付葦婭，周春霞,2*，朱潘紅，鄭惠娜,2，洪鵬志,2，楊萍,2

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088) 2(廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東 深圳，518120)

3種離子強(qiáng)度下pH值對(duì)羅非魚肌球蛋白溶解度及分子構(gòu)象的影響

付葦婭1，周春霞1,2*，朱潘紅1，鄭惠娜1,2，洪鵬志1,2，楊萍1,2

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088) 2(廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東 深圳，518120)

研究了3種離子強(qiáng)度下，不同pH值(2.0～12.0)對(duì)羅非魚(Oreochromisniloticus)肌球蛋白溶解性、表面疏水性、SDS-PAGE及α-螺旋含量的影響。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度增大使肌球蛋白等電點(diǎn)向酸性方向偏移，在低離子強(qiáng)度(1 mmol/L KCl)、生理離子強(qiáng)度(150 mmol/L KCl)及高離子強(qiáng)度(600 mmol/L KCl)條件下，其溶解度最小的pH值分別為5.5、5.0和4.5，極端酸性(pH 2.0)和堿性(pH 11.0～12.0)條件下，肌球蛋白溶解度較高(>80%)；在中性和高離子強(qiáng)度條件下，分子表面疏水性低，α-螺旋含量高，穩(wěn)定性較好；酸誘導(dǎo)去折疊過(guò)程中，在等電點(diǎn)附近表面疏水性較低，在偏離等電點(diǎn)的酸性條件下，表面疏水性增加，而極端酸性條件下展開(kāi)的肌球蛋白分子可能會(huì)發(fā)生折疊，分子降解及靜電相互作用導(dǎo)致溶解度增大；堿誘導(dǎo)去折疊過(guò)程中，表面疏水性隨pH值的升高而增加，肌球蛋白重鏈通過(guò)二硫鍵形成聚合物；在中性、堿性和極端酸性條件下，α-螺旋含量隨著鹽濃度的增加而增大，高鹽對(duì)肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用?？傮w分析，在高鹽濃度和極端堿性條件下，肌球蛋白呈現(xiàn)“熔球態(tài)”構(gòu)象。

