楊丹，高鵬，李玉霞，凌焱，陳惠鵬

1.軍事醫(yī)學科學院 科技部，北京 100850；2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生勤務與醫(yī)學情報研究所，北京 100850

遺傳密碼子擴充系統(tǒng)表達載體及其穩(wěn)定細胞系的構建

楊丹1，高鵬1，李玉霞2，凌焱1，陳惠鵬1

1.軍事醫(yī)學科學院 科技部，北京 100850；2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生勤務與醫(yī)學情報研究所，北京 100850

目的：構建異源表達遺傳密碼子擴充系統(tǒng)的HeLa細胞系。方法：用PCR方法擴增MmBocRS、PyltRNA基因，定向克隆到Lenti-EF1α-Puro載體中，構建Lenti-EF1α-BocRS、Lenti-PyltRNA表達質(zhì)粒；在HEK293T細胞中進行病毒包裝，用獲得的慢病毒感染HeLa細胞，獲得BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株；分別應用實時定量PCR和Western印跡鑒定該穩(wěn)定細胞系中MmBocRS和PyltRNA的表達；利用轉染EGFP的琥珀突變體驗證BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株的功能。結果：酶切及測序表明Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA質(zhì)粒構建正確；實時定量PCR結果顯示BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株中PyltRNA的表達量顯著提高；Western印跡結果顯示BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株中MmBocRS基因的表達量明顯高于空白對照；轉染EGFP琥珀突變體結果表明，可以通過非天然氨基酸來控制EGFP的表達。結論：構建了能穩(wěn)定表達MmBocRS和PyltRNA的BocRS-tRNACUA細胞株，并實現(xiàn)了通過非天然氨基酸控制蛋白表達，為研究定點插入非天然氨基酸提供了細胞模型。

遺傳密碼子擴充；非天然氨基酸；慢病毒載體；穩(wěn)定細胞株

遺傳密碼子擴充技術是利用正交性氨酰tRNA合成酶-tRNA（tRNA/aaRS pairs）識別mRNA上的無義密碼子，并在其相應位點插入非天然氨基酸[1]。一些tRNA/aaRS pairs經(jīng)過演變已能編碼100多種非天然氨基酸[2]，這些非天然氨基酸通常都具有特殊的物理、化學或生物特性，因此實現(xiàn)非天然氨基酸插入的遺傳密碼子擴充技術已在蛋白質(zhì)研究中展現(xiàn)出豐富多樣的應用潛質(zhì)。如控制蛋白交聯(lián)反應，Chin等[3]在鈣調(diào)蛋白上分別引入含有疊氮基團和炔烴的非天然氨基酸，利用click reaction形成一個交聯(lián)三唑結構。與傳統(tǒng)蛋白環(huán)化形成重組蛋白相比，遺傳密碼子擴充技術可以在蛋白的任意位點實現(xiàn)，不再僅限于末端；遺傳密碼子擴充可以通過非天然氨基酸在蛋白的特定位點標記任意標簽[4]，這些標簽可以是熒光探針[5]、核磁共振探針[6]、紅外線探針[7]，甚至可以是一些細胞毒素類或生物素類的分子[5]，遺傳密碼子擴充的優(yōu)勢在于它可以把對蛋白結構的干擾降到最小，以避免影響蛋白的功能和定位。

為了方便遺傳密碼子擴充技術相關實驗的進行和探究，我們利用慢病毒載體構建表達遺傳密碼子擴充系統(tǒng)，并進一步得到了能夠?qū)崿F(xiàn)定點插入非天然氨基酸Boc-lysine的穩(wěn)定細胞株BocRS-tRNACUA，為遺傳密碼子擴充的應用搭建了一個平臺，為遺傳密碼子擴充實驗的開展提供了便利，也保證了實驗的時空一致性。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細胞293T和人宮頸癌細胞HeLa（均用含10％胎牛血清和1％青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d傳代一次），質(zhì)粒 Lenti-EF1α-Puro、pGP、pVSVG 和 pEG?FP-N1為本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株、膠回收試劑盒、細胞RNA提取試劑盒及Quant One Step qRT-PCR（SYBR Green）試劑盒購自天根生化科技有限公司；Q5超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BstBⅠ、BamHⅠ、ClaⅠ、XbaⅠ及T4DNA連接酶購自NEB公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、Anti Flag-Tag Mouse Monoclonal Antibody、AntiGAPDH MouseMonoclonalAnti?body和 Goat Anti-Mouse IgG（H+L） HRP Conju?gate購自康為世紀生物科技有限公司；胎牛血清、細胞培養(yǎng)基DMEM、OPTI-MEM、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司；TurboFect轉染試劑購自Thermo公司；非天然氨基酸Boc-lysine購自Bachem公司；MmBocRS（為方便后續(xù)檢測，在MmBocRS 5'端連有Flag）、PyltRNA基因序列來源于古生菌Methanosarcina mazei，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 質(zhì)粒載體構建及鑒定

