劉 敏，陳奇超，李玲銘，張彩華，王君德，李華軍

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 2013級七年制，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué) 微生態(tài)學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2015020271)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015E12SF171)

劉 敏(1993-)，女，本科生。E-mail：DMUliumin@163.com

李華軍，副教授。E-mail：lhjcmu@hotmail.com

論著

10.11724/jdmu.2017.05.03

藤三七皂苷組分對代謝綜合征小鼠及其腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

劉 敏1，陳奇超2，李玲銘2，張彩華2，王君德2，李華軍3

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 2013級七年制，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué) 微生態(tài)學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的研究藤三七皂苷組分對代謝綜合征小鼠及其腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。方法45只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和藤三七皂苷組(n=15)。采用高脂飲食建立代謝綜合征小鼠模型，對照組小鼠用普通飼料喂養(yǎng)，模型組小鼠飼以高脂飼料，藤三七皂苷組高脂飼料飼喂同時(shí)用100 mg/(kg·d)藤三七皂苷灌胃液灌胃。每周測體重，第2、4、6周每組隨機(jī)處理3只小鼠，第8周每組處理6只小鼠。以體重、肝臟與附睪脂肪系數(shù)、血脂等指標(biāo)，觀察皂苷的作用。并采用16S rRNA高通量測序法分析小鼠腸道菌群。結(jié)果第8周，模型組體重(36.36±2.44)g明顯高于對照組(29.33±1.89)g(P<0.05)；模型組體重增量(14.86±3.66)g明顯高于對照組(8.41±1.83)g和藤三七皂苷組(9.70±1.55)g(均P<0.05)。第8周，模型組附睪脂肪系數(shù)(4.18±0.97)%明顯高于對照組(2.29±0.69)%(P<0.05)，也高于藤三七皂苷組(3.65±0.81)%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第6周，模型組血清總膽固醇(TC)(7.13±0.67)mmol/L明顯高于對照組(4.81±0.55)mmol/L(P<0.05)，也高于藤三七皂苷組(5.38±0.15)mmol/L，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第8周，模型組TC(7.20±0.35)mmol/L明顯高于對照組(4.23±0.46)mmol/L和藤三七皂苷組TC(6.12±0.33)mmol/L(均P<0.05)。第6周，模型組血清低密度脂蛋白(LDL)(1.62±0.19)mmol/L明顯高于對照組(1.03±0.32)mmol/L和藤三七皂苷組(1.06±0.18)mmol/L(均P<0.05)；第8周模型組LDL(1.56±0.67)mmol/L顯著高于對照組(0.57±0.30)mmol/L和藤三七皂苷組LDL(0.68±0.07)mmol/L(均P<0.05)。藤三七皂苷組與模型組相比，腸道嗜膽菌(Bilophila)、葡萄球菌(Staphlococcus)、乳球菌(Lactococcus)、Ruminococcaceae、Anaerotruncus豐度降低，Allobaculum、Alloprevotella豐度升高。結(jié)論藤三七皂苷組分對代謝綜合征小鼠有一定的減肥及降脂作用，并能改善腸道菌群。

藤三七；皂苷；代謝綜合征；腸道菌群

由于生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，代謝綜合征已成為世界范圍的公共衛(wèi)生問題。從1992年到2002年，我國代謝綜合征患者迅速增多，10年間代謝綜合征率增加了80.6%[1]。代謝綜合征是高血壓、冠心病、腦卒中、糖尿病、血脂異常等多種疾病的危險(xiǎn)因素。人體胃腸道中微生物種類繁多且數(shù)量巨大，達(dá)到1014個(gè)，重量約1.27 kg，相當(dāng)于人體肝臟的重量，人體正常微生物群的數(shù)量大約是人體體細(xì)胞數(shù)(1013)的10倍[2]。在機(jī)體微生態(tài)平衡狀態(tài)下，人體腸道正常微生物對機(jī)體的營養(yǎng)代謝、免疫等發(fā)揮重要生理學(xué)作用。腸道微生物與宿主代謝有密切聯(lián)系[3]。

近年來，植物來源天然化合物因其高效、低毒的特點(diǎn)而備受研究者的青睞。藤三七又名豆腐菜，為多年生藤本植物。塊莖口味好，含有豐富維生素A和維生素C。有滋補(bǔ)、消散痰、活血、健胃保肝等作用。皂苷對反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵有一定的調(diào)控能力，同時(shí)可調(diào)節(jié)血糖，并對瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活性和微生物群有調(diào)整作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)藤三七皂苷組分對高糖飲食小鼠腸道菌群和血糖有恢復(fù)作用。本課題從微生態(tài)學(xué)理論出發(fā)，檢測藤三七皂苷組分對代謝綜合征小鼠的血脂及其腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為代謝綜合征防治方法提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與材料

