張微微 王莉萍 陳 岳 李 炯 俞平高*（上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)系，上海市松江區(qū) 0699；上海市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，上海市松江區(qū) 0699；上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市閔行區(qū) 000；上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司,上海市金山區(qū) 050）

66個(gè)玉米自交系的SSR引物篩選試驗(yàn)初報(bào)

張微微1王莉萍2陳 岳3李 炯4俞平高1*（1上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)系，上海市松江區(qū) 201699；2上海市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，上海市松江區(qū) 201699；3上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市閔行區(qū) 200240；4上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司,上海市金山區(qū) 201503）

玉米作為上海地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的主要農(nóng)作物之一，其種質(zhì)資源的優(yōu)劣將直接影響到上海地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展水平和農(nóng)民的收益水平。為給上海地區(qū)玉米品種的遺傳資源評(píng)價(jià)和親緣關(guān)系分析提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了SSR引物篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板對(duì)103對(duì)引物進(jìn)行篩選，可獲得30對(duì)多態(tài)性高的SSR引物；再對(duì)6 6份玉米自交系進(jìn)行S S R分析，可擴(kuò)增出1 2 1條譜帶，每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)等位基因數(shù)2～8個(gè)，平均等位基因數(shù)為4.0，PIC值變幅為0.73～0.90，平均為0.82；選擇6個(gè)PIC值等于或高于0.85的SSR引物及2個(gè)PIC值低于0.85的引物組合成一套核心引物，可用于構(gòu)建6 6份玉米自交系的S S R指紋圖譜。

玉米；S S R；引物篩選；等位基因數(shù)；多態(tài)性信息

DNA指紋技術(shù)是基于DNA分子水平差異檢測(cè)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的技術(shù)，具有覆蓋面全、多態(tài)性高、測(cè)試周期短和不受季節(jié)和測(cè)試時(shí)間限制等優(yōu)點(diǎn)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物品種遺傳背景分析、指紋圖譜構(gòu)建、品種真實(shí)性和純度鑒定、區(qū)試品種質(zhì)量監(jiān)控等方面。作為第二代分子標(biāo)記的SSR標(biāo)記，是由2～6個(gè)堿基組成的重復(fù)序列，是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上的一種遺傳標(biāo)記技術(shù)。目前，該技術(shù)已被有效地應(yīng)用于玉米指紋圖譜構(gòu)建工作中，如譚君等[1]構(gòu)建了四川常用73份玉米自交系和雜交種的SSR指紋圖譜；趙久然等[2]建立了中國(guó)玉米新品種DNA指紋庫(kù)；吳渝生等[3]建立了3個(gè)云南玉米雜交種及其親本DNA的指紋圖譜；李曉輝等[4]確定10 對(duì)核心引物，建立了86個(gè)雜交種的SSR指紋圖譜庫(kù)；李麗華等[5]對(duì)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所近年選育的20個(gè)優(yōu)良自交系的指紋圖譜進(jìn)行了構(gòu)建。

玉米作為上海地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的主要農(nóng)作物之一，其品種自交系常年種植面積在0.4萬(wàn)hm2以上，玉米種質(zhì)資源的優(yōu)劣將直接影響到上海地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展水平和農(nóng)民的收益水平。為此，本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了SSR引物篩選試驗(yàn)，以期對(duì)當(dāng)?shù)赜衩灼贩N真實(shí)性和一致性進(jìn)行鑒定，為上海地區(qū)玉米品種的遺傳資源評(píng)價(jià)和親緣關(guān)系分析提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司收集66份玉米自交系，見(jiàn)表1，包括甜玉米、糯玉米、少量甜糯玉米和普通玉米等類(lèi)型，各品種均于2015年4月在上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司實(shí)驗(yàn)基地種植，常規(guī)播種，于5月對(duì)每個(gè)自交系進(jìn)行取樣，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

采用DNA提取試劑盒[DP320，天根生化科技(北京)有限公司]提取玉米幼嫩葉片基因組DNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用NanoDrop2000c紫外可見(jiàn)光譜儀(Thermo公司)進(jìn)行DNA純度和濃度測(cè)定，稀釋至50 ng/μL工作液，于4 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

1.2.2 SSR引物篩選

以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板進(jìn)行SSR引物多態(tài)性篩選，引物試驗(yàn)所用SSR引物均由生工生物工程股份(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為10 μL，反應(yīng)混合液為2×ES Taq mix(康為公司)5 μL、50 ng/μL 的DNA模板 1 μL、10 μM 的引物 0.5 μL、ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物加入變性劑6 μL，95 ℃變性5 min，迅速于冰上冷卻，6%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，銀染法顯色。白熾燈下觀察電泳結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性篩選

以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板，對(duì)103對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果篩選出30對(duì)條帶清晰、擴(kuò)增穩(wěn)定、具有多態(tài)性的SSR引物，多態(tài)性比率為29.1%，見(jiàn)表2。

2.2 SSR標(biāo)記分析

利用30對(duì)多態(tài)性引物對(duì)66份玉米自交系進(jìn)行SSR分析，獲得的擴(kuò)增譜帶清晰，可用于不同玉米自交系材料的區(qū)分。結(jié)果表明，30對(duì)多態(tài)性SSR引物共擴(kuò)增出121條譜帶，每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)等位基因數(shù)2～8個(gè)，平均等位基因數(shù)為4個(gè)；多態(tài)性信息量(PIC)是用來(lái)評(píng)估每對(duì)引物標(biāo)記的多態(tài)性信息量水平，本試驗(yàn)篩選出的30對(duì)SSR引物中，PIC值為0.73～0.90，平均為0.82，表明所篩選的引物具有較豐富的遺傳多樣性。

