喬春霞 屈秋錦 趙增琳 侯麗 楊婧 董秀麗

1 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （山東 濟(jì)南 250101）2 山東恒信檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 （山東 濟(jì)南 250101）

醫(yī)療器械溶血性能評(píng)價(jià)方法-NIH法的直接接觸法和間接接觸法比較

喬春霞1屈秋錦2趙增琳2侯麗1楊婧2董秀麗2

1 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （山東 濟(jì)南 250101）2 山東恒信檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 （山東 濟(jì)南 250101）

根據(jù)ISO/TC194WG9的要求進(jìn)行溶血比對(duì)（Round robin）試驗(yàn)。采用NIH（National Institutes of Health，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）直接接觸法和間接接觸法測(cè)定了5種材料的溶血性能，結(jié)果顯示聚乙烯、丁腈手套、#1橡膠和#2橡膠的溶血等級(jí)判定結(jié)果在兩種方法是一致的，但是丁腈手套的兩種方法的溶血率值有顯著差異。乳膠手套的溶血率和判定結(jié)果不一致。作者分析了這些不一致產(chǎn)生的原因，為醫(yī)療器械或材料的溶血性能檢測(cè)提出了一些建議，為新標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布和實(shí)施提供數(shù)據(jù)支持。

醫(yī)療器械 溶血性能 NIH方法

醫(yī)療器械本身或使用不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致溶血的發(fā)生，從而為臨床帶來(lái)一些不利的影響，因此評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的溶血性能是很有意義的篩選試驗(yàn)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-4:2017（E）[1]中列出了三種試驗(yàn)方法供選擇，分別是ASTM（American Society for Testing and Materials，美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)）F756-08[2]、NIH[3]和MHLW[4]（日本勞動(dòng)健康福利局）發(fā)布的關(guān)于溶血的方法。國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T14233.2-2005[5]和GB/T16175-2008[6]等。GB/T14233.2-2005和GB/T16175-2008的方法相似，其與NIH法也是基本一致的。在這些關(guān)于NIH方法的標(biāo)準(zhǔn)中只是推薦采用直接法，本文根據(jù)ISO/TC194WG9進(jìn)行溶血比對(duì)（Round robin）試驗(yàn)的要求，將NIH間接法與NIH直接法進(jìn)行比較，探討NIH間接法在醫(yī)療器械溶血性能檢測(cè)中的可行性，為新標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)支持。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

材料：材料有5種，分別是a：聚乙烯，b：丁腈手套，c：乳膠手套，d：#1橡膠，e：#2橡膠。

儀器設(shè)備：主要有分光光度計(jì)，水浴搖床和離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

嚴(yán)格按照表1列出的樣品大小切割試驗(yàn)樣品，每個(gè)試驗(yàn)樣品平行3管，分別置于20mm×150mm玻璃試管中。

直接接觸法：每支試管中各加入10mL生理鹽水。同時(shí)制備陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入10mL生理鹽水和0.1%碳酸鈉。制備1管空白管，加入10mL生理鹽水。

間接接觸法：每支試管中加入11mL生理鹽水。陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白管制備方法同直接接觸法。將所有試管置于（37±2）?C水浴中，60r/min振蕩孵育（72±2）h。將孵育后各管中的浸提液移出10mL至新的玻璃試管中。

表1. 試驗(yàn)樣品

1.2.2 兔血制備

新西蘭白兔3只，每只抽取頸靜脈血5mL，置于0.109M/3.2%枸櫞酸鈉抗凝的采血管中，混合得到15mL血液。取8mL，加入10mL生理鹽水中混勻，得到稀釋的兔血。

取10mL0.1%的碳酸鈉置于玻璃試管中，加入稀釋的兔血0.2mL。545nm條件下，用生理鹽水調(diào)0，立即測(cè)定混合物的吸光度。本試驗(yàn)要求吸光度在0.90～1.00（透過(guò)率在10%～13%）稀釋的兔血才能用于試驗(yàn)。

1.2.3 與血液接觸

將按照3.1制備的所有試管置于（37±2）?C水浴中孵育30min后加入3.2制備的稀釋兔血0.2mL，空白管除外。將所有試管置于（37±2）?C水浴中孵育（60±5）min。

1.2.4 結(jié)果測(cè)定

孵育結(jié)束后，所有試管中液體被移入到離心管中，500g離心5min。用空白管液體調(diào)0，545nm測(cè)定各管上清液的吸光度值。陽(yáng)性對(duì)照管的吸光度值應(yīng)大于0.90，否則應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 計(jì)算溶血率

按下列公式，計(jì)算得出a-e每個(gè)試驗(yàn)樣品每管的溶血率值：

溶血率（%）=(T–Navg)/(Pavg–Navg)×100

T=每管試驗(yàn)樣品OD值

表2. NIH法溶血結(jié)果判定

N=3管陰性對(duì)照平均OD值

P=3管陽(yáng)性對(duì)照平均OD值

1.2.6 判定標(biāo)準(zhǔn)

計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)樣品3管溶血率的平均值按表2進(jìn)行結(jié)果判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別計(jì)算每周試驗(yàn)結(jié)果及3周試驗(yàn)結(jié)果的±s，對(duì)各個(gè)試驗(yàn)樣品的試驗(yàn)結(jié)果（溶血率）的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)3次結(jié)果比較

由表3可以看出，直接接觸法的樣品a、d和e的溶血率均小于5%，根據(jù)溶血等級(jí)判定為不溶血。樣品b和c的溶血率均高于5%，根據(jù)溶血等級(jí)判定為溶血，但樣品b的3次結(jié)果差異較明顯。間接接觸法的樣品b溶血率為100%，具有溶血活性。樣品a、c、d和e的溶血率均低于5%，判定為不溶血，5種試驗(yàn)樣品3次結(jié)果判定一致。