羅非魚肌球蛋白；pH值；離子強(qiáng)度；去折疊；溶解度；構(gòu)象

羅非魚是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要魚類之一。魚肌肉蛋白的主要成分是肌球蛋白，占肌原纖維蛋白的55%～60%，決定了魚肌肉鹽溶性蛋白的溶解性及相關(guān)功能特性[1-2]。肌球蛋白分子含有2個(gè)球狀頭部和1個(gè)棒狀尾部，由2條分子質(zhì)量為220 kDa的肌球蛋白重鏈(MHC)和4條分子質(zhì)量為17～22 kDa的肌球蛋白輕鏈(LHC)組成[1]。在體外受pH值、離子強(qiáng)度、熱處理等的影響，魚肌肉蛋白分子結(jié)構(gòu)、溶解度及相關(guān)性質(zhì)發(fā)生變化，尤其是MHC的降解或聚合[3-4]。在廣泛pH范圍(2～12)內(nèi)，低鹽(10 mmol/L NaCl)條件下酸誘導(dǎo)鱈魚肌肉MHC降解，而堿性條件下MHC通過(guò)二硫鍵形成聚合物；而高鹽(600 mmol/L NaCl)使肌肉蛋白等電點(diǎn)向酸性方向偏移約2個(gè)pH單位，且在酸性條件下發(fā)生聚集，堿性條件下分子發(fā)生重折疊[3]。極端酸/堿處理都會(huì)導(dǎo)致鱈魚MHC的球狀頭部構(gòu)象完全改變，LHC大部分損失，在極端酸性(pH 2.5)條件下，肌球蛋白分子棒狀尾部完全解離，而極端堿性(pH 11.0)條件下分子不發(fā)生解離，再調(diào)節(jié)pH值回到中性(pH 7.5)時(shí)，肌球蛋白棒狀尾部折疊成原有構(gòu)象，而球狀頭部不能重新折疊回原有構(gòu)象[5]；酸/堿處理前加鹽(600 mmol/L NaCl)對(duì)體系有保護(hù)作用，調(diào)節(jié)回中性(pH 7.3)后肌球蛋白分子變性程度較小[6]。極低離子強(qiáng)度條件(不含鹽)下，pH值4～7時(shí)，鮭魚肌球蛋白的溶解度極低，隨著離子強(qiáng)度(0～0.5 mol/L KCl)增加，靜電和疏水相互作用變化導(dǎo)致溶解度增大[7]，通常認(rèn)為一定范圍內(nèi)這種鹽溶(salting-in)效應(yīng)與Cl-在蛋白表面選擇性結(jié)合使蛋白分子間靜電斥力增強(qiáng)有關(guān)，且隨鹽濃度的進(jìn)一步增大，高鹽離子會(huì)屏蔽蛋白質(zhì)分子表面電荷，壓縮雙電層，產(chǎn)生鹽析(salting-out)效應(yīng)[8-9]，鮭魚肌球蛋白體系鹽濃度高于0.5 mol/L KCl時(shí)，溶解度即開(kāi)始下降[7]；在低于等電點(diǎn)的酸性(pH 3.5)條件下，帶正電的蛋白分子與Cl-結(jié)合，豬肉肌原纖維蛋白的溶解度也隨NaCl濃度(低于0.8 mol/L)的增加而下降[10]。但是，在等電點(diǎn)和中性條件下，豬肉肌原纖維蛋白的溶解度隨NaCl濃度(0.2～0.8 mol/L)的增加而增大，且在此鹽溶過(guò)程中靜電相互作用增加不明顯[10]，其鹽溶機(jī)理主要與陽(yáng)離子(Na+)高水合程度有關(guān)[10-11]。也有研究報(bào)道，當(dāng)體系KCl濃度從0.1增加0.5 mol/L時(shí)，秘魯魷魚肌原纖維蛋白分子所帶電荷增加，同時(shí)高鹽離子的屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，分子間相互吸引作用的下降導(dǎo)致溶解度增加[12]。因此，離子對(duì)蛋白質(zhì)的影響非常復(fù)雜，Na+和K+對(duì)蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定性的影響也不完全相同[13]，肌肉蛋白的溶解可能與蛋白來(lái)源、體外離子強(qiáng)度、離子類型及pH值等因素的共同影響有關(guān)，不同條件下的鹽溶機(jī)理可能不完全相同，其加工應(yīng)用特性也不一樣。為此，本研究以羅非魚肌球蛋白為對(duì)象，試驗(yàn)3種典型的KCl濃度條件下，廣泛pH范圍內(nèi)肌球蛋白分子去折疊過(guò)程中分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，以探討肌球蛋白溶解性與構(gòu)象的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

鮮活羅非魚：2016年3月～8月購(gòu)自湛江當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，體重為(900±100)g，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，手工去內(nèi)臟、去頭、去皮，取背部白肉、分裝、-75 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

5-腺苷三磷酸二鈉鹽(ATP)、二硫蘇糖醇(DTT)，廣州齊云生物科技有限公司；乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，上海源葉生物科技有限公司；三羥基甲基氨基甲烷(Tris)，廣州化學(xué)試劑廠；快速Lowry法蛋白含量測(cè)定試劑盒(2000T)，上海荔達(dá)生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)、考馬斯亮藍(lán)染色液(常規(guī)法)，碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(寬)，寶生物工程(大連)有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)、6-丙?；?2-(N，N二甲胺基)萘(N,N-dimethyl-6-propionyl-2-naphthylamine，PRODAN)，購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；以上試劑均為分析純；馬來(lái)酸(maleic acid)，美國(guó)MP公司，為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?。其余試劑均為分析純?/p>

