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        同源異型盒基因HOXA5對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823侵襲能力的影響

        2017-11-06 11:30:03
        實(shí)用癌癥雜志 2017年9期
        關(guān)鍵詞:孵育切片質(zhì)粒

        周 博

        同源異型盒基因HOXA5對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823侵襲能力的影響

        周 博

        目的檢測(cè)人胃癌組織中HOXA5基因的表達(dá)情況,觀察干擾HOXA5基因的表達(dá)之后,胃癌細(xì)胞BGC823的遷移和侵襲能力的變化,為闡明HOXA5在胃癌向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制中提供新的思路。方法通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)、Western blot以及免疫組織化學(xué)等技術(shù),檢測(cè)胃癌組織中HOXA5基因的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法將HOXA5基因的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞BGC823中,經(jīng)qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證HOXA5表達(dá)上調(diào)之后,利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC823細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果在收集的69例新鮮的胃癌組織以及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中,免疫組織化學(xué)顯示相比于癌旁組織的表達(dá)情況,胃癌組織中只有26例HOXA5的表達(dá)高于癌旁組織,比例為37.7%;qRT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁組織,胃癌組織中HOXA5的表達(dá)水平顯著下調(diào)(mRNA水平下調(diào)3倍,蛋白水平下調(diào)2倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05)。BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染了過表達(dá)質(zhì)粒之后,HOXA5的表達(dá)能夠被上調(diào)。過表達(dá)了HOXA5基因的BGC823細(xì)胞的侵襲能力下降。結(jié)論在胃癌組織中HOXA5的表達(dá)下調(diào),而在胃癌細(xì)胞BGC823中增強(qiáng)HOXA5的表達(dá)能夠降低細(xì)胞的侵襲能力,說明HOXA5在胃癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著抑癌基因的作用,可作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

        HOXA5;胃癌;BGC823細(xì)胞;侵襲;轉(zhuǎn)移

        (ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1406~1410)

        胃癌的發(fā)生率在全球最常見的腫瘤中排第四位,然而它確是癌癥死亡的第二大原因[1],這其中主要的原因是因其易復(fù)發(fā)和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。我國陳萬青教授等[2]領(lǐng)銜的研究發(fā)現(xiàn)在2009年我國胃癌新發(fā)病例30949例,死亡病例22120例,發(fā)病率為36.21/10萬,死亡率為25.88/10萬,雖然與2008年相比并沒有大幅上升,但發(fā)病率和死亡率仍然很高。胃癌已經(jīng)成為對(duì)公眾健康有重大影響的疾病。目前對(duì)胃癌的治療主要以手術(shù)切除為主,術(shù)后5年生存率約20%~30%[3],許多胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)即已經(jīng)到了晚期。闡明其發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于更好地預(yù)防和治療胃癌具有重要的意義。HOX 基因?qū)儆谕串愋魏谢蚣易宓囊粏T,在進(jìn)化上高度保守[4]。相關(guān)研究結(jié)果證明,人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后也有HOX 基因的參與[5]。HOXA5為HOX 基因編碼的1個(gè)蛋白之一,它可以與DNA結(jié)合進(jìn)而激活或者抑制下游靶基因的表達(dá)。一項(xiàng)最近的研究表明,在乳腺癌中HOXA5的表達(dá)是抑制的,提示它是1個(gè)腫瘤抑制子,抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[6]。然而其他的研究者發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織中它是高表達(dá)的[7],說明它又可能是1個(gè)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的癌基因。HOXA5在不同的腫瘤中是促癌還是抑癌爭(zhēng)論性比較大,至于HOXA5在胃癌中表達(dá)如何,以及它在胃癌的生發(fā)發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的過程中扮演什么角色,至今研究的人很少。為了解決這一科學(xué)問題,我們需要觀察HOXA5如何影響胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力,并闡明其表達(dá)情況,以便更科學(xué)的定義它在胃癌中的作用,為將來將其作為新的生物治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        BGC823細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞株)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒購自南京蓋博生物技術(shù)有限公司。RIPA裂解液、蛋白抽提試劑盒Ⅰ購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司(USA)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自寶大連生物工程有限公司(TaKaRa)。兔抗人HOXA5多克隆抗體購自美國ABcam公司,兔抗人GAPDH抗體購自美國Proteintech。山羊抗兔IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物有限公司。TRIzol 試劑、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒等購自北京天根生物科技有限公司。HOXA5過表達(dá)質(zhì)粒購買自蘇州吉瑪基因股份有限公司。HOXA5和GAPDH的實(shí)時(shí)RT-PCR引物等均由生工(上海)有限公司合成。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

