司曉光，張曉青，郝建安，姜天翔，杜瑾，楊波，張愛君，王靜

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

芽孢桿菌dhs-330-021對鏈狀亞歷山大藻的溶藻機理研究

司曉光，張曉青，郝建安，姜天翔，杜瑾，楊波，張愛君，王靜

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

目的：本實驗室通過轉(zhuǎn)座突變技術(shù)獲得了一株高產(chǎn)表面活性物質(zhì)的芽孢桿菌dhs-330-021，研究其對鏈狀亞歷山大藻的抑制效果，及其溶藻作用方式。方法：在鏈狀亞歷山大藻的培養(yǎng)液中添加dhs-330-021的發(fā)酵液等，間隔一定時間計數(shù)獲得藻細胞的數(shù)量。結(jié)果：菌株dhs-330-021培養(yǎng)后期的發(fā)酵液溶藻效果好于培養(yǎng)前期和中期；在一定濃度范圍內(nèi)，dhs-330-021的發(fā)酵液對不同生長期的鏈狀亞歷山大藻均有溶藻效果，其中對延滯期和穩(wěn)定期效果最好；菌株的發(fā)酵液和無菌上清液的溶藻效果明顯，而菌懸液溶藻效果較差。結(jié)論：菌株dhs-330-021能顯著抑制鏈狀亞歷山大藻的生長，其溶藻方式屬于間接溶藻。

鏈狀亞歷山大藻；芽孢桿菌；溶藻機理；表面活性劑

鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）是我國沿海常見的赤潮藻，是典型的產(chǎn)毒素甲藻，能分泌麻痹性貝毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）[1-2]。鏈狀亞歷山大藻體長20～50μm，寬 16～45μm，通常2、4或8個藻細胞以鏈狀形式存在，在暴發(fā)赤潮的水域藻細胞數(shù)可達106/L[3]。

赤潮生物的暴發(fā)不僅會破壞整個海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡，而且會對海洋經(jīng)濟生物產(chǎn)生危害，其分泌的貝毒素經(jīng)過食物鏈的傳遞進入人體，也會危害人體健康[4-5]。目前，赤潮防治主要包括物理、化學(xué)和生物方法，其中微生物防治因安全性好、成本低，應(yīng)用前景十分廣闊[6]。

微生物溶藻是溶藻菌通過直接或間接方式抑制藻類生長，或溶解藻細胞、殺死藻細胞的過程[7-8]。研究表明，某些細菌可以通過分泌胞外酶、表面活性物質(zhì)和抗生素等溶解性殺藻物質(zhì)殺死藻細胞，如枯草芽孢桿菌C1的培養(yǎng)液所含表面活性物質(zhì)可以顯著抑制銅綠微囊藻和魚腥藻的生長，對這2種水華藻的去除率達70％～80％[9-12]，從而表明這類細菌胞外活性物質(zhì)在赤潮調(diào)控上具有巨大潛力，其活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的鑒定，以及高效、大量制備技術(shù)必將是今后生物化治理赤潮的研究核心[13-15]。

本課題組前期分離獲得一株產(chǎn)表面活性劑的海洋芽孢桿菌，并通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建了高效產(chǎn)表面活性劑突變株，優(yōu)化了培養(yǎng)條件[16]。在此，我們進一步探討了其對典型赤潮藻——鏈狀亞歷山大藻的抑制作用，為赤潮海域的水質(zhì)凈化與處理提供一定的科學(xué)依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌dhs-330-021為本實驗室保存菌種，由dhs-330轉(zhuǎn)座突變庫篩選獲得，具有產(chǎn)表面活性物質(zhì)的特性；鏈狀亞歷山大藻購自上海光語生物科技有限公司，為典型赤潮藻。

dhs-330-021發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖32g（單獨滅菌），尿素 5.0g，酵母提取物 1.2g，Na2HPO4·12H2O 3.0g，KH2PO40.8g，MgSO4·7H2O 0.15g，微量元素溶液（CaCl27.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.0g/L，MnSO4·H2O 2.0g/L）1.0mL，定容至 1 L 并調(diào)整pH值為7.0，115℃滅菌30min。

鏈狀亞歷山大藻培養(yǎng)基（f/2培養(yǎng)基）：NaNO3（75.0g/L）1mL，NaH2PO4·H2O（5.0g/L）1mL，NaSiO3·9H2O（30.0g/L）1mL，微量元素溶液[FeCl3·6H2O 3.15 g，Na2EDTA ·2H2O 4.36 g，CuSO4·5H2O（9.8g/L）1mL，NaMoO4·2H2O（6.3g/L）1mL，ZnSO4·7H2O（22.0g/L）1mL，CoCl2·6H2O（10.0g/L）1mL，MnCl2·4H2O（180.0g/L）1mL，用水定容至1 L]1mL，維生素溶液[維生素B1200 mg，維生素 H（1.0g/L）1mL，維生素 B12（1.0g/L）1mL，用水定容至1 L]0.5mL，用過濾海水定容至1 L。