1.2儀器與設(shè)備

Avanti J-26sxp高效離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì)，RF-5301P熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；ECP3000電泳儀和DYCZ-24DN雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠；UVP凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司；Chirascan圓二色譜儀，英國(guó)應(yīng)用光物理公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參照STAFFORD等[14]的方法，進(jìn)行了改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行，所用溶液均預(yù)先冷卻到4℃。取新鮮攪碎的魚肉200 g，加5倍(g/mL)緩沖液A(20 mmol/L 2HO2·NaH2PO4-12HO2·Na2HPO4，pH 7.0，0.02% NaN3)，高速勻漿(20 000 r/min，30 s)，浸提15 min后離心(5 500×g，10 min)，取沉淀重復(fù)上述過(guò)程2次。向所得沉淀中加入3倍(g/mL)提取液B(0.45 mol/L KCl，5 mmol/L ATP，7.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L DTT，pH 6.4)，攪拌15 min后離心(10 000×g，10 min)。4層紗布過(guò)濾，取濾液用9倍(mL/mL)蒸餾水稀釋，靜置10 min后離心(6 000 g，10 min)得沉淀。向沉淀中加入1/5倍(g/mL)緩沖液C(0.12 mol/L maleic acid，3 mol/L KCl，0.6 mmol/L DTT，pH 7.5)，混勻后放置2 h，混合體系中添加1/10倍(g/mL)ATP溶液D(0.11 mol/L ATP，55 mmol/L MgCl2，5.5 mmol/L EGTA，pH 7.5)溶液后，攪拌1 h。加入硫酸銨至飽和度40%～45%進(jìn)行分級(jí)，沉淀于透析液E(20 mmol/L Tris-HCl，0.6 mol/L KCl，0.1 mmol/L DTT，pH 7.0)中透析至無(wú)SO42-檢出，然后離心(50 000×g，60 min)，所得上清液即為肌球蛋白溶液。采用Lowry法[15]檢測(cè)上清液蛋白含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)物，測(cè)量波長(zhǎng)為750 nm，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%分離膠，12%濃縮膠)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算蛋白質(zhì)純度高于94%。

1.3.2 三種離子強(qiáng)度下酸/堿去折疊肌球蛋白樣液的制備

用透析液E稀釋肌球蛋白溶液至2.0 mg/mL，分別取50 mL溶液用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至6.0、5.0、4.0、3.0和2.0，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，各條件下溶液于低溫條件下攪拌30 min后離心(10 000 g，15 min，4℃)，所得上清液即為600 mmol/L KCl中酸/堿去折疊肌球蛋白樣液。

分別用低離子強(qiáng)度透析液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L KCl，pH 7.0)和生理離子強(qiáng)度透析液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L KCl，pH 7.0)透析肌球蛋白，采用LOWRY法[15]檢測(cè)測(cè)定透析后溶液的蛋白含量，并用對(duì)應(yīng)的透析液稀釋肌球蛋白濃度至2.0 mg/mL，同上調(diào)節(jié)體系的pH值，離心所得上清液即為1 mmol/L KCl和150 mmol/L KCl溶液中酸/堿去折疊肌球蛋白樣液。各操件均在低溫條件下進(jìn)行。

1.3.3 溶解度的測(cè)定

用各樣品對(duì)應(yīng)的緩沖液適當(dāng)稀釋上述各處理的樣品上清液，采用lowry法[15]測(cè)蛋白含量，肌球蛋白的溶解度按離心所得上清液蛋白含量占未處理前溶液中總蛋白含量的百分比計(jì)算。每個(gè)樣品測(cè)定3次以上。

1.3.4 電泳分析

SDS-PAGE電泳根據(jù)LAEMMLI[16]的方法，采用分離膠濃度為12%、濃縮膠濃度為5%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行還原(含β-巰基乙醇)及非還原(不含β-巰基乙醇)電泳。

1.3.5 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS和PRODAN熒光探針?lè)╗17]檢測(cè)可溶性蛋白的表面疏水性。將經(jīng)過(guò)酸/堿去折疊處理的肌球蛋白上清液逐步稀釋(0.062 5、0.125、0.25和0.5 mg/mL)，取不同濃度的溶液各4 mL，分別加入20 μL的ANS溶液(8.0 mmol/L ANS，0.01 mol/L 2HO2·NaH2PO4-12HO2·Na2HPO4，pH 7.0)和10 μL的PRODAN溶液(1.0 mmol/L PRODAN，甲醇)，振蕩，分別靜置10 min和15 min(避光)，測(cè)定樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度(FI)。本實(shí)驗(yàn)中，ANS熒光探針檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為374 nm和485 nm，PRODAN熒光探針檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為365 nm和465 nm，狹縫寬均為5 nm。減去各樣品溶液未加探針時(shí)的熒光強(qiáng)度即為每種蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度值(RFI)。以RFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始段的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)(ANS-S0或PRODAN-S0)。每個(gè)樣品測(cè)定3次以上。

1.3.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)含量采用圓二色譜儀檢測(cè)。將經(jīng)過(guò)酸/堿去折疊處理的肌球蛋白上清液稀釋至蛋白濃度0.1 mg/mL，進(jìn)行圓二色譜測(cè)定。波長(zhǎng)掃描范圍為190～260 nm，樣品池光徑為1 mm，上樣量0.3 mL，測(cè)量溫度為5 ℃，測(cè)定分辨率為0.5 mm，掃描速度為100 nm/min，靈敏度為20 mdeg，響應(yīng)時(shí)間為0.25 s，以未添加肌球蛋白的緩沖液做空白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次掃描的平均值。α-螺旋含量的計(jì)算公式如下[18]：