        1.2 組織

        病理組織來源于2012年5月至2014年7月期間在我院住院并接受胃癌根治術(shù)的患者手術(shù)切除的新鮮胃癌組織標(biāo)本,標(biāo)本均經(jīng)病理確診為胃癌,取距離癌組織5 cm的正常胃粘膜組織作為癌旁標(biāo)本,本研究中共收集了69例,患者平均年齡(53.2±11.2)歲,所有患者手術(shù)之前均接受放化療與抗腫瘤藥物治療。

        1.3 方法

        1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織蛋白表達(dá) 新鮮組織標(biāo)本用福爾馬林浸泡、固定,然后用石蠟包埋,切片后烘烤2 h。脫蠟后用pH 7.4的PBS沖洗3次,每次3 min。取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,中檔微波處理10 min,取出微波盒流水自然泠卻,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗3次,每次3 min。每張切片加1滴3% H2O2,室溫下孵育10 min,PBS沖洗3次,每次3 min。去除PBS,然后再在每張切片上加1滴相HOXA5一抗抗體,室溫孵育2 h;PBS沖洗3次,每次5 min。去除PBS,每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑,室溫孵育20 min;PBS沖洗3次,每次3 min。去除PBS,每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物,室溫孵育30 min;PBS沖洗3次,每次5 min。除去PBS液,每張切片加1滴DAB液,靜置5 min。蘇木精復(fù)染,0.1%HCl分化,自來水沖洗,藍(lán)化,切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,晾干后顯微鏡下觀察并拍照。

        1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)HOXA5 mRNA 表達(dá)情況 將胃癌組織或癌旁組織研磨碎,或收集各組經(jīng)處理的BGC823細(xì)胞,應(yīng)用TRIzol試劑法提取各組細(xì)胞的總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒其反轉(zhuǎn)錄成cDNA反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,隨后以此cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR引物序列見表1 。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s ;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt 值表示各基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

        表1 qRT-PCR引物序列

        1.3.3 Western blot檢測(cè)HOXA5的蛋白表達(dá)情況 將胃癌組織或癌旁組織研磨碎,或收集各組經(jīng)處理的BGC823細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。用10%SDS-PAGE膠將提取的蛋白質(zhì)分離,然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉1 h ;將相應(yīng)的PVDF膜浸入含1∶1000的抗HOXA5和GAPDH抗體的一抗稀釋液中4 ℃孵育;第二天將膜取出用TBST液漂洗3次,每次10 min,按1∶10 000稀釋濃度加入羊抗兔IgG,室溫孵育1 h;用TBST 液漂洗3 次,每次10 min;加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像,Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的表達(dá)情況以HOXA5與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

        1.3.4 HOXA5質(zhì)粒大提 HOXA5過表達(dá)質(zhì)粒購買自蘇州吉瑪基因股份有限公司。取適量均勻小搖,然后大搖。按照質(zhì)粒提取試劑盒的說明書步驟提取質(zhì)粒,備用。

        1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞株BGC823置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用含100 U/ml雙抗的DMEM(Gibco,USA) 培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞于6 cm培養(yǎng)皿中,當(dāng)細(xì)胞融合度約70%時(shí)換無雙抗的DMEN培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)4 h,然后用LipofectaminTM2000按照說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染分兩組:HA-HOXA5組和HA-Vector組。于轉(zhuǎn)染6 h后更換含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),24 h后取一半細(xì)胞提取RNA,48 h后提取剩余的總蛋白。