PCR擴增MmBocRS片段，正向引物為5'-TG ATTCGAATTCGCCGCCACCATGGATAAAAAAC-3'，反向引物為5'-GCGGGATCCTTACAGGTTGGTAG-3'。將回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒Lenti-EF1α-Puro分別用BstBⅠ、BamHⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA膠回收試劑盒純化回收目的產(chǎn)物，再用T4DNA聚合酶連接構成重組質(zhì)粒Lenti-EF1α-BocRS，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

同理構建重組質(zhì)粒Lenti-PyltRNA。PCR擴增PyltRNA片段，正向引物為5'-CCCATCGATGATT CTTCATGCAATT-3'，反向引物為5'-CTAGTCTAG ACAAGGCTTGACCGAC-3'。用 ClaⅠ、XbaⅠ分別對回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒Lenti-EF1α-EGFP進行雙酶切。

1.3 慢病毒包裝

消化293T細胞制成單細胞懸液，根據(jù)實驗需要將適量細胞鋪至100mm皿中，待細胞密度達到 60％～80％時進行轉染。將0.86μg VSVG、1.72 μgGP、3.44 μg Lenti-EF1α-BocRS、12μL 100μmol/L的PEI一起加入1.33mL PBS中形成轉染復合物，將轉染復合物輕微吹打混勻后室溫孵育10min，直接加入鋪種的平皿中，輕輕搖動平皿，使轉染復合物均勻分布，將培養(yǎng)板置于 37℃、5％CO2恒溫孵箱培養(yǎng)，6～8h后更換為含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。分別于轉染后48和72h收集平皿中的培養(yǎng)上清，4℃、1200r/min離心10min除去細胞碎片，用0.45μm濾器過濾，過濾液再用Amicon Ultra-15 50K于4℃、5000r/min離心20min，得慢病毒液Lenti-EF1α-BocRS，分裝后于-80℃保存或立即使用。同樣步驟得到慢病毒液Lenti-PyltRNA。

1.4 慢病毒液感染HeLa細胞系

感染前1d將HeLa細胞鋪至12孔板，當細胞密度達80％左右時，取慢病毒液Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA共同感染HeLa細胞。感染時，在含有病毒的培養(yǎng)上清中加入聚凝胺（polybrene）至終濃度為6μg/mL以提高病毒感染效率。感染24h后，棄去感染孔中培養(yǎng)基，換上500μL新鮮的完全培養(yǎng)基；感染48h時進行藥篩，把孔內(nèi)培養(yǎng)基換為含嘌呤霉素（終濃度為3μg/mL）的培養(yǎng)基進行篩選，將感染并篩選后的細胞傳代，并繼續(xù)施加嘌呤霉素進行維持性篩選培養(yǎng)；連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保留BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株。

1.5 實時定量PCR檢測PyltRNA的表達

從細胞中提取RNA，定量，取10ng RNA為模板，用實時定量PCR儀檢測BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株中PyltRNA的表達。PCR上游引物為5'-T CATGTAGATCGAACGGAC-3'，下游引物為5'-GA ATCTAACCCGGCTGAA-3'。以GAPDH基因為內(nèi)參，上游引物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCC A-3'，下游引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3'。用 2-ΔΔCt分析基因的相對表達量。