(1)

(2)

式中：[θ]obs為蛋白質(zhì)溶液在222 nm處測(cè)得的橢圓率，mdeg；MW為肌球蛋白分子的平均氨基酸殘基分子質(zhì)量，取115 g/mol；c為測(cè)量的肌球蛋白溶液的濃度，0.1 mg/mL；L為樣品測(cè)量時(shí)的比色皿光程長(zhǎng)度，cm；[θ]222為222 nm處的摩爾橢圓率，deg·cm2/dmol。每個(gè)樣品測(cè)定2次取平均值。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用JMP 7.0軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性(p<0.05)分析使用多重比較。采用Origin 7.5軟件對(duì)各指標(biāo)的變化趨勢(shì)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)羅非魚肌球蛋白溶解性的影響

選取0.001、0.15和0.6 mol/L KCl三種代表性的鹽濃度，分別試驗(yàn)pH值對(duì)肌球蛋白溶解度的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 三種離子強(qiáng)度下pH值對(duì)羅非魚肌球蛋白溶解性的影響Fig.1 Effect of pH on solubility of tilapia myosin at three ionic strength levels

前者為低離子強(qiáng)度溶液，體外在此低離子強(qiáng)度條件下，肌球蛋白組裝成纖絲，呈不溶狀態(tài)；0.15 mol/L為肌肉組織的生理離子強(qiáng)度，此狀態(tài)下肌球蛋白是不溶的，表現(xiàn)為分散的粗絲狀態(tài)；后者是可提取肌球蛋白的高離子強(qiáng)度，此狀態(tài)下肌球蛋白呈單體狀態(tài)[9,19]。由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，3種KCl濃度條件下，肌球蛋白溶解度隨pH值變化的曲線趨勢(shì)基本相似，其溶解度最小的pH值分別為5.5、5.0和4.5(p<0.05)；而隨著pH值偏離等電點(diǎn)，由于肌球蛋白所帶凈電荷的增多導(dǎo)致蛋白分子間靜電斥力增強(qiáng)，肌球蛋白溶解度增大，但不同pH值和鹽濃度條件下的溶解度不同。(1)在0.001 mol/L KCl條件下，在pH值5.0～7.0范圍內(nèi)，肌球蛋白的溶解度較低(<15%)；在偏離此范圍的酸性條件下，溶解度迅速增加，pH值由5.0到4.0過(guò)程中溶解度由7.05%升高至68.5%，且在極端酸性(pH 2.0～3.0)條件下，溶解度在80%左右；當(dāng)pH值由7.0至10.0的過(guò)程中肌球蛋白的溶解度迅速升高，且在極端堿性(pH 11.0～12.0)條件下，溶解度達(dá)到80%以上。(2)在0.15 mol/L KCl條件下，pH值從5.0向酸性方向偏移，溶解度的變化規(guī)律與低離子強(qiáng)度條件下的變化類似；pH值由等電點(diǎn)向堿性方向變化時(shí)，當(dāng)pH值由6.0上升到7.0過(guò)程中，溶解度迅速增加達(dá)到51.6%，pH值由7.0到11.0變化過(guò)程中，溶解度的變化不太劇烈，而在極端堿性條件下，溶解度高于80%。(3)在0.6 mol/L KCl條件下，在pH值4.5～3.0范圍內(nèi)，肌球蛋白的溶解度較低(<13%)，當(dāng)pH值從3.0降低至2.0時(shí)，溶解度明顯增大(p<0.05)，達(dá)到85.4%；而pH值從4.5到7.0時(shí)，溶解度急劇增大(p<0.05)到100%；在極端堿性條件下，溶解度高于90%。(4)比較而言，隨著離子強(qiáng)度的增大，肌球蛋白的等電點(diǎn)向酸性方向偏移，且離子強(qiáng)度越大偏移越大，其原因可能是Cl-與帶正電氨基酸的結(jié)合能力比K+與帶負(fù)電氨基酸的結(jié)合能力更強(qiáng)[3,9]；由等電點(diǎn)范圍向酸性偏移(pH 5.0→3.0)的過(guò)程中，肌球蛋白的溶解度均是隨著離子強(qiáng)度的增大而減小，而由等電點(diǎn)范圍向堿性偏移(pH 5.0→9.0)的過(guò)程中，肌球蛋白的溶解度均是隨著離子強(qiáng)度的增大而增大。