        1.3.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 使用Transwell檢測(cè)BGC823細(xì)胞的侵襲能力變化。取對(duì)數(shù)期的BGC823細(xì)胞,經(jīng)過胰酶消化后,大約按2×105細(xì)胞數(shù)加入到每個(gè)小室,用不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),放置在含有10%的血清培養(yǎng)液的24孔板上,放置在5%CO2環(huán)境內(nèi)孵育24 h,甲醛固定20 min,用PBS洗3遍。顯微鏡(×200)下計(jì)數(shù)遷移至濾膜外表面的細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差分析用于多組間數(shù)據(jù)的比較,t檢驗(yàn)用于兩組間數(shù)據(jù)的比較;而Tukey 法或Dunnett’s T3 法用于組間兩兩比較分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 免疫組化檢測(cè)胃癌組織中HOXA5基因表達(dá)情況

        應(yīng)用免疫組織化法,在收集的69例胃癌以及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中對(duì)HOXA5的表達(dá)進(jìn)行定性分析,發(fā)現(xiàn)只有26例患者的癌組織中HOXA5表達(dá)接近或者高于癌旁組織,染色強(qiáng)于癌旁組織者26例(37.7%),染色弱于癌旁組織者43例(62.3%)。

        2.2 胃癌以及癌旁組織中HOXA5mRNA 和蛋白表達(dá)情況

        應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)HOXA5mRNA的表達(dá)情況,與GAPDH對(duì)比進(jìn)行定量分析。

        結(jié)果發(fā)現(xiàn):與癌旁組織相比,HOXA5在胃癌組織中表達(dá)降低,與GAPDH進(jìn)行定量對(duì)比分析胃癌組織為(0.149±0.067),癌旁組織為(0.328±0.085),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        Western blot檢測(cè)HOXA5的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果如圖1所示:胃癌組織中HOXA5表達(dá)明顯低于癌旁組織,與GAPDH對(duì)比進(jìn)行定量分析,結(jié)果為胃癌組織(0.342±0.024),癌旁組織(0.975±0.105),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        圖1 胃癌和癌旁組織中HOXA5和GAPDH的Western blot成像圖

        2.3 HOXA5過表達(dá)質(zhì)粒效果驗(yàn)證

        應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)BGC823細(xì)胞中HOXA5mRNA的表達(dá)情況;48 h后提取細(xì)胞總蛋白,用Western blot檢測(cè)BGC823細(xì)胞中HOXA5的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),相比于轉(zhuǎn)染了HA-Vector質(zhì)粒組(0.5123±0.087),轉(zhuǎn)染了HA-HOXA5質(zhì)粒組的BGC823細(xì)胞HOXA5基因表達(dá)(1.639±0.088)明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見圖2。

        A為qRT-PCR量化柱狀圖,B為Western blot成像圖。

        2.4 上調(diào)HOXA5的表達(dá)導(dǎo)致BGC823細(xì)胞的侵襲能力下降

        BGC823細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染HA-Vector和 HA-HOXA5質(zhì)粒,48 h后經(jīng)胰酶消化,細(xì)胞按2×105細(xì)胞數(shù)加入到每個(gè)Transwell小室,繼續(xù)用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),36 h后經(jīng)染色在顯微鏡(×200)下計(jì)數(shù)遷移至濾膜外的細(xì)胞,結(jié)果見圖3。與HA-Vector組比較,HA-HOXA5組的BGC823細(xì)胞侵襲、遷移能力下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        A為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn);B為遷移至Transwell小室濾膜外的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)圖。

