叢宇婷 胡良海 葉明亮 顧景凱 鄒漢法

1(吉林大學生命科學學院，長春 130012)2(中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室，大連116023)

基于質(zhì)譜技術(shù)的貝伐珠單抗及其糖基化修飾的表征、定量與藥代動力學分析

叢宇婷1,2胡良海*1葉明亮2顧景凱1鄒漢法2

1(吉林大學生命科學學院，長春 130012)2(中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室，大連116023)

利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)以及Shot-gun蛋白質(zhì)組學策略對貝伐珠單克隆抗體藥物及其糖基化修飾進行了全面表征，共發(fā)現(xiàn)17種糖型并確定了特征肽段序列。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用平行反應(yīng)檢測模式，通過測定單抗水解后產(chǎn)生的特征肽段，實現(xiàn)了對大鼠血漿樣品中單抗藥物含量的絕對定量分析，獲得不同給藥計量下的貝伐珠單抗的藥物濃度-時間曲線，同時實現(xiàn)了對單抗糖基化修飾各糖型的相對定量分析。本實驗首先建立標準工作曲線，對大鼠血漿樣品中的貝伐珠單抗進行定量分析，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，定量限為66 fmol，線性關(guān)系良好。對大鼠血漿樣品的測定結(jié)果表明，高、低計量給藥的貝伐珠單抗藥物濃度-時間曲線趨勢基本一致，濃度均為直接下降，與理論趨勢相符。但是大多數(shù)糖型呈現(xiàn)濃度先上升的現(xiàn)象，之后的代謝情況因糖型差異而有所不同。

貝伐珠單抗; 糖基化修飾; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用; 平行反應(yīng)監(jiān)測; 藥代動力學

2017-03-20收稿；2017-09-07接受

本文系國家自然科學基金項目 (No. 81373374)資助

1 引 言

治療性單克隆抗體藥物(Therapeutic monoclonal antibody， mAb; 以下簡稱單抗藥物)是一類以γ型免疫球蛋白G為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的大分子蛋白類藥物，為多種疾病的治療提供了全新的途徑[1,2]。貝伐珠單抗是一種重組的人源化單克隆抗體藥物，可選擇性地與人血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)結(jié)合并阻斷其生物活性，用于治療直腸癌[3]。貝伐珠單抗藥物的序列已知，分子量約為149 kDa，其中輕鏈分子量約為23 kDa，重鏈分子量約為49 kDa。作為復(fù)雜的大分子糖蛋白藥物，單抗藥物兩條重鏈的Fc片段上297位的天冬氨酸(Kabat編號Asn297)上具有一個高度保守的N-糖基化修飾位點[4]。其N-糖基化修飾通常是復(fù)雜的雙天線糖鏈結(jié)構(gòu)，可能發(fā)生巖藻糖化和唾液酸化。大量研究表明，單抗藥物的N-糖基化修飾對其穩(wěn)定性、清除率、免疫原性、抗體依賴細胞毒性(Antibody-dependent cellular cytotoxicity， ADCC)及補體依賴細胞毒性(Complement-dependent cytotoxicity， CDC)等都有一定的影響[5]。例如，缺少核心巖藻糖的糖型能夠增強對FcγRIIIа受體的親和力，從而提高ADCC[6]; 而高水平的唾液酸化的糖型則會減少對FcγRIIIа受體的親和力，從而降低ADCC[7]。因此，建立穩(wěn)定可靠的分析方法，進行單抗藥物及其糖基化修飾的藥代動力學及藥效動力學研究具有重要意義。