2.2pH值對(duì)肌球蛋白電泳圖譜的影響

3種離子強(qiáng)度下，肌球蛋白經(jīng)酸/堿去折疊處理后的還原(添加β-巰基乙醇)和非還原(未添加β-巰基乙醇)電泳結(jié)果如圖2所示。

因溶解度差異，本部分僅列出代表性的幾個(gè)樣品來(lái)說(shuō)明。對(duì)于溶解度較低的pH范圍(pH 4.0～6.0)，肌球蛋白條帶較弱。在低離子強(qiáng)度條件下，在pH 4.0～5.0時(shí)基本沒(méi)有蛋白條帶出現(xiàn)；在生理離子強(qiáng)度和高離子強(qiáng)度條件下，在pH 5.0～6.0時(shí)蛋白條帶極其微弱，與溶解度的檢測(cè)結(jié)果相一致(圖譜未列出)。(1)在0.6 mol/L KCl溶液中，中性和堿處理的各蛋白樣品在非還原電泳圖上均出現(xiàn)分子質(zhì)量高于200 kDa的條帶，且極端堿性(pH 11.0)條件下凝膠頂部多聚體更明顯，表明堿性條件下肌球蛋白更容易聚集；而經(jīng)β-巰基乙醇處理后，肌球蛋白重鏈(約200 kDa)和3條輕鏈(約26、21和17 kDa)條帶清晰，未出現(xiàn)分子質(zhì)量高于200 kDa的條帶，由此表明聚合物主要由肌球蛋白重鏈(MHC)彼此間通過(guò)二硫鍵形成；而極端酸性條件(pH 2.0和3.0)下蛋白條帶相對(duì)較弱，但本實(shí)驗(yàn)中，pH 2.0時(shí)溶解度仍高于80%，推測(cè)可能是此條件下肌球蛋白重鏈降解。類似的結(jié)果在pH對(duì)鱈魚肌肉蛋白可溶性組分的研究中也有報(bào)道，當(dāng)鹽濃度為600 mmol/L NaCl時(shí)，pH 2.0～5.0之間可溶性蛋白組分中肌球蛋白重鏈消失，推測(cè)可能是鹽析導(dǎo)致的蛋白質(zhì)沉淀[4]，也可能是高鹽條件下SDS反離子結(jié)合度增大，在SDS-PAGE樣品處理過(guò)程中形成膠束被去除了[20]。(2)生理離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度條件下，極端酸/堿去折疊處理的肌球蛋白均出現(xiàn)了分子質(zhì)量高于200 kDa的條帶，且堿性和(或)生理離子強(qiáng)度下肌球蛋白重鏈的聚集更明顯，而經(jīng)β-巰基乙醇處理后，均出現(xiàn)清晰的肌球蛋白重鏈和輕鏈條帶，而低離子強(qiáng)度和中性pH條件下，蛋白條帶很弱，與溶解度的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3pH值對(duì)羅非魚肌球蛋白表面疏水性的影響