        3 討論

        同源異形盒基因是1類串聯(lián)成簇地排列在不同染色體上的基因,即HOX基因。人類有39個(gè)HOX基因,分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 4簇,其中HOXA位于chr17p14-15[4]。HOX 基因編碼的蛋白可以與DNA結(jié)合進(jìn)而激活或者抑制下游靶基因的表達(dá)[8],研究表明HOX基因可以控制細(xì)胞屬性,比如細(xì)胞分化、細(xì)胞親和力等[9],除此之外,HOX基因在腫瘤中的作用也越來越得到研究者的重視[10-13]。研究發(fā)現(xiàn),HOX基因在腫瘤中的作用不是固定的,在不同的階段和不同的腫瘤中發(fā)揮著不同的功能,以HOXB9為例,其表達(dá)越低的組織,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越早,患者生存期越短[14],而在結(jié)腸癌組織中確實(shí)高表達(dá)的[15],但是在晚期或者分化程度越低的結(jié)腸癌中表達(dá)越低,預(yù)后也越差。因此,研究HOX基因在不同的腫瘤中的表達(dá)以及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的影響,對(duì)充分了解HOX基因具有深遠(yuǎn)意義。有研究者發(fā)現(xiàn)HOXA5基因在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)并能抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[16];然而,在急性髓細(xì)胞性白血病(AML)中,HOXA5的高表達(dá)可導(dǎo)致AML的治療效果更差,提示它與AML腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)[17]。HOXA5在胃癌中的作用,有研究[18]發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-196a可使胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力增加,而這一作用是通過miR-196a的靶基因HOXA5實(shí)現(xiàn)的,說明HOXA5在胃癌中可能發(fā)揮著抑癌的作用。為了進(jìn)一步闡明HOXA5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本文對(duì)HOXA5進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌組織中,HOXA5的表達(dá)的降低的(相對(duì)于癌旁組織);而在胃癌細(xì)胞BGC823中回復(fù)HOXA5的表達(dá)能抑制細(xì)胞的侵襲能力。綜上所述,我們的研究首次報(bào)道了在胃癌組織中HOXA5的表達(dá)時(shí)降低的,并能夠控制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。HOXA5可作為診斷和治療胃癌的一個(gè)新的生物標(biāo)記和靶基因。

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        (編輯:吳小紅)

        EffectofHOXA5ontheInvasionAbilityofHumanGastricCancerCellLineBGC823

        ZHOUBo.

        TheFirstAffiliatedHospitalofHe'nanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,471003

        ObjectiveTo detect the expression of HOXA5 in human gastric carcinoma;and observe the changes of gastric cancer cell BGC823’s migration and invasion ability after interference the expression of HOXA5 gene,and provide a new idea to clarify the molecular mechanism role of HOXA5 in the metastasis of gastric cancer.MethodsReal-time quantitative PCR(qRT-PCR),Western blot and immunohistochemistry were performed to detect the expression of HOXA5 gene in gastric cancer tissues.The overexpression plasmid of HOXA5 was transferred into gastric cancer cell BGC823 by the method of cell transfection,we use qRT-PCR and western blot to confirm the overexpression effect,and then the changes of invasion ability of BGC823 cells were detected by transwell invasion assay.ResultsIn the 69 cases of fresh gastric cancer tissue and the corresponding adjacent non-tumourous tissue,immunohistochemistry showed that in all gastric carcinoma tissue only 26 cases present HOXA5’s expression was higher than that in adjacent non-tumourous tissue,the proportion was 37.7%.Detection of qRT-PCR and western blot showed that the expression of HOXA5 was significantly lower in gastric cancer tissues than in adjacent non-tumourous tissue(the level of mRNA was down 3 times,and the protein was 2 times,the difference was statistically significant,P<0.05).In BGC823 cells,which have transfected overexpression plasmid of HOXA5,the expression of HOXA5 was up-regulated,and the invasion ability of BGC823 cells was decreased.ConclusionThe expression of HOXA5 in gastric carcinoma decreased.Enhance the expression of HOXA5 in gastric cancer cell line BGC823 can reduce the invasion ability of cells.HOXA5 is a tumor suppressor in the development,invasion and metastasis of gastric cancer.It can be a new therapeutic target.

        HOXA5;Gastric carcinoma;BGC823 cell;Invasion;Metastasis

        471003 河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院

        10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.004

        R735.2

        A

        1001-5930(2017)09-1406-05

        2016-10-24

        2017-06-12)

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