18～22 g SPF級健康雄性BALB/c小鼠45只，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料(D12492, Research Diets Inc, New Brunswick, 美國)。藤三七皂苷提取物(西安斯諾特生物技術(shù)有限公司)；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。糞便DNA提取試劑盒(OMEGA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

冷凍離心機(jī)(Sorvall Legend Micro-21R，美國，Thermo)；酶標(biāo)儀(Multiskan Ascen，美國，Thermo)；-80 ℃冰箱(美國，Thermo)；制冰機(jī)(日本，SANYO)。

1.3 動(dòng)物處理

小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境(實(shí)驗(yàn)室溫度為22～25 ℃，濕度50%～60%，光照為12 h明/12 h暗)下適應(yīng)7 d。隨后將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和藤三七皂苷組，每組15只。3組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。對照組小鼠用普通飼料喂養(yǎng)，模型組小鼠飼以高脂飼料，藤三七皂苷組高脂飼料飼喂同時(shí)用100 mg/(kg·d)藤三七皂苷灌胃液灌胃。每周測體重，第2、4、6周每組隨機(jī)處理3只小鼠，第8周每組處理6只小鼠。

1.4 血清采集

第2、4、6、8周小鼠禁食14 h，摘取眼球法采血約2 mL，37 ℃孵箱中孵育30 min，冷凍離心機(jī)3000 r/min離心10 min獲取血清，分裝并保存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)檢測TC、TG、HDL-C和LDL-C。

1.5 肝臟臟器系數(shù)與附睪脂肪系數(shù)檢測

第8周，小鼠處死后取出肝臟和兩側(cè)附睪脂肪稱重，計(jì)算小鼠肝臟臟器系數(shù)與附睪脂肪系數(shù)[4]。附睪脂肪系數(shù)(%)=附睪脂肪重量(g)/小鼠體重(g)×100%；肝臟系數(shù)(%)=肝臟重量(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.6 血脂分析

酶標(biāo)儀比色法測定血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 16s rRNA高通量測序分析小鼠腸道菌群

第8周處死小鼠后，收集腸內(nèi)容物，保存于-80 ℃冰箱。用E.Z.N.A?Stool DNA Kit(OMEGA)試劑盒提取糞便細(xì)菌基因組DNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。模?DNA 各40 μL，干冰條件下運(yùn)送至檢測機(jī)構(gòu)(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該實(shí)驗(yàn)過程及后續(xù)檢測分析過程均委托公司。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后檢測 PCR產(chǎn)物，對目的條帶進(jìn)行膠回收純化。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測序。通過對Reads拼接過濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，α多樣性分析(Alpha Diversity)，β多樣性分析(Beta Diversity)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 體重和臟器系數(shù)

第8周，模型組體重顯著高于對照組(P<0.05)，藤三七皂苷組體重低于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組體重增量顯著高于對照組(P<0.05)，藤三七皂苷組體重增量顯著低于模型組(P<0.05)。見圖1。

A：體重；B：體重增量#與對照組比較，P<0.05；*與模型組比較，P<0.05圖1 小鼠體重與體重增量 Fig 1 Body weight and body weight gain

第8周，模型組肝臟系數(shù)高于對照組(P>0.05)，藤三七皂苷組肝臟系數(shù)低于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組附睪脂肪系數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，藤三七皂苷組附睪脂肪系數(shù)低于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 小鼠臟器系數(shù)

1)與對照組比較，P<0.05

2.2 血脂分析

TG結(jié)果顯示：第2、4、6周組間差別不顯著(P>0.05)；第8周模型組TG低于對照組(P>0.05)，藤三七皂苷組TG顯著低于模型組(P<0.05)。TC結(jié)果顯示：第2、4周組間差別不顯著(P>0.05)；第6周模型組TC明顯高于對照組(P<0.05)，也高于藤三七皂苷組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第8周模型組TC明顯高于對照組和藤三七皂苷組(均P<0.05)。HDL結(jié)果顯示：第2、4、6、8周組間差別不顯著(P>0.05)。LDL結(jié)果顯示：第2、4周組間差別不顯著(P>0.05)；第6、8周模型組LDL明顯高于對照組和藤三七皂苷組(均P<0.05)。見表2。

2.3 小鼠腸道菌群屬水平分析

第8周，在屬水平，與對照組比較，模型組小鼠腸道菌群中嗜膽菌(Bilophila)、葡萄球菌(Staphlococcus)、乳球菌(Lactococcus)、Ruminococcaceae、Anaerotruncus豐度增加，藤三七皂苷組較模型組豐度降低；與對照組相比，模型組Allobaculum、Alloprevotella豐度降低，而藤三七皂苷組則較模型組升高。見圖2。