采用ANS和PRODAN兩種外源熒光探針檢測(cè)可溶性肌球蛋白的表面疏水性，探討蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[6,17]。由圖3可知，在廣泛pH范圍內(nèi)，肌球蛋白的表面疏水性不同，且3種離子強(qiáng)度條件下，表面疏水性隨pH值的變化趨勢(shì)類似。(1)在中性條件下，肌球蛋白的表面疏水性較低，2種熒光探針檢測(cè)的疏水性值都較??；在堿性條件下，隨著pH值的升高，PRODAN-S0和ANS-S0值增大，表明肌球蛋白分子部分展開(kāi)，表面疏水基團(tuán)暴露；且在中性和堿性條件下，隨著離子強(qiáng)度的增加，肌球蛋白分子的聚集狀態(tài)變化，表面疏水性增大。低離子強(qiáng)度條件下，肌球蛋白分子處于聚集狀態(tài)，表面疏水性較低，而體外高離子強(qiáng)度條件下蛋白質(zhì)分子間靜電相互作用被破壞，分子解離成單體，尾部的疏水基團(tuán)充分暴露，結(jié)合更多的探針指示物[3-4]，因此在0.6 mol/L KCl溶液中，肌球蛋白的溶解性和表面疏水性明顯增加。(2)在酸性范圍內(nèi)，表面疏水性的變化比較復(fù)雜，表明肌球蛋白分子在酸性條件下的穩(wěn)定性較差。在pH 2.0～5.0范圍內(nèi)，隨著pH值的降低，ANS-S0值增大(p<0.05)，可能與酸性條件下肌球蛋白分子的展開(kāi)及此條件下帶凈正電荷的蛋白分子與ANS間的靜電相互作用有關(guān)。ANS是一種帶負(fù)電荷的陰離子熒光探針，可與蛋白表面的陰/陽(yáng)離子基團(tuán)通過(guò)離子對(duì)的形成發(fā)生強(qiáng)結(jié)合，因此ANS-S0所反映的是蛋白質(zhì)表面疏水性以及ANS與蛋白質(zhì)分子間的靜電作用[17]；比較而言，PRODAN是一種不帶電荷的溶劑敏感性探針，可以消除測(cè)量過(guò)程中可能存在的靜電相互作用的干擾[21]。因此，在酸性條件下，PRODAN-S0值明顯低于ANS-S0值，且極端酸性(pH 2.0～3.0)條件下，PRODAN-S0值低于中性和堿性條件下的PRODAN-S0值，由此推測(cè)肌球蛋白在酸性條件下的溶解可能受靜電相互作用的影響；在0.15 mol/L KCl和0.001 mol/L KCl條件下，肌球蛋白分子表面疏水性最低出現(xiàn)在pH 5.0，在偏離等電點(diǎn)的酸性范圍內(nèi)，隨著pH值的降低，PRODAN-S0值先增大后減小，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，pH 2.0條件下的PRODAN-S0值均低于pH 3.0，表明在極端酸性條件下肌球蛋白分子展開(kāi)到一定程度后，進(jìn)一步降低pH值也可能會(huì)使蛋白分子重新折疊，導(dǎo)致表面疏水性下降[22]；此外，等電點(diǎn)附近的蛋白構(gòu)象呈現(xiàn)特殊變化，pH 6.0時(shí)表面疏水性值較大，因此時(shí)溶解度極低，其結(jié)構(gòu)變化的機(jī)理，還需借助新技術(shù)進(jìn)一步研究。(3)總體分析，堿誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊過(guò)程中，分子部分展開(kāi)，表面疏水性隨pH值的升高而增加，靜電相互作用和疏水相互作用導(dǎo)致溶解度增加，而酸誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊過(guò)程中，在等電點(diǎn)附近表面疏水性較低，在偏離等電點(diǎn)的酸性條件下，表面疏水性增加，而在極端酸性條件下展開(kāi)的肌球蛋白分子可能會(huì)發(fā)生折疊；結(jié)合溶解度的影響分析，分子在極端酸性條件下的溶解主要受分子降解及靜電相互作用的影響。

2.4pH值對(duì)肌球蛋白α-螺旋含量的影響

圖4 三種離子強(qiáng)度下pH值對(duì)羅非魚肌球蛋白α-螺旋含量的影響Fig.4 Effect of pH onα-helix content of tilapia myosin at three ionic strength levels

肌球蛋白分子包含球狀頭部和棒狀尾部，棒狀尾部95%是由α-螺旋構(gòu)成，而球狀頭部含有的α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例較少[23]，因此α-螺旋含量的變化可以反映出棒桿狀尾部的變化。不同離子強(qiáng)度下廣泛pH值對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響用圓二色譜進(jìn)行表征。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，在中性和堿性條件下，肌球蛋白的圓二色譜圖在208 nm和222 nm處均出現(xiàn)2個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶(光譜圖未列出)，這是典型的α-螺旋特征峰，由此計(jì)算α-螺旋含量。由圖4可知，3種離子強(qiáng)度下，pH值對(duì)可溶性肌球蛋白分子α-螺旋含量的影響與溶解性的變化趨勢(shì)類似，等電點(diǎn)pH值附近α-螺旋含量最低，隨著pH值偏離等電點(diǎn)α-螺旋含量升高，堿性條件下α-螺旋先升高后稍微下降。根據(jù)DUMETZ等[24]的研究報(bào)道，pH值對(duì)肌球蛋白α-螺旋含量的影響主要是改變肌球蛋白帶電氨基酸和肌球蛋白表面的α-羥基及α-氨基末端的質(zhì)子化程度。在等電點(diǎn)附近蛋白分子表面凈電荷接近零，分子的靜電斥力下降導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生疏水聚集，肌球蛋白的溶解性和α-螺旋含量下降；而偏離等電點(diǎn)的酸性和堿性條件下，蛋白質(zhì)所帶凈電荷增加，肌球蛋白逐漸恢復(fù)單體狀態(tài)，α-螺旋含量上升；但在極端酸性和堿性條件下，蛋白變性增加，α-螺旋含量降低。在0.5 mol/L NaCl溶液中，當(dāng)pH值由7.0下降到5.5時(shí)，靜電作用和氫鍵穩(wěn)定性的變化導(dǎo)致豬肌球蛋白α-螺旋含量由87.4%下降到15.8%[7]。此外，pH值對(duì)肌球蛋白α-螺旋含量的影響也與鹽濃度有關(guān)，在中性、堿性和極端酸性(pH 2.0)條件下隨著鹽濃度的增加，肌球蛋白的α-螺旋含量增加，可能與高鹽離子掩蔽蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，減弱電荷對(duì)氫鍵的影響有關(guān)。