1.6 Western印跡檢測MmBocRS的表達

棄掉細胞里的培養(yǎng)基，用PBS洗一次，棄掉，用裂解液裂解，冰浴30min，12 000r/min離心10min，取上清與6×上樣緩沖液混勻，煮沸5min。蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE分離后電轉移至NC膜，用5％脫脂牛奶封閉液封閉1h；加 入一 抗AntiFlag-Tag Mouse MonoclonalAntibody（1∶2000）、Anti GAPDH Mouse Monoclonal Antibody（1∶2000），室溫溫育2h或4℃溫育過夜；用TBST洗膜3次，每次10min；加入相應的二抗Goat An?ti-Mouse IgG（H+L） HRP Conjugate，室溫溫育 1h；用TBST洗膜3次，每次10min；ECL顯影。

1.7 質(zhì)粒轉染穩(wěn)定細胞株

將pEGFP-N1質(zhì)粒上39Tyr突變?yōu)殓昝艽a子TAG，正向引物為5'-GCGATGCCACCTAGGGCAA GCTGAC-3'，反向引物為5'-GTCAGCTTGCCCTA GGTGGCATCGC-3'，得到突變體質(zhì)粒pEGFP-N1-UAG。轉染前1d將細胞BocRS-tRNACUA鋪至12孔板，當細胞密度達80％左右時進行轉染。將1μg pEGFP-N1-UAG與2μL TurboFect一起加入100μL OPTI-MEM中形成轉染復合物，輕微吹打混勻后室溫孵育10min，直接加入鋪種的平板中，輕輕搖動平板，使轉染復合物均勻分布，將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，6h后更換為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，其中一個孔含1mmol/L Boc-lysine。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體的構建

從連接產(chǎn)物轉化的平板上挑取重組慢病毒載體的單克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），與預期的全長基因大小吻合，進一步測序表明重組慢病毒載體Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA構建成功。

2.2 實時定量PCR檢測穩(wěn)定細胞株中PyltRNA的表達

利用實時定量PCR檢測BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株中PyltRNA的表達量。表1結果顯示，與HeLa細胞相比，BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞的Pyl?tRNA表達量顯著提高。說明穩(wěn)定細胞株可以穩(wěn)定提供遺傳密碼子擴充系統(tǒng)中的正交性tRNA。

2.3 Western印跡檢測穩(wěn)定細胞株中BocRS的表達

將BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞和HeLa細胞分別加入適量裂解液提取蛋白，用上清液進行SDSPAGE，Western印跡檢測 BocRS（BocRS 5'端連有Flag）的表達（圖2），結果顯示2組細胞在GAPDH大小處均出現(xiàn)了明顯條帶，穩(wěn)定細胞株用Flag抗體能檢測到明顯的特異條帶，而對照HeLa細胞無條帶。說明構建的穩(wěn)定細胞株能穩(wěn)定表達遺傳密碼子擴充系統(tǒng)中的正交性氨酰tRNA合成酶。

2.4 驗證穩(wěn)定細胞株插入非天然氨基酸的功能

為檢測構建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株是否能通過添加非天然氨基酸來控制目的蛋白的表達，將pEGFP-N1的39Tyr突變?yōu)殓昝艽a子TAG，測序結果如圖3。將pEGFP-N1的琥珀突變體轉染BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株，6h后將一孔內(nèi)的培養(yǎng)基換為含1mmol/L Boc-lysine的10％胎牛血清DMEM，另外一孔換為新鮮的10％胎牛血清DMEM，轉染24h后鏡下觀察結果。由圖4可知，只有在Boc-lysine存在的情況下pEGFP-N1的琥珀突變體才能表達綠色熒光蛋白，表明構建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株確實可以實現(xiàn)遺傳密碼子擴充。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖2 Western印跡檢測BocRS的表達