傳統(tǒng)的蛋白類藥物的藥代動力學研究多采用酶聯(lián)免疫吸附方法(Enzyme-linked immunosorbent assays， ELISA)[8,9]。盡管該技術(shù)為蛋白定量分析提供了一種簡單、靈敏、高通量的方法，但仍存在很多局限性，如研制周期長、成本高、無法區(qū)分內(nèi)源性干擾以及存在交叉反應(yīng)等，并且難以用于對翻譯后修飾的研究[10,11]。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)逐步成為蛋白質(zhì)定量的高靈敏度、高特異性、高通量以及重現(xiàn)性好的分析方法，其中多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring，MRM)技術(shù)通過兩次離子選擇，極大地降低了背景噪聲，從而提高了分析方法的靈敏度和重現(xiàn)性，已成為蛋白質(zhì)定量的重要手段[12]。此外，MRM方法在糖基化修飾定量研究中也展現(xiàn)出極大優(yōu)勢。Toyama等[13]建立了一種通過“能量依賴型”氧鎓離子監(jiān)測模式對單抗藥物的N-糖型進行定量表征的方法，系統(tǒng)研究了質(zhì)譜能量與N-糖鏈氧鎓離子碎裂情況之間的關(guān)系，實現(xiàn)了對N-糖鏈的定量表征，糖肽的檢出限為30 amol，線性范圍達4個數(shù)量級，并可區(qū)分糖鏈的同分異構(gòu)體。該研究為單抗藥物的N-糖型的定量研究提供了新思路。Hong等[14]利用MRM策略同時對IgG蛋白及其N-糖型進行絕對定量分析，IgG蛋白的檢出限為60 amol，檢測動態(tài)范圍達3個數(shù)量級，對IgG蛋白進行絕對定量分析的同時，可在不經(jīng)過富集的情況下直接對血清中26種高豐度N-糖肽進行測定。近年出現(xiàn)的四極桿-靜電場軌道阱(Q-Orbitrap)高分辨質(zhì)譜儀提供了另一個類似MRM的選擇—平行反應(yīng)監(jiān)測(Parallel reaction monitoring，PRM)模式。PRM與MRM的不同之處在于，第3個四極桿被高分辨率、高質(zhì)量精度的Orbitrap質(zhì)量分析器代替，它可在單次分析中檢測所有的碎片離子，因此稱為平行反應(yīng)監(jiān)測[12,15,16]。盡管PRM策略已成功用于蛋白定量研究中[17,18]，但目前尚無PRM策略用于單抗藥物分析的相關(guān)報道。

本研究基于PRM技術(shù)，建立了一種可同時對單抗藥物及其糖基化修飾的定性與定量質(zhì)譜分析方法，并應(yīng)用于藥代動力學研究中。本研究為蛋白類藥物的藥代動力學研究提供了新方法，為糖蛋白藥物的糖基化修飾研究提供了新思路，并且為藥物研發(fā)和臨床安全用藥的研究提供了新的途徑和理論依據(jù)。

2 實驗部分

2.1儀器與試劑

AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); Protein IEF Cell垂直電泳儀(美國Bio-Rid公司); Thermo Q-Exactive質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)，配有納升級電噴霧離子源，Xcalibur 2.1數(shù)據(jù)處理軟件以及Thermo Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng); 恒溫振蕩器、離心濃縮儀(美國Thermo公司); UMAX PowerLook2100xl掃描儀(中國力廣科技股份有限公司)。

貝伐珠單抗(100 mg/4 mL)購自本地藥店; 穩(wěn)定同位素標記的特征肽段FTFSLDTSK*(*所示為同位素13C，15N標記的賴氨酸)購自北京中科亞光生物科技有限公司; 肽糖苷酶F(PNGase F，美國New England Biolabs公司); 尿素(Urea，加拿大Bio Basic公司); 乙腈(ACN，色譜純，德國Merck公司); 胰蛋白酶、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、過硫酸銨(AP)、3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(SA)、甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)均購自美國Sigma公司; 四甲基乙二胺(TEMED，美國Fluka公司); 還原SDS-PAGE供試品緩沖液(5×)、40%丙烯酰胺溶液(美國Thermo公司); 考馬斯亮藍G250(美國Bio-Rad公司); 固相萃取柱(10 mg，美國Waters公司); 實驗用水為超純水Milli-Q系統(tǒng)(美國Milipore公司)制備的超純水。

2.2色譜與質(zhì)譜條件

實驗室自制毛細管C18trap柱(5 cm×200 μm); 自制電噴霧噴針的C18色譜柱(15 cm×75 μm); 流動相A：H2O-FA(100∶0.1，V/V); 流動相B：ACN-H2O-FA(80∶20∶0.1，V/V); 梯度洗脫： 0～10 min，96% A; 10～11 min，96%～92% A; 11～100 min，92%～55% A; 100～105 min，55～10% A; 105～113 min，10% A; 113～115 min，10～96% A; 115～130 min，96% A。流速：300 nL/min。