3 結(jié)論

pH值對(duì)肌球蛋白溶解度及構(gòu)象的影響與鹽濃度有關(guān)。離子強(qiáng)度增大使肌球蛋白的等電點(diǎn)向酸性方向偏移，高鹽對(duì)肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用；在中性和高離子強(qiáng)度條件下，羅非魚肌球蛋白重鏈(約200 kDa)和3條輕鏈(約26,21和17 kDa)條帶清晰，分子的穩(wěn)定性較好；隨著pH值偏離中性環(huán)境，肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊；堿誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊過(guò)程中，分子部分展開(kāi)，靜電相互作用和疏水相互作用導(dǎo)致溶解度增加，肌球蛋白重鏈(MHC)彼此間通過(guò)二硫鍵形成聚合物；酸誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊過(guò)程中，在偏離等電點(diǎn)的酸性條件下，分子部分展開(kāi)和降解，而極端酸性條件下展開(kāi)的肌球蛋白分子可能會(huì)發(fā)生折疊，分子降解及靜電相互作用導(dǎo)致溶解度增加。

[1] HARRINGTON W F,RODGERS M E.Myosin[J].Annual Review of Biochemistry,1984,53(1):35-73.

[2] AZADIAN M,MOOSAVI-NASAB M,ABEDI E.Comparison of functional properties and SDS-PAGE patterns between fish protein isolate and surimi produced from silver carp[J].European Food Research and Technology,2012,235(1):83-90.

[3] THAWORNCHINSOMBUT S,PARK J W.Role of pH in solubility and conformational changes of Pacific whiting muscle proteins[J].Journal of Food Biochemistry,2004,28(2):135-154.

[4] THAWORNCHINSOMBUT S,PARK J W.Role of ionic strength in biochemical properties of soluble fish proteins isolated from cryoprotected Pacific whiting mince[J].Journal of Food Biochemistry,2005,29(2),132-151.

[5] KRISTINSSON H G,HULTIN H O.Effect of low and high pH treatment on the functional properties of cod muscle proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(17):5 103-5 110.

[6] RAGHAVAN S,KRISTINSSON H G.Conformational and rheological changes in catfish myosin during alkali-induced unfolding and refolding[J].Food Chemistry,2008,107(1):385-398.

[7] LIN T M,PARK J W.Solubility of salmon myosin as affected by conformational changes at various ionic strengths and pH[J].Journal of Food Science,1998,63 (2):215-218.

[8] HAMM R.Biochemistry of meat hydration[J].Advances in Food Research,1960,10(2):355-463.

[9] PUOLANNE E,HALONEN M.Theoretical aspects of water-holding in meat[J].Meat Science,2010,86 (1):151-165.

[10] WU Li-jun,WU Tao,WU Ju-qing,et al.Effects of cations on the “salt in” of myofibrillar proteins[J].Food Hydrocolloids,2016,58(6):179-183.

[11] VALLE-DELGADO J J,MOLINA-BOLIVAR J A,GALISTEO-GONZALEZ F,et al.Evidence of hydration forces between proteins[J].Current Opinion in Colloid & Interface Science,2011,16(6):572-578.

[12] ZHANG Rui,ZHOU Ru,PAN Wei-chun,et al.Salting-in effect on muscle protein extracted from giant squid (Dosidicus gigas)[J].Food Chemistry,2017,215:256-262.