1.2 菌株dhs-330-021生長曲線測定

取100mL滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基加入250mL無菌三角瓶中，接種活化的dhs-330-021菌液，接種量1％，180r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，每隔6h取樣測定發(fā)酵液的吸光度和表面活性值。

1.3 鏈狀亞歷山大藻的生長周期測定

將活化的鏈狀亞歷山大藻接種于f/2培養(yǎng)基中，接種量5％，培養(yǎng)溫度22℃，光照強度2500 lx，光暗比12h∶12h，每天取樣用魯格試劑固定藻細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)，繪制生長曲線。

1.4 不同生長期發(fā)酵液的溶藻效果研究

按照測定的dhs-330-021生長曲線，取不同生長階段的發(fā)酵液，按2％加入處于對數(shù)生長期的鏈狀亞歷山大藻溶液中，空白組加入2％的dhs-330-021發(fā)酵液，每組設(shè)立3個平行。

1.5 菌株dhs-330-021對不同生長期藻的溶藻效果研究

取處于對數(shù)生長末期的菌株dhs-330-021的發(fā)酵液，按1.0％的終濃度，分別加入處于延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期的鏈狀亞歷山大藻液中，培養(yǎng)溫度 22℃，光照強度 2500 lx，光暗比12h∶12h，每隔24h取樣，并用血球計數(shù)器計數(shù)。

1.6 菌株dhs-330-021的溶藻作用方式研究

將菌株dhs-330-021接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h，取50mL發(fā)酵液，10 000r/min離心 15min，上清液經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾除菌，菌體沉淀用f/2培養(yǎng)基洗滌2～3次，并重懸于50mL f/2培養(yǎng)基。

本實驗共設(shè)置4個處理組，A組為發(fā)酵液，B組為無菌上清液，C組為菌懸液，D組為發(fā)酵培養(yǎng)基。將4組處理液分別按0.5％、1.0％、1.5％和2.0％添加到處于對數(shù)生長期的藻細胞培養(yǎng)液中，各組均設(shè)置3組重復(fù)。每隔24h取樣，用魯格試劑固定藻細胞，在顯微鏡下計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株dhs-330-021生長曲線

從圖1可以看出，菌株dhs-330-021的對數(shù)生長期為12～30h，而后進入穩(wěn)定期。由于dhs-330-021是一株產(chǎn)表面活性物質(zhì)的菌株，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)可以確定發(fā)酵液表面活性值的變化過程，進而可以分析對鏈狀亞歷山大藻細胞起溶藻作用的是dhs-330-021菌體本身還是菌體分泌的表面活性物質(zhì)。

2.2 鏈狀亞歷山大藻生長周期

活化的鏈狀亞歷山大藻接種于f/2培養(yǎng)基，生長曲線如圖2所示。接種后前3d為延滯期，藻細胞密度平穩(wěn)增加，而后進入9d左右的對數(shù)生長期，藻細胞密度迅速增加，達到最高的2.6×104/mL。實驗中發(fā)現(xiàn)接種量對鏈狀亞歷山大藻的生長有很大影響，接種量過小會增加藻細胞的延滯期，而且最大藻密度較低。為了研究過程中的一致，實驗中統(tǒng)一接種量為5％。

2.3 鏈狀亞歷山大藻與菌株dhs-330-021的不同生長期對溶藻效果的影響

由圖3A可知，與終濃度2％的培養(yǎng)基處理的對照組相比，用處于對數(shù)生長末期的dhs-330-021的發(fā)酵液能顯著降低藻細胞數(shù)量，菌株dhs-330-021的發(fā)酵液對不同生長期的鏈狀亞歷山大藻抑制效果不同，表現(xiàn)為對延滯期和穩(wěn)定期的藻細胞抑制效果強于處于對數(shù)生長期的藻細胞。以存活率（存活率=藻細胞終密度/藻細胞初始密度×100％）作為評價溶藻效果的依據(jù)，經(jīng)dhs-330-021發(fā)酵液處理后，延滯期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期藻細胞的存活率分別為6.25％、16.39％和9.19％，均有較強的抑制作用，但dhs-330-021對延滯期和穩(wěn)定期的藻細胞抑制效果明顯好于對數(shù)生長期。

圖1 菌株dhs-330-021生長曲線

圖2 鏈狀亞歷山大藻生長曲線

圖3 鏈狀亞歷山大藻與dhs-330-021的不同生長期對溶藻效果的影響

圖3B示不同培養(yǎng)階段（6、24、36h）的 dhs-330-021發(fā)酵液對藻細胞的抑制作用，分別代表了dhs-330-021的發(fā)酵初期、中期和后期。處于對數(shù)生長期的藻液經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)階段的發(fā)酵液處理后，藻細胞數(shù)量變化不同，隨著發(fā)酵液培養(yǎng)時間的增加，藻細胞的密度減小，經(jīng)36h的發(fā)酵液處理96h后藻細胞存活率僅為2.61％。表面活性劑具有較強的表面活性，可吸附在藻細胞表面，并與細胞膜的脂質(zhì)相互作用，破壞膜的完整性，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物滲出；同時可凝固細胞內(nèi)蛋白，致使酶和結(jié)構(gòu)蛋白變性，進而影響藻細胞的代謝，最終致其死亡[17-19]。菌株dhs-330-021是一株產(chǎn)表面活性物質(zhì)的菌株，隨著發(fā)酵時間的延長，菌株dhs-330-021分泌的表面活性物質(zhì)逐漸增多，抑藻效果相應(yīng)地逐漸增強。