正離子反應(yīng)模式; 平行反應(yīng)監(jiān)測模式; 1次全掃加10次目標掃描為1個循環(huán); 全掃掃描范圍為m/z400～2500，分辨率為70000，自動增益設(shè)為1×106，最大注入時間為50 ms; 目標掃描分離窗口為±1， 分辨率為35000，自動增益設(shè)為1×106，最大注入時間為200 ms。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3數(shù)據(jù)處理

酶解考察：用Proteome Discoverer 1.3軟件(美國Thermo公司)將Q-Exactive質(zhì)譜儀采集生成的*.raw文件轉(zhuǎn)成*.mgf文件，然后通過Mascot Daemon 2.3.0搜索引擎(英國Matrix Science公司)進行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫為自建貝伐珠單抗數(shù)據(jù)庫，參數(shù)設(shè)置如下：質(zhì)量容忍度母離子為10 ppm，碎片離子為0.05 Da; 肽段需符合胰蛋白酶半酶切限制，最多允許兩個漏切位點; 半胱氨酸設(shè)為固定修飾(Carboxyamidomethylation，57.0215); 甲硫氨酸設(shè)為可變修飾(Oxidized methionine，15.9949 Da); 導出肽段有效閾值p<0.01，打分值Score>10，最終獲得*.csv搜庫結(jié)果文件。

糖基化修飾表征：將去糖基化樣品的*.raw文件采用上述方式通過貝伐珠單抗數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)檢索得到*.csv文件，可變修飾設(shè)置中增加天冬酰胺脫酰胺化(Deamidated asparagine，0.9840 Da)，其它

表1 貝伐珠單抗特征肽段、內(nèi)標序列及其糖基化位點所在肽段EEQYN*STYR對應(yīng)的各糖肽在PRM模式下的質(zhì)譜條件

Table 1 Sequences of selected specific peptide and internal standard peptide for bevacizumab and constitutions of its glycoforms of peptide EEQYN*STYR and their parameters for parallel reaction monitoring (PRM) analysis

序號No．糖型/序列Glycoform/Sequence前體離子Precursorion(m/z)電荷數(shù)Charge提取離子Extractedion(m/z)碰撞能量NCE(%)1H3N31142．9621392．58252H4N41325．5221392．58253H3N41244．5021392．58254H4N3F11297．0121392．58255H4N4F11398．5521392．58256H3N3F11215．9921392．58257H3N4F1878．6931392．58258H3N5F1946．3831392．58259H5N21203．4721392．582510H6N21284．5021392．582511H5N4F1986．7231392．582512H8N2964．7031392．582513H5N51005．7231392．582514H4N3F1S1962．0431392．582515H5N3F1919．0231392．582516H6N3F11459．0621392．582517H4N51427．0621392．582518FTFSLDTSK523．262797．392819FTFSLDTSK?526．882805．4125

相同。然后通過ArMone 2.0軟件將*.csv文件轉(zhuǎn)為*.ppl文件。同時將貝伐珠單抗酶解樣品的*.raw文件通過MS Convert軟件轉(zhuǎn)為*.mzXML文件。最后，將生成的*.ppl文件與*.mzXML文件一同導入ArMone軟件，進行自動搜庫匹配，獲得糖基化修飾結(jié)果。

2.4給藥方案及血漿樣品采集

取雄性大鼠兩只，重量為(200±20) g，自由飲食、飲水，分別按照50和10 mg/kg的高、低劑量進行尾部靜脈推注給藥。

采取大鼠眼眶靜脈叢采血方式，對兩組劑量大鼠分別按給藥前(0 h)和給藥后0.5、1、2、4、8、12、24、32 h采集血液1 mL于肝素化1.5 mL離心管中， 4℃ 15000 r/min離心5 min，然后于80℃冷凍保存，待測。

2.5貝伐珠單抗標準系列溶液及內(nèi)標肽段溶液的配制

取適量貝伐珠單抗儲備液(25 μg/μL)，用水分別稀釋得到貝伐珠單抗標準系列溶液，濃度為1.2、1.0、0.5、0.1、0.04、0.01和0.005 μg/μL，于20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量內(nèi)標肽段儲備液(5.0 μg/μL)，用水稀釋配制成終濃度為0.01 μg/μL的內(nèi)標肽段溶液。

