCGACACCCACAACC-3'，酶切位點(diǎn)為 XhoⅠ。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，連接至pcDNA3.1質(zhì)粒反應(yīng)過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，待單克隆長至肉眼可見菌落時(shí)轉(zhuǎn)接至含氨芐西林的LB培養(yǎng)基，擴(kuò)增宿主菌并進(jìn)行酶切鑒定，對陽性克隆進(jìn)行測序。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞密度長至約60％時(shí)，取4μg pcDNA3.1質(zhì)粒（陰性對照）或4μg pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒，分別與10μL脂質(zhì)體2000混勻，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，24h后收取細(xì)胞，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western印跡實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

用TRIzol試劑盒分別提取HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞pcDNA3.1、pcDNA3.1-BMP2過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組樣品的總RNA，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測各組中BMP2（上游引物：5'-ACTACCAGAAACGAGTGGGAA-3'，下游引物：5'-GCATCTGTTCTCGGAAAACCT-3'）和內(nèi)參照GAPDH（上游引物：5'-ACCCAGAA GACTGTGGATGG-3'，下游引物：5'-TCTAGACGG CAGGTCAGGTC-3'）mRNA的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸 10s，30個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，將所得循環(huán)數(shù)按照公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 Western印跡

分別收取陰性對照、過表達(dá)pcDNA3.1-BMP2的HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，超聲波裂解細(xì)胞提取蛋白；離心后收取蛋白上清，通過BCA定量法對各組蛋白進(jìn)行定量；按照一定體積加入5×上樣緩沖液，于沸水中10min，保證蛋白充分變性；取30μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳實(shí)驗(yàn)（SDSPAGE），濃縮膠電壓為120 V，分離膠電壓為160 V；電泳完成后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5％脫脂奶粉封閉1h；分別用BMP2抗體（1∶1000稀釋）、磷酸化Smad1/5/8抗體（1∶1000稀釋）和β-actin抗體（1∶500稀釋）與NC膜于4℃孵育過夜，次日用含0.5％Tween-20的TBST洗 3次，5min/次，再分別加入1∶5000的HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗3次，5min/次，ECL發(fā)光檢測，膠片顯色，分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以HeLa細(xì)胞的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出BMP2編碼區(qū)域，將BMP2和pcDNA3.1分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，挑取克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)1號和2號克隆均可在1000～2000bp位置切得條帶，此為BMP2編碼區(qū)基因序列（圖1）。經(jīng)測序鑒定正確后準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 BMP2 mRNA表達(dá)水平鑒定

為了驗(yàn)證BMP2是否能在真核細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄翻譯，將pcDNA3.1-BMP2和陰性對照pcDNA3.1空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞或HepG2細(xì)胞。通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP2質(zhì)粒的細(xì)胞中，BMP2的mRNA水平顯著升高，提示pcDNA3.1-BMP2質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)（圖2）。

2.3 BMP2蛋白表達(dá)及Smad1/5/8磷酸化水平鑒定

Smad1/5/8復(fù)合體是BMP2下游作用的信號分子，在BMP2高表達(dá)時(shí)，Smad1/5/8的磷酸化水平顯著增加。為了驗(yàn)證pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒是否在細(xì)胞中發(fā)揮作用，我們通過Western印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在HeLa和HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒均可顯著誘導(dǎo)BMP2蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)Smad1/5/8的磷酸化水平也顯著增加（圖3）。這表明pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可成功表達(dá)并在體內(nèi)發(fā)揮功能。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP2的EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測BMP2 mRNA表達(dá)

圖3 Western印跡檢測BMP2和磷酸化Smad1/5/8表達(dá)水平

3 討論

生長因子在誘導(dǎo)干細(xì)胞向骨細(xì)胞發(fā)育的過程中扮演重要角色，目前已知BMP、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming grouth factor β，TGF-β）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維素樣生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）在骨分化方面具有重要作用[7]。自1988年發(fā)現(xiàn)BMP2可以誘導(dǎo)骨和軟骨形成，BMP家族成員就已成為骨骼生物學(xué)研究的重要內(nèi)容[8]。BMP是TGF-β超家族成員，包含20多種亞型，通過調(diào)控BMP信號通路，可以改善骨骼質(zhì)量，治療骨生長相關(guān)疾病，修復(fù)骨和關(guān)節(jié)的損傷[9]。

BMP2作為BMP家族中的一種亞型，在調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的過程中具有重要意義[10]。許多研究表明，BMP2表達(dá)降低或基因突變，可導(dǎo)致骨折、骨密度下降等骨相關(guān)疾病的發(fā)生。細(xì)胞膜表面分布著BMP受體，包括Ⅰ型受體（BMPRIA、BMPRIB和ACVRI）和Ⅱ型受體（BMPRII、ActRIIA和 ActRIIB）[11-12]。在BMP2刺激下，Ⅱ型受體被識別和激活，進(jìn)而募集Ⅰ型受體，Ⅰ型受體可活化下游R-Smad（包括Smad1、Smad5、Smad8）[13-14]。R-Smad與Smad4結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，調(diào)控骨發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。此外，BMP2還可以通過激活WNT/β-Catenin、MAPK/ERK等非經(jīng)典的通路調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)成軟骨、成骨信號，如軟骨分化轉(zhuǎn)錄因子Sox9、成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了BMP2的真核表達(dá)載體，并利用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)對其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，BMP2的過表達(dá)顯著促進(jìn)了R-Smad的磷酸化水平。上述結(jié)果為后續(xù)研究BMP2在骨發(fā)育中對干細(xì)胞分化的功能以及探討相關(guān)機(jī)制打下了重要基礎(chǔ)。

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Construction and BiologicalFunction Characterization of BMP2 Expression Plasmid

LAO Weia,DAI Jian-Ninga,JING Diao-Pingb,DENG Cai-Xiac,YANG Hai-Xua*
a.Department of Orthopedics;b.Department of Anesthesiology;c.Department of Hyperbaric Oxygen;the 5th Hos?pital of PLA,Yinchuan 750004,China
*Corresponding author,E-mail:bioyhx@126.com

Objective:To clone bone morphogenetic protein 2（BMP2） full length gene from mammal cells,and then construct and characterize the mammal expression vector.Methods:The total RNA was extracted from HeLa cells.Amplify BMP2 full length cDNA through RT-PCR with a pair of specific gene primers.Clone it into pcD?NA3.1 vector.The positive clone was selected and sequenced.Verify the biological function of BMP2 in mammal cells.Results:The 1100bp specific fragment was obtained by RT-PCR.After the molecular cloning and sequenc?ing,BMP2 over-expressed in mammal cells can induce the phosphorylation of Smad1/5/8.Conclusion:We con?stucted pcDNA3.1-BMP2 and confirmed its function.These data provide a basis of the mechanistic study of BMP2 function in bone development.

bone morphogenetic protein 2;mammal expression vector;Smad1/5/8

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）04-0506-04

2016-12-26

姥偉（1979- ），男，碩士，主治醫(yī)師，（E-mail）mulaowei@126.com

楊海旭，（E-mail）bioyhx@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.020