2.2 直接接觸法和間接接觸法結(jié)果比較

由表4可以看出，樣品b和c在直接接觸法和間接接觸法的結(jié)果上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而樣品a、d和e的差異不顯著。

3.討論

NIH方法在醫(yī)療器械溶血檢測(cè)中因?yàn)槠洳僮鞯暮?jiǎn)便性，應(yīng)用最為廣泛。本次研究主要是對(duì)NIH直接接觸法的重復(fù)性、間接接觸法的重復(fù)性以及直接接觸法和間接接觸法之間的一致性進(jìn)行研究，為制定醫(yī)療器械材料介導(dǎo)的溶血試驗(yàn)方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

為了比較間接接觸法和直接接觸法之間的一致性，間接接觸法選用與直接接觸法相同的浸提比例和浸提溫度。試驗(yàn)樣品b在直接接觸法3周試驗(yàn)中的重復(fù)性較差，考慮可能的原因是由于手套比較柔軟，且試驗(yàn)時(shí)切割的樣品比較大容易折疊在一起或容易緊貼管壁。

雖然試驗(yàn)樣品b的直接接觸法和間接接觸法的溶血等級(jí)判定在同一個(gè)級(jí)別，但間接接觸法的溶血率顯著高于直接接觸法，說(shuō)明經(jīng)過(guò)72 h的孵育，樣品中能影響紅細(xì)胞的物質(zhì)充分釋放至浸提液中，而直接接觸法因?yàn)闃悠放c浸提介質(zhì)之間的接觸時(shí)間只有90min，所以浸提出的有害物質(zhì)較少。試驗(yàn)樣品c直接接觸法的溶血率顯著高于間接接觸法，兩種方法的溶血性能不在同一級(jí)別，樣品c是乳膠手套，質(zhì)地較柔軟，樣品制備成3cm×5cm大小的長(zhǎng)方形，沒(méi)有尖銳的可以損傷紅細(xì)胞的邊角，因此溶血的發(fā)生與樣品物理性狀無(wú)關(guān)[7]。試驗(yàn)樣品c在直接接觸法檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的原因可能是某種物質(zhì)存在與樣品表面，直接與紅細(xì)胞接觸導(dǎo)致紅細(xì)胞膜破損，釋放血紅蛋白。但是這種物質(zhì)可能不溶于水，不會(huì)釋放入浸提液中，所以間接接觸法不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞膜損傷。

綜合分析結(jié)果，間接接觸法的重復(fù)性要優(yōu)于直接接觸，但是兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性不能一概而論。同時(shí)進(jìn)行直接接觸法和間接接觸法試驗(yàn)，對(duì)一種未知醫(yī)療器械或材料的溶血性能檢測(cè)是最好的選擇。本次研究只是將NIH方法兩種方法進(jìn)行比較，得到的數(shù)據(jù)有限，下一步還將進(jìn)行NIH方法、ASTM方法和MHLW方法之間的一致性問(wèn)題，同時(shí)考慮兔血和人血對(duì)溶血性能的影響，為三種方法和結(jié)果的互換性提供依據(jù)。

[1] ISO 10993-4:2017 (E).Biological evaluation of medical devices -- Part 4:Selection of tests for interactions with blood[S].2017.

[2] ASTM F 756-08.Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials[Z].Astm,2008.

[3] Evaluation of hemodialyzers and dialysis membranes.Report of a Study Group for the Artificial Kidney-Chronic Uremia Program NIAMDD-1977.Chapter two.In vitro characterization of hemodialyzers[J].Artif Organs 1977,1(2):59-77.

[4] MHLW Notification by Director,OMDE,Yakushokuki-hatsu 0301 No.20,March 1,2012,Basic Principles of Biological Safety Evaluation Required for Application for Approval to Market Medical Devices[Z].2012.

[5] GB/T 14233.2-2005 Infusion,transfusion,injection equipment for medical use -Part2:Biological test methods [醫(yī)用輸液、輸血醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2 部分:生物學(xué)試驗(yàn)方法] [S].2005.

[6] GB/T 16175-1996,Organic silicone material for medical use — Biological evaluation test methods[S].1996.

[7] 孫皎,劉義榮,錢(qián)云芳.生物材料試樣形狀對(duì)溶血率的影響[J].口腔材料器械雜志,1993,2(2):17.

Comparison of Direct Contact Method and Indirect Contact Method for Evaluation of Hemolytic Performance of Medical Device-NIH Method

QIAO Chun-xia1QU Qiu-jin2ZHAO Zeng-lin2HOU Li1YANG Jing2DONG Xiu-li2
1 Jinan Quality Supevision and Inspection Center for Medical Device, CFDA; Shandong Provincial Key Laboratory of Biological Evaluation for Medical Devices (Shandong Jinan 250101)2 Shandong Hengxin Testing Technology Development Center (Shandong Jinan 250101)

1006-6586(2017)17-0042-02

R197.39

A

2017-07-12

表4. 直接接觸法和間接接觸法結(jié)果比較(±s，%)

表4. 直接接觸法和間接接觸法結(jié)果比較(±s，%)

*直接接觸法與間接接觸法相比，P＜0.01

試驗(yàn)樣品 溶血率直接接觸法 間接接觸法a 0.53±0.4 1.50±1.5 b 61.97±31.6 104.51±7.5*c 19.48±2.1 1.08±1.6*d 0.40±0.5 0.38±1.0 e 0.14±0.6 0.30±0.7

表3. 試驗(yàn)3次結(jié)果比較