2.6標準曲線樣品的制備

分別取4 μL貝伐珠單抗標準系列溶液置于2 mL離心管中，加入4 μL大鼠空白血漿、188 μL變性緩沖液(50 mmol/L HEPES，8 mol/L Urea，pH 8.0)、4 μL DTT(1 mol/L)，渦旋混勻，60℃恒溫振蕩1 h。加入1.5 mg固體IAA，渦旋混勻，避光，25℃恒溫振蕩40 min。加入1.4 mL緩沖液(50 mmol/L HEPES，pH 8.0)，渦旋混合，再加入6 μL胰蛋白酶溶液(2 μg/μL)，渦旋混合，37℃恒溫振蕩15 h。加入10 μL FA溶液，終止反應(yīng)。加入20 μL 內(nèi)標肽段溶液(0.01 μg/μL)，渦旋混勻。將上述得到的酶解液通過固相萃取去除鹽等雜質(zhì)，用1.2 mL ACN-H2O-TFA(80∶20∶0.1，V/V)溶液洗脫，收集洗脫液，離心，凍干。加入200 μL 0.1% FA溶液復(fù)溶，得到標準曲線樣品，取2 μL進樣進行質(zhì)譜分析。

2.7大鼠血漿樣品的酶解

分別取4 μL各時間點大鼠血漿樣品置于2 mL 離心管中，加入192 μL變性緩沖液(50 mmol/L HEPES， 8 mol/L Urea， pH 8.0)， 4 μL 1 mol/L DTT， 渦旋混勻， 60℃恒溫振蕩1 h。 其余步驟同上。

3 結(jié)果與討論

3.1單抗序列和糖基化分析

基于Top-down的蛋白質(zhì)組學策略，對貝伐珠單抗及其糖基化修飾進行了完整表征。首先，通過MALDI-TOF MS技術(shù)，在完整蛋白水平對貝伐珠單抗的分子量及糖基化修飾情況進行了檢測。如圖1A所示，測得的完整貝伐珠單抗蛋白的分子量均約為150 kDa，與理論值相符。此外，譜圖中在76 kDa的峰為單抗的二價分子離子峰。去糖基化的貝伐珠單抗蛋白的測定結(jié)果如圖1B所示，測得的去糖基化貝伐珠單抗蛋白的分子量均約為147 kDa，與理論值相符。圖1B中在74 kDa處同樣有一個峰，同樣為單抗的二價離子峰。去糖基化后的蛋白及片段的分子量均比未經(jīng)過去糖基化的低2～4 kDa，這與單抗藥物常見糖基化的幾種糖型分子量一致[5,13,19]。

圖1 貝伐珠單抗的MALDI譜圖(A)完整貝伐珠單抗; (B)去糖基化貝伐珠單抗Fig.1 MALDI-TOF-MS spectra of (A) intact bevacizumab and (B) deglycosylated bevacizumab

圖2 貝伐珠單抗SDS-PAGE電泳圖。M： 蛋白質(zhì)marker; A： 貝伐珠單抗; B： 去糖基化貝伐珠單抗; C： 貝伐珠單抗輕重鏈; D： 去糖基化貝伐珠單抗輕重鏈Fig.2 Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) map of anti-bevacizu monoclonal (bevacizumab). M: protein marker; A: bevacizumab; B: deglycosylated bevacizumab; C: light chains and heavy chains of bevacizumab; D, light chains and heavy chains of deglycosylated bevacizumab

同時，利用SDS-PAGE技術(shù)，對貝伐珠單抗完整蛋白及其糖基化修飾和貝伐珠單抗輕重鏈及其糖基化修飾進行了表征。在進行完整蛋白的表征時，為了保持蛋白完整性，采取變性非還原SDS-PAGE對其進行考察，即選擇非還原上樣緩沖液; 而在對輕重鏈進行表征時，選擇還原上樣緩沖液，通過緩沖液中的DTT將二硫鍵打開。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示，A、B分別為基于變性非還原電泳的完整貝伐珠單抗及其去糖基化條帶，仔細觀察可以發(fā)現(xiàn)，A條帶略寬于B條帶，這主要是由于糖基化修飾導致的微觀不均一性引起的。此外，B條帶略靠前，這是由于去糖基化后分子量減小的緣故，但是由于減少的部分只占完整蛋白分子量中比例很小，因此條帶距離差異并不明顯。條帶C、D分別為基于變性還原電泳的貝伐珠單抗輕重鏈及其去糖基化的條帶。C和D中均在50及25 kDa附近有條帶，對應(yīng)其重鏈和輕鏈，與理論結(jié)果一致。C和D中的輕鏈條帶幾乎無差別，貝伐珠單抗的輕鏈并沒有N-糖基化修飾，因此無論是否經(jīng)過去糖基化處理，輕鏈的分子量應(yīng)該無明顯差別，顯示結(jié)果與理論相符。C和D中的重鏈結(jié)果差別明顯，C中重鏈的條帶明顯寬于D中的，并且D中重鏈的條帶明顯比C更靠前，這均與糖基化修飾相關(guān)。糖基化修飾導致的微觀不均一性使C中重鏈的條帶更寬，而去糖基化后分子量減小使D中重鏈的條帶更靠前。而相對于完整單抗蛋白而言，糖基化修飾占重鏈的比例更大，因此C、D中重鏈之間的距離比A、B中條帶的距離更大。