dhs-330-021不同生長期的發(fā)酵液對鏈狀亞歷山大藻的溶解活性不同，延滯期活性較低，穩(wěn)定期活性最高，添加量越大溶藻活性越高；對處于不同生長期的鏈狀亞歷山大藻溶藻活性也不相同，延滯期和穩(wěn)定期的效果優(yōu)于對數(shù)生長期。

2.4 菌株dhs-330-021的溶藻效果圖

如圖4所示，鏈狀亞歷山大藻液經(jīng)dhs-330-021發(fā)酵液處理后，一部分藻細胞裂解死亡，還有一部分藻細胞保持完整，但也處于靜止狀態(tài)，而正常狀態(tài)下的藻細胞在顯微鏡下是運動的。實驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，隨著dhs-330-021作用時間的延長，完整藻細胞的數(shù)目逐漸減少，藻液原來的黃褐色也逐漸變淺、變渾濁。

2.5 菌株dhs-330-021的溶藻方式研究

由圖5可以看出，添加發(fā)酵培養(yǎng)基組對藻液中藻細胞的密度沒有影響，藻細胞呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢；添加發(fā)酵液和無菌上清液的藻液中藻細胞濃度均呈下降趨勢，經(jīng)過計算，處理96h后添加2％發(fā)酵液和2％無菌上清液的藻液中藻細胞的存活率分別為1.24％和1.96％；不同濃度的發(fā)酵液和無菌上清液對藻細胞的抑制程度不同，添加濃度越高，抑制效果越強。綜合以上可以說明對藻細胞有溶解作用的物質(zhì)存在于發(fā)酵上清液中。添加菌懸液的一組對藻細胞的抑制效果較差，只有在添加1.5％和2％時藻細胞的濃度才基本保持不變，說明dhs-330-021菌體本身對藻細胞的溶解作用較小。微生物溶藻主要有2種方式，即直接溶藻和間接溶藻[20-22]。直接溶藻，是指微生物通過直接接觸藻細胞，吸附或進入藻細胞內(nèi)從而進一步殺死藻細胞；間接溶藻，是指微生物不須與藻細胞直接接觸，通過與藻細胞競爭有限的營養(yǎng)或釋放特異性或非特異性的溶藻物質(zhì)殺死藻細胞[23-25]。本研究中的dhs-330-021能產(chǎn)生表面活性劑，其含有的疏水基團和親水基團能很好地與藻細胞膜相互作用，進而影響藻細胞的完整性，導(dǎo)致藻細胞死亡[26]。

圖4 菌株dhs-330-021對鏈狀亞歷山大藻的溶解效果

圖5 菌株dhs-330-021對鏈狀亞歷山大藻的作用方式

菌株dhs-330-021的溶藻活性物質(zhì)主要存在于胞外，其溶藻方式屬于間接溶藻；溶藻實驗表明，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵液或上清液濃度的增加，溶藻效果顯著提高。

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Lysing Mechanism of Bacillus sp.dhs-330-021 on Alexan?drium catenella

SI Xiao-Guang,ZHANG Xiao-Qing,HAO Jian-An,JIANG Tian-Xiang,DU Jin,YANG Bo,ZHANG Ai-Jun,WANG Jing*
Institute of Seawater Desalination and Multipurpose Utilization,State Oceanic Administration,Tianjin 300192,China
*Corresponding author,E-mail:Wang_nana@163.com

Objective:Bacterial strain dhs-330-021 was a high surfactivity strain obtained by transposon mutagen?esis technology in our lab,this study aims to explore the suppression effect and algicidal effect on Alexandrium catenella.Methods:The fermentation broth of dhs-330-021 was added into A.catenella culture.The numbers of al?gae cells were counted at certain times.Results:Strain dhs-330-021 had better algae-lysing effect of fermenta?tion broth in late stage than in earlier and middle stage.Within the certain range of concentration,the fermenta?tion broth of dhs-330-021 has the positive effect on A.catenella throughout growth period,especially in the lag phase and stationary phase.Compared with the poor effect that bacterial suspension had,both fermentation broth and sterile supernatant had evident algae-lysing effect.Conclusion:Strain dhs-330-021 inhibits A.catenella obvi?ously through an indirect algae-lysing process.

Alexandrium catenella;Bacillus sp;algae-lysing mechanism;surfactant

Q938

A

1009-0002（2017）04-0485-05

2016-12-19

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（K-JBYWF-2015-G17）；海洋公益性行業(yè)科研專項（201405017-04）；中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費團隊項目（K-JBYWF-2015-T11）

司曉光（1988- ），男，助理工程師，（E-mail）buburensheng@163.com

王靜，（E-mail）Wang_nana@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.015