3 討 論

代謝綜合征及與之相關(guān)的疾病發(fā)病率在全球日益攀升，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的重要危險(xiǎn)因素。研究表明飲食習(xí)慣和生活方式與代謝綜合征密切相關(guān)[5]。高脂飲食是導(dǎo)致代謝綜合征發(fā)生的重要因素，代謝綜合征者一般都伴有脂代謝紊亂，易誘發(fā)心血管疾病[6]。目前研究普遍認(rèn)為血漿TC、TG和LDL-C水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，而血漿HDL-C水平升高則是其保護(hù)因素[7]。本研究結(jié)果表明采用高脂飼料飼喂BALB/c小鼠制造代謝綜合征模型，模型組小鼠較正常飲食對照組TC和LDL水平升高。

表2 小鼠血清生化指標(biāo)

1)與模型組比較，P<0.05；2)與對照組比較，P<0.05

Control: 對照組；HF: 模型組；HF.sap: 藤三七皂苷組圖2 小鼠腸道菌群屬水平熱圖Fig 2 Heat map of RDA-identified key OTUs responding to gut microbiota at the genus level

皂苷作為一種天然化合物廣泛存在于多種植物中，具有抗炎鎮(zhèn)痛[8]、心血管保護(hù)[9]、抗癌等生理活性作用。本研究利用藥食植物藤三七中皂苷有效成分，檢測其對代謝綜合征小鼠代謝及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示與模型組比，藤三七皂苷組小鼠體重、體重增量、肝臟指數(shù)、血清總膽固醇及血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均降低。

腸道菌群對人體健康發(fā)揮重要作用，疾病狀態(tài)下腸道菌群發(fā)生變化。Bilophila wadsworthia在正常人群腸道中保持低豐度，在某些病理情況如結(jié)腸炎和其他炎癥性疾病中增加[10]。Zhang X等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食降低大鼠腸道菌群多樣性和葡萄球菌(Staphlococcus)、 Allobaculum的豐度。有研究表明，Allobaculum改善代謝綜合征并可以預(yù)防硫酸葡聚糖所致炎癥反應(yīng)[12-13]。Alloprevotella是可以產(chǎn)短鏈揮發(fā)性脂肪酸(SCFA)菌，其豐度與代謝綜合征、糖尿病和代謝綜合征負(fù)相關(guān)[14-15]。本研究表明，藤三七皂苷處理組與高脂飲食模型組相比，小鼠腸道菌群分析顯示皂苷改善了高脂飲食造成的小鼠腸道細(xì)菌紊亂。腸道菌群中嗜膽菌(Bilophila)、Staphylococcus豐度降低， Allobaculum、Alloprevotella豐度增加。

綜上所述，藤三七皂苷組分可以降低小鼠代謝綜合征模型體重、體重增量、肝臟指數(shù)，改善血脂，并能調(diào)節(jié)腸道菌群，從而有利于代謝綜合征的防治。

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EffectsofBoussingaultiaSaponinsonmetabolicsyndromeandgutmicrobiotainmice

LIU Min1，CHEN Qichao2，LI Lingming2，ZHANG Caihua2，WANG Junde2，LI Huajun3

(1.SevenYearSystem2013,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China；2.DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China；3.DepartmentofMicroecology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo study the effects of saponins on metabolic syndrome and gut microbiota in mice.MethodsForty-five male BALB/c mice were evenly divided into the model group, saponins group and control group. Mice in the model group and saponins group were fed with high-fat diet, and mice in the saponins group was simultaneously gavaged with saponins [100 mg/(kg·d)]. Three mice from each group were sacrificed every two weeks (six mice per group at the end of the eighth week). The effects of saponins were observed by weight, liver coefficient, epididymal fat tissue coefficient and blood lipids. And the gut microbiota was analyzed by 16S rRNA high throughput sequencing.ResultsAt the end of week 8, the weight of mice in model group increased more than that in saponins group and control group (P<0.05). The epididymal fat tissue coefficient in model group (4.18±0.97) % increased more than the control group (2.29±0.69) % (P<0.05), while decreased in saponins group (3.65±0.81) % (P>0.05). At the end of week 6, blood TC and LDL in saponins group increased significantly less than those in model group, though more than those in control group. The abundance of Bilophila, Staphlococcus, Lactococcus, Ruminococcaceae and Anaerotruncus decreased in saponins group compared with model group, but the abundance of Allobaculum and Alloprevotella increased.ConclusionSaponins could play a role in lower the levels of weight gain and blood lipids in metabolic syndrome mice by adjusting the gut microbiota.

Boussingaultia; Saponins; metabolic syndrome; gut microbiota

R378

A

1671-7295(2017)05-0428-05

劉敏，陳奇超，李玲銘，等.藤三七皂苷組分對代謝綜合征小鼠及其腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(5)：428-432.

2017-05-31；

2017-09-25)