采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對貝伐珠單抗藥物的胰蛋白酶酶解肽段進行考察，結(jié)果見圖3A; 通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得酶解肽段信息，結(jié)果如圖3B和3C所示，輕鏈序列覆蓋率98%，重鏈序列覆蓋率86%。沒有覆蓋的肽段主要是由于長度或者氨基酸殘基缺失等原因?qū)е码y以檢測。

圖3 貝伐珠單抗胰蛋白酶酶解：(A)色譜圖; (B)輕鏈覆蓋率(98%); (C)重鏈覆蓋率(86%)Fig.3 (A) Chromatogram of trypsin digestion of bevacizumab; Coverage of (B) light chain (98%) and (C) heavy chain (86%). Bold sequences are matched sequences

同時，結(jié)合胰蛋白酶酶解、PNGase F去糖基化和ArMone搜庫策略，對貝伐珠單抗的N-糖基化修飾進行了全面表征。PNGase F酶可將N-鏈接糖鏈從天冬酰胺脫落，同時天冬酰胺被轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，使肽段分子量增加0.98 Da，從而實現(xiàn)對糖基化修飾位點的檢測[20]。ArMone是一個高通量的完整N-糖肽分析軟件平臺，用于糖基化修飾位點以及糖鏈結(jié)構(gòu)的分析。該軟件通過結(jié)合去糖基化的肽段檢測得到的糖基化位點所在肽段信息以及完整糖肽的檢測得到糖鏈結(jié)構(gòu)信息，最終給出完整糖肽的序列、糖鏈結(jié)構(gòu)以及糖基化位點信息[21]。通過該策略確定單抗的糖基化位點位于重鏈的第303位天冬氨酸殘基(*所示)，所在肽段序列為EEQYN*STYR。共表征到圖4所示的17種糖型。

圖4 貝伐珠單抗17種糖型的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Structure diagram of 17 kinds of glycoforms of bevacizumab N-乙酰葡糖胺(H)； 甘露糖(N) ； 半乳糖(N) ； 巖藻糖(F)； 唾液酸(S)。 N-Acetyl glucosamine; Mannose； Galactose; Fucose; Sialic acid.

3.2單抗藥物及其糖基化修飾的藥代動力學分析

特征肽段的選擇是建立可靠的、重現(xiàn)性好的定量方法的基礎(chǔ)，根據(jù)特征肽段的篩選原則，本研究采用理論篩選與實際檢測相結(jié)合策略進行特征肽段的篩選，最終確定貝伐珠單抗的特征肽段序列為FTFSLDTSK(重鏈的68～86位，分子量為1044.5129 Da)。根據(jù)對大鼠實際樣品的預(yù)實驗結(jié)果確定標準曲線的濃度范圍，通過對一系列不同濃度的貝伐珠單抗進行酶解，同時加入等量的空白血漿同步酶解提供基質(zhì)環(huán)境，并引入合成的穩(wěn)定同位素標記的肽段做內(nèi)標，建立貝伐珠單抗的大鼠血漿標準曲線。以待測物(即特征肽段)在血漿中的濃度為橫坐標，待測物色譜圖峰面積與內(nèi)標肽段色譜圖峰面積的比值為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，得到的線性回歸方程即為大鼠血漿標準曲線，R2=0.998，定量限為33 fmol/μL，最低在柱樣品量為1.3 fmol，線性關(guān)系良好。