3 討論

正交性氨酰tRNA合成酶-tRNA對于實現(xiàn)遺傳密碼子擴充是必不可少的，通常都是利用瞬時轉染技術把它們轉染到細胞內(nèi)。但瞬時轉染對于某些特定細胞的遞送效率很低甚至不能實現(xiàn)，而且每次轉染受細胞狀態(tài)、細胞密度及實驗操作者經(jīng)驗的影響較大，不利于保證每次試驗的時空一致性。因此，發(fā)展出了病毒載體來構建遺傳密碼子擴充系統(tǒng)。使用病毒載體不僅能在常規(guī)的細胞系中實現(xiàn)遺傳密碼子擴充，甚至能在神經(jīng)元細胞、胚胎干細胞及胚胎成纖維細胞中實現(xiàn)遺傳密碼子擴充。Schultz[8]等用桿狀病毒表達載體實現(xiàn)了利用遺傳密碼子擴充系統(tǒng)插入非天然氨基酸，雖然桿狀病毒具有大的基因容載量，但慢病毒載體更常見，應用更為廣泛。

圖3 pEGFP-N1琥珀突變體測序結果

圖4 BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株轉染結果

表1 實時定量PCR檢測穩(wěn)定細胞株和HeLa細胞中PyltRNA表達水平

遺傳密碼子擴充技術在病毒領域也得到了廣泛應用，如Guo[9]探索了在HIV基因組中用遺傳密碼擴充技術制新型疫苗；Chen和Li[10]通過在丁肝病毒表面插入非天然氨基酸實現(xiàn)了熒光分子標記和示蹤等。由于病毒的特殊性，不同病毒的生活周期差異很大，如果采用瞬時轉染技術，不好控制正交性氨酰tRNA合成酶-tRNA的表達和病毒擴增之間的時間關系，而我們構建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株可以避免這個問題。

由實驗結果可知BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株能穩(wěn)定表達正交性MmBocRS及正交性Pyl?tRNACUA，并且該穩(wěn)定細胞株為Boc-lysine依賴，符合遺傳密碼子擴充系統(tǒng)的要求。綜上所述，我們構建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細胞株可以作為遺傳密碼子擴充系統(tǒng)應用的一個工具細胞，為遺傳密碼子技術的開展提供了便利。

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Construction of Genetic Codon Expansion Expression Vec?tor and Stably Transfected Cells

YANG Dan1,GAO Peng1,LI Yu-Xia2,LING Yan1*,CHEN Hui-Peng1*
1.Department of Science and Technology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;2.Institute of Health Service and Medical Information,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China
*Co-corresponding authors,CHEN Hui-Peng,E-mail:chenhp0909@163.com;LING Yan,E-mail:lingyanbeijing@163.com

Objective:To establish a HeLa cell line heterologous-expressing orthogonal aminoacyl-tRNA synthe?tase/transfer RNA（tRNA） pairs.Methods:MmBocRS and PyltRNA genes were amplified by PCR and cloned into Lenti-EF1α-Puro vector to construct Lenti-EF1α-BocRS and Lenti-PyltRNA expression plasmids.Virus packaging was carried out in HEK293T cells.HeLa cells were infected with the obtained lentivirus to obtain BocRS-tRNACUAstably transfected cells.The expression of MmBocRS and PyltRNA in the stably transfected cells were identified by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.The function of BocRS-tRNACUAstably transfected cells was examined by transfected amber mutant of EGFP.Results:Lenti-EF1α-BocRS and Lenti-PyltRNA plas?mids were constructed correctly.The results of RT-PCR showed that the expression of PyltRNA in BocRS-tRNACUAstably transfected cells was enhanced.Western blotting showed that the expression of MmBocRS gene in the stably transfected cells was significantly higher than in the blank control group.Transfection of EGFP amber mutant revealed that EGFP expression was controlled by unnatural amino acids.Conclusion:The BocRS-tRNACUAcell line stably expressing MmBocRS and PyltRNA was constructed and the expression of the protein was con?trolled by unnatural amino acid.It provided a cellular model for studying the insertion of non-natural amino acids.

genetic codon expansion;unnatural amino acids;lentivirus vector;stably transfected cells

Q78

A

1009-0002（2017）04-0410-05

2017-01-24

兩用生物技術威脅評估（2016YFC1202400）

楊丹（1992- ），女，碩士研究生，（E-mail）science112233@163.com

陳惠鵬，（E-mail）chenhp0909@163.com；凌焱，（E-mail）lingyanbeijing@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.002