表1 66份玉米自交系名稱(chēng)、類(lèi)型和顏色信息

表2 30對(duì)多態(tài)性SSR引物名稱(chēng)、等位基因數(shù)和多態(tài)性信息量

本研究選取多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好的引物作為核心引物，從表2可看出，PI C值超過(guò)0.85的有bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257、bnlg1265、umc1083和NC004等7個(gè)引物?？紤]特征譜帶、帶型統(tǒng)計(jì)和引物重復(fù)性等原因，最終確定將bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257、bnlg1484、umc1083、Phi072和NC004等8個(gè)引物作為一套核心引物，其中，引物bnlg615對(duì)材料“Z1222”和“Z492-P11”、引物bnlg1017對(duì)材料“Z397-P2”、引物bnlg1018對(duì)材料“Z1255”、引物bnlg1257對(duì)材料“Z1222”和“Z758-P18”、引物bnlg1484對(duì)材料“Z710-P8”、引物Phi072對(duì)材料“Z1258”有特征性譜帶。5對(duì)引物bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257和NC004組合可以將63份供試材料區(qū)分開(kāi)，見(jiàn)表3，其他材料需用擴(kuò)增特征譜帶引物區(qū)分。

此外，由于少數(shù)材料不易找出特征譜帶或不易區(qū)分，而可篩選的引物數(shù)量有限，只有個(gè)別PIC值較低的引物對(duì)其有特征性譜帶，或與其它引物組合才能區(qū)分開(kāi)，如引物bnlg1484(0.82)和Phi072(0.81)。

表3 部分引物組合區(qū)分自交系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板對(duì)103對(duì)引物進(jìn)行篩選，可獲得30對(duì)多態(tài)性高的SSR引物；再對(duì)66份玉米自交系進(jìn)行SSR分析，可擴(kuò)增出121條譜帶，每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)等位基因數(shù)2～8個(gè)，平均等位基因數(shù)為4.1個(gè)，平均PIC值為0.82，這與Xie等[6]研究的70對(duì)SSR引物在187份玉米自交系中檢測(cè)到的平均等位基因數(shù)(4.14)相近，但其平均PIC值(0.615)低于本試驗(yàn)；本試驗(yàn)檢測(cè)到的平均等位基因數(shù)和PIC值均高于肖木輯等[7]用70對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)37份遼寧省主要玉米自交系檢測(cè)的平均等位基因數(shù)(3.7)和平均PIC值(0.564)，分析原因，這可能與試驗(yàn)所用材料和所選引物不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所用SSR標(biāo)記的平均PIC均高于文獻(xiàn)報(bào)道，表明所篩選引物具有較豐富的遺傳多樣性。

SSR標(biāo)記具有簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富和具共顯性等優(yōu)勢(shì)，是構(gòu)建玉米指紋圖譜采用最多的標(biāo)記技術(shù)。DNA指紋圖譜的構(gòu)建應(yīng)利用盡量少的標(biāo)記分開(kāi)盡量多的品種，而多態(tài)性信息量高的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好，能區(qū)分更多的供試材料。因此，這就要求所用標(biāo)記的多態(tài)性要好，以降低成本、提高檢測(cè)效率。本研究選擇6個(gè)PIC值等于或高于0.85的SSR引物及2個(gè)PIC值低于0.85的引物組合成一套核心引物，其中5對(duì)引物bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257和NC004可將63份供試材料區(qū)分開(kāi)，這有助于進(jìn)一步構(gòu)建玉米自交系（上海地區(qū)）DN A指紋圖譜。但本研究?jī)H對(duì)上海地區(qū)玉米自交系材料進(jìn)行了分析，因此其等位基因數(shù)目和頻率值的準(zhǔn)確性還有待印證，對(duì)于不同地區(qū)、不同玉米自交系材料，應(yīng)針對(duì)引物合成成本、不同材料的引物多態(tài)性、引物穩(wěn)定性等多方面進(jìn)行調(diào)整和人工優(yōu)化，從而確定最佳引物組合。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米自交系（上海地區(qū)）進(jìn)行了SSR引物篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)今后優(yōu)異基因資源的發(fā)掘、品種權(quán)益的保護(hù)及種子的真實(shí)性和純度鑒定均具有重要意義。

[1]譚君,丁仲芳,孫仕賢,等.西南常用玉米自交系SSR指紋圖譜構(gòu)建[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,16(2):1-6.

[2]趙久然,王鳳格,郭景倫,等.中國(guó)玉米新品種DNA指紋庫(kù)建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的SSR核心引物的確定[J].玉米科學(xué),2003,11(2):3-5.

[3]吳渝生,楊文鵬,鄭用璉.3個(gè)玉米雜交種和親本SSR指紋圖譜的構(gòu)建[J].作物學(xué)報(bào),2003,29(4):496-500.

[4]李曉輝,李新海,高文偉,等.玉米雜交種DNA指紋圖譜及其在親子鑒定中的應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào),2005,31(3):386-391.

[5]李麗華,魏昕,潘光堂.20個(gè)骨干玉米自交系的SSR指紋圖譜構(gòu)建[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,20(6):1172-1175.

[6]Xie C,Zhang S, Li M, et al. Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines[J]. Journal of Genetics and Genomics,2007,34(8):738-748.

[7]肖木輯,李明順,孫有位,等.遼寧省主要玉米自交系的SSR遺傳多樣性分析[J].玉米科學(xué),2006,14(1):33-36.

2017-08-20

*為通訊作者