本研究分別采用10和50 mg/kg兩個劑量對大鼠進行靜脈推注給藥，通過標準曲線測得各采血時間點的血漿藥物濃度，得到高、低劑量貝伐珠單抗的藥物濃度-時間曲線(圖5)。兩個劑量下的貝伐珠單抗藥物濃度-時間曲線趨勢基本一致，濃度均是直接下降，與靜脈推注給藥的理論趨勢一致。此外，在低劑量實驗中，當濃度降為0.2 mg/mL時有一個明顯的延緩趨勢，而降到0.1 mg/mL時再次出現(xiàn)平緩降低的趨勢，并且之后一直保持比較平緩的下降趨勢。高劑量實驗中，濃度降到0.5 mg/mL時出現(xiàn)了延緩趨勢，濃度降到0.2 mg/mL時同樣出現(xiàn)了一個延緩趨勢，此結(jié)果與低劑量實驗一致。

圖5 貝伐珠單抗鼠血漿藥物濃度-時間曲線(A)高劑量(50 mg/kg)實驗; (B)低劑量(10 mg/kg)實驗Fig.5 Blood concentration-time curves of bevacizumab after administration of a single intravenous (A) 50 mg/kg and (B) 10 mg/kg dose with rats

采用此方法在對貝伐珠單抗藥物進行絕對定量分析的同時，可實現(xiàn)對其糖基化修飾的相對定量分析。以峰面積代表其相對含量，得到高、低劑量大鼠給藥后血漿中17種糖基化修飾的變化情況。結(jié)果表明(圖6)，在高劑量給藥大鼠血漿中，所有糖型均能檢測到，其中H3N3、H4N4、H3N4、H4N3F1、H4N4F1、H3N3F1、H3N4F1、H3N5F1、H5N2、H6N2和H5N4F1等糖型在整體上均是先上升后下降，在下降過程中會出現(xiàn)短暫的平緩趨勢，然后再次下降時會有延緩趨勢。H8N2、H5N5、H4N3F1S1和H5N3F1等糖型在整體上的變化情況比較一致，均是先上升，不同的是，在第一次下降之后，均出現(xiàn)了至少一次的再次上升趨勢。H6N3F1和H4N5兩種糖型，均是先下降然后出現(xiàn)了兩次顯著上升的情況。而低劑量給藥大鼠中，四種糖基化修飾的血漿濃度隨時間變化趨勢與高劑量吻合，對比結(jié)果如圖6所示，其余的糖型則因為含量低而難以分析整體變化趨勢。在糖肽的變化過程中，2 h內(nèi)普遍存在上升趨勢，這與單抗藥物本身的變化過程不一致，目前尚無文獻報道該現(xiàn)象，推測可能是糖基化影響了單抗藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運。

圖6 貝伐珠單抗4種糖基化修飾的血漿濃度-時間曲線高低劑量對比結(jié)果: A: 50 mg/kg H4N4F1; B: 10 mg/kg H4N4F1; C: 50 mg/kg H3N4F1; D: 10 mg/kg H3N4F1; E: 50 mg/kg H5N2; F: 10 mg/kg H5N2; G: 50 mg/kg H5N4F1; H: 10 mg/kg H5N4F1Fig.6 Comparison results of blood concentration-time curves of 4 glycoforms of bevacizumab after administration of a single intravenous 50 mg/kg and 10 mg/kg dose with rats. A: 50 mg/kg H4N4F1; B: 10 mg/kg H4N4F1; C: 50 mg/kg H3N4F1; D: 10 mg/kg H3N4F1; E: 50 mg/kg H5N2; F: 10 mg/kg H5N2; G: 50 mg/kg H5N4F1; H: 10 mg/kg H5N4F1

4 結(jié) 論

本研究基于LC-MS/MS 技術(shù)，建立了一種對貝伐珠單抗藥物及其糖基化修飾的PRM體內(nèi)定量分析方法，此方法簡單、可靠、靈敏度高、通量高，能同時實現(xiàn)對單抗藥物本身及其糖基化修飾的定量分析，為單抗藥物的藥代動力學研究提供了一種新方法。

1 Chen Z, Wang J, Bao L, Guo L, Zhang W, Xue Y, Zhou H, Xiao Y, Wang J, Wu F, Deng Y, Qin C, Jin Q.Nat.Commun.,2015, 6: 6714