[13] JUNGWIRTH P,CREMER P S.Beyond Hofmeister[J].Nature Chemistry,2014,6(4):261-263.

[14] HWANG G,WATABE S,HASHIMOTO K.Changes in carp myosin ATPase induced by temperature acclimation[J].Journal of Comparative Physiology B,1990,160 (3):233-239.

[15] LOWRY O H,ROSEBROUGH N J,FARR A L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):265-275.

[16] LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227 (5 259):680-685.

[17] HASKARD C A,LI-CHAN E C Y.Hydrophobicity of bovine serum albumin and ovalbumin determined using uncharged (PRODAN) and anionic (ANS-) fluorescent probes[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(7):2 671-2 677.

[18] OGAWA M,KANAMARU J,MIYASHITA H,et al.Alpha-helical structure of fish actomyosin:changes during setting[J].Journal of Food Science,1995,60(2):297-299.

[19] CHEN Xing,ZOU Yu-feng,HAN Min-yi,et al.Solubilisation of myosin in a solution of low ionic strength L-histidine:Significance of the imidazole ring[J].Food Chemistry,2016,196:42-49.

[20] BIESHEUVEL P M,VAN SOESTBRGEN M.Counterion volume effects in mixed electrical double layers[J].Journal of Colloid and Interface Science,2007,316(2):490-499.

[21] WEBER G,FARRIS F J.Synthesis and spectral properties of a hydrophobic fluorescent probe:6-propionyl-2-(dimethylamino) naphthalene[J].Biochemistry,1979,18(14):3 075-3 078.

[22] GOTO Y,FINK A L.Conformational states in β-lactamase:molten-globule states at acidic and alkaline pH with salt[J].Biochemistry,1989,28(3):945-952.

[23] CAO Yun-gang,XIONG You-ling.Chlorogenic acid-mediated gel formation of oxidatively stressed myofibrillar protein[J].Food Chemistry,2015,180,235-243.

[24] DUMETZ A C,CHOCKLA A M,KALER E W,et al.Effects of pH on protein-protein interactions and implications for protein phase behavior[J].Biochimica et Biophysica Acta,2008,1 784(4):600-610.

EffectofpHontilapiamyosinsolubilityandconformationunderthreeionicstrengthsolutions

FU Wei-ya1,ZHOU Chun-xia1,2*,ZHU Pan-hong1, ZHENG Hui-na1,2,HONG Peng-zhi1,2,YANG Ping1,2

1 (College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China) 2 (Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University,Shenzhen 518120,China)

Effect of various pH (2.0-12.0) on solubility of tilapia myosin and surface hydrophobicity, SDS-PAGE and α-helix contents of tilapia myosin were investigated at three ionic strength levels. Results showed that, in the experimental range, with increasing of ionic strength, the isoelectric point of myosin was shifted to acidic pH. In low ionic strength (1 mmol/L KCl), physiological ionic strength (150 mmol/L KCl) and high ionic strength (600 mmol/L KCl) solution, the pH of the minimum solubilities of myosin was 5.5, 5.0 and 4.5 respectively. At extreme acid (pH 2.0) and alkali (pH 11.0-12.0) condition, the solubility of myosin was higher than 80%. Under the neutral and high ionic strength, surface hydrophobicity was low and α-helix content was high and stability of myosin was good. During acid-induced refolding process, lower surface hydrophobicity was observed near the isoelectric point, and surface hydrophobicity increased under the acid condition of deviating from the isoelectric point. However, unfolded myosin might refold partly under extreme acidic conditions, and molecular degradation and electrostatic interactions could lead to the high solubility. During alkali-induced refolding process, the surface hydrophobicity increased with the rising of pH value, the macro-molecular polymer was formed through disulfide bonding between myosin heavy chains. In neutral pH condition, alkaline and extreme acidic conditions, α-helix content increased with the increase of salt concentration, and therefore high salt could protect the secondary structure of myosin. All above results indicated that myosin molecule could be unfolded to an intermediate sate similar to “molten globule” at extreme alkali and high salt condition.

tilapia myosin; pH; ionic strength; unfolding; solubility; conformation

碩士研究生(周春霞副教授為通訊作者，E-mail：chunxia.zhou@163.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201389)；廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2013KJCX0098)；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研合作專項(xiàng)(2013A090100009)

2017-02-12，改回日期：2017-03-24

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014028