2 Hogarth P M, Pietersz G A.Nat.Rev.DrugDiscov.,2012, 11(4): 311-331

3 Al-Debasi T, Al-Bekairy A, Al-Katheri A, Al Harbi S, Mansour M.SaudiJ.Ophthalmol.,2017, 31(2): 99-105

4 Reusch D, Haberger M, Maier B, Maier M, Kloseck R, Zimmermann B, Hook M, Szabo Z, Tep S, Wegstein J, Alt N, Bulau P, Wuhrer M.MAbs,2015, 7(1): 167-179

5 Beck A, Wagner-Rousset E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Sanglier-Cianferani S.Anal.Chem.,2013, 85(2): 715-736

6 Chung S, Quarmby V, Gao X,Ying Y, Lin L, Reed C, Fong C, Lau W, Qiu Z J, Shen A, Vanderlaan M, Song A.MAbs,2012, 4(3): 326-340

7 Scallon B J,Tam S H, McCarthy S G, Cai A N, Raju T S.Mol.Immunol.,2007, 44(7): 1524-1534

8 Engvall E, Perlmann P.Immunochemistry,1971, 8(9): 871-874

9 Gan S D, Patel K R.J.Invest.Dermatol.,2013, 133(9): e12

10 Mesmin C, Fenaille F, Ezan E, Becher F.Bioanalysis,2011, 3(5): 477-480

11 Ezan E, Bitsch F.Bioanalysis,2009, 1(8): 1375-1388

12 Ronsein G E, Pamir N, von Haller P D, Kim D S, Oda M N, Jarvik G P, Vaisar T, Heinecke J W.J.Proteomics,2015, 113: 388-399

13 Toyama A, Nakagawa H, Matsuda K, Sato TA, Nakamura Y, Ueda K.Anal.Chem.,2012, 84(22): 9655-9662

14 Hong Q, Lebrilla C B, Miyamoto S, Ruhaak L R.Anal.Chem.,2013, 85(18): 8585-8593

15 Lesur A, Domon B.Proteomics,2015, 15(5-6): 880-890

16 Tsuchiya H, Tanaka K, Saeki Y.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2013, 436(2): 223-229

17 Urisman A, Levin R S, Gordan J D, Webber J T, Hernandez H, Ishihama Y, Shokat K M, Burlingame A L.Mol.CellProteomics,2017, 16(2): 265-277

18 Sundberg M, Strage E M, Bergquist J, Holst B S, Ramstr?m M.PLosOne,2016, 11(12): e0167138

19 Siemiatkoski J, Lyubarskaya Y, Houde D, Tep S, Mhatre R.Carbohydr.Res.,2006, 341(3): 410-419

20 Bobaly B, D'Atri V, Goyon A, Colas O, Beck A, Fekete S, Guillarme D.J.Chromatogr.B,2017, 1060: 325-335

21 Cheng K, Chen R, Seebun D, Ye M, Figeys D, Zou H.J.Proteomics,2014, 110: 145-154

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81373374).

Characterization,QuantificationandPharmacokineticAnalysisof
BevacizumabandItsGlycosylationbyMassSpectrometry

CONG Yu-Ting1,2, HU Liang-Hai*1, YE Ming-Liang2, GU Jing-Kai1, ZOU Han-Fa2
1(CollegeofLifeScience,JilinUniversity,Changchun130012,China)
2(CASKeyLaboratoryofSeparationSciencesforAnalyticalChemistry,NationalChromatographicR&ACenter,
DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

The bevacizumab and its glycoforms were analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and short-gun strategy, with the sequence of unique peptide and seventeen glycoforms being characterized. The bevacizumab and its glycopeptides concentrations in mice plasma with different intravenous injection doses of bevacizumab were detected and the concentration-time curves were obtained by parallel reaction monitoring (PRM) method based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technique. First, standard curves were created for quantification of mAb in mice plasma, which showed good linearity, with the correlation coefficient (R2) value of 0.998 and the lower limit of quantification of 66 fmol. Detection results of high and low doses of the drug in the mice plasma samples showed that the drug concentration-time curve trend was consistent, e.g. the concentration was decreasing. However, the results of quantitation of seventeen glycoforms demonstrated that the metabolism of different glycoforms was different. The concentrations of most glycoforms increased first, whereas the metabolism afterwards differed by different glycoforms.

Bevacizumab; Glycosylation; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Parallel reaction monitoring; Pharmacokinetics

20 March 2017; accepted 7 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170170