陳光，史娟

（1.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中723000；2.陜西理工大學化學與環(huán)境科學學院，陜西漢中723000）

桂花黃色素微波預(yù)處理提取及抑菌作用研究

陳光1，史娟2

（1.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中723000；2.陜西理工大學化學與環(huán)境科學學院，陜西漢中723000）

以漢中桂花為原料，通過微波輔助提取法，以乙醇濃度、回流時間、回流溫度及料液比等因素為變量，黃色素提取率為響應(yīng)值，設(shè)計正交試驗得到黃色素提取最佳工藝條件。試驗結(jié)果表明，最佳提取工藝為乙醇濃度80%、回流時間80 min、回流溫度80℃、料液比1∶20（g/mL）。在此條件下，桂花黃色素提取率可達18.42%。同時，抑菌試驗證實，桂花黃色素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、沙門氏菌均有較好的抑菌效果。對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最為顯著，其最低抑菌濃度（MIC）為1.0 mg/mL；對大腸桿菌、枯草桿菌、沙門桿菌的MIC均為1.5 mg/mL。此外，桂花黃色素對食品還具有一定的防腐功能。

桂花黃色素；微波預(yù)處理；提??；抑菌活性

桂花（Osmanthus fragrans）是中國木犀屬眾多樹木的習稱，是我國特產(chǎn)的珍貴芳香花卉，產(chǎn)于云南西北部，陜西南部等地[1]。陜西漢中的漢桂，是桂花中的佼佼者，漢桂花具有花瓣多，花莖大，花期長等特點，年開花兩次，以秋季為盛。漢桂是珍貴的觀賞花卉，桂花精油是名貴香料，桂花色素則是很好的天然色素資源[2-3]。目前對桂花的研究主要集中在化學成分，如黃酮提取[4-5]、多糖提取[6]和精油提取[7]等方面。此外，還有一些桂花色素清除亞硝酸鹽作用及其種皮色素抑菌活性的報道[8-9]。而關(guān)于桂花黃色素抑菌的研究少有報道。已有文獻證實相當數(shù)量的天然色素，除可用于食品著色外，亦具備防腐，抗氧化及抑菌等生理活性[10-15]。

本文采用微波預(yù)處理，聯(lián)合乙醇回流提取桂花中的黃色素，探究乙醇濃度、回流時間、回流溫度及料液比對提取率的影響，正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化。抑菌試驗探究桂花黃色素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏菌的抑菌活性，為桂花黃色素作為天然食品防腐劑在工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢桂花：2015年10月份采自陜西理工大學南校區(qū)，洗凈干燥后，研碎過60目篩，密封備用；無水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；供試菌種為大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmonella typhi）：陜西理工學院生物工程學院微生物實驗室提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、去離子水1 000 mL、pH7.0～7.2，高壓蒸汽滅菌備用；實驗用水為自制去離子水。

DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；AL204-IC電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WF-2000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng)：上海屹堯分析儀器有限公司；HH系列型恒溫水浴鍋：黃驊市渤海電器；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Cary50型紫外可見分光光度計：美國瓦里安中國有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 色素的提取及純化

桂花粉末微波預(yù)處理→乙醇回流提取→4℃下靜置12 h→真空抽濾→濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得浸膏→柱層析洗脫→收集黃色部分溶液→旋干得到桂花黃色素

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

以桂花黃色素提取率為指標，固定桂花粉末稱樣量為5 g，微波功率600 W，微波預(yù)處理時間6 min，依次改變乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%），回流時間（40、60、80、100、120 min），回流溫度（50、60、70、80、90 ℃），料液比 [1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）]，分別考察乙醇濃度、回流時間、回流溫度及料液比對色素提取率的影響。各單因素試驗重復3次，并取平均值。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、回流時間、回流溫度和料液比為因素進行四因素三水平正交試驗，進一步確定最佳提取工藝條件。

1.2.4 抑菌活性試驗

準確稱取不同質(zhì)量的桂花黃色素提取物，用DMSO 精確配成 25、20、15、10、5、2.5 mg/mL 系列濃度的溶液，高溫滅菌后備用。分別吸取已制備好的菌懸液（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、沙門氏菌）0.5 mL，滴入培養(yǎng)基平板上，用滅菌后的涂布器均勻涂抹[12-15]，多余菌液吸走。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table1 Four factors and three levels orthogonal table

將滅菌牛津杯用鑷子夾取平放在含菌平板上，每個菌種取兩個含菌平板等距離逆時針放置4個牛津杯，并依次標記為 A（25 mg/mL）、B（20 mg/mL）、C（15 mg/mL）、O（DMSO）；D（10 mg/mL）、E（5 mg/mL）、F（2.5 mg/mL）、O（DMSO）。精確吸取0.2 mL各質(zhì)量濃度的桂花黃色素提取液按標記依次加入牛津杯中，DMSO作對照。將平板置于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況，游標卡尺測量抑菌圈直徑[16-18]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）測定

參考微量肉湯稀釋法[19-20]，將供試的4種菌種分別取20 μL接種到裝有不同體積的LB液體培養(yǎng)基（溶菌肉湯培養(yǎng)基）和不同質(zhì)量濃度和體積的桂花色素的試管內(nèi)，每組5只試管從左到右依次標記為1（DMSO，為空白對照）、2（0.5 mg/mL）、3（1.0 mg/mL）、4（1.5 mg/mL）、5（2.0 mg/mL）；每種菌做 3 次重復，放置搖床中于37℃下培養(yǎng)充分振蕩16 h～18 h，取出，觀察試管中液體的渾濁情況。以培養(yǎng)皿中完全無菌生長的最低濃度作為相應(yīng)的樣品對相應(yīng)菌的最小抑菌濃度。

1.2.6 色素在食物防腐中的應(yīng)用

將土豆、牛肉煮熟切成約1 cm3見方的小塊，用桂花黃色素溶液浸泡30 min；鮮榨蘋果汁中加入適量桂花黃色素水溶液。平行試驗中以蒸餾水為對照，進行相同條件的操作。并將兩組處理好的樣品盛裝于滅菌培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 最佳乙醇濃度的確定

乙醇濃度對提取效果的影響結(jié)果如圖1所示。

乙醇濃度對桂花黃色素的提取率影響較大。乙醇濃度在50%～70%范圍內(nèi)，黃色素的提取率隨乙醇濃度的增加，緩慢上升；由70%增至80%時黃色素提取率快速上升，至80%達到最大值，之后提取率開始下降。乙醇作為有機溶劑可以破壞膜蛋白，增加細胞膜的通透性，溶劑進出細胞不受影響，溶解的色素易被溶劑帶出細胞外，桂花黃色素中所含的脂溶性色素較多，乙醇濃度大，有利于這類色素的溶出；但過大的乙醇濃度會在色素溶解的同時帶入其他脂溶性雜質(zhì)，對測試造成較大干擾。因此，最佳乙醇濃度為80%。

圖1 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.1 Results of different ethanol concentration

2.1.2 最佳回流時間的確定

不同回流時間的提取效果見圖2。

圖2 不同回流時間的提取效果Fig.2 Effects of different extraction time

在圖2中可以看出，回流時間40 min時，提取率為10.6%；回流時間增至60 min，提取率增幅較大，達到了14.2%，這說明延長回流時間可以提高色素的提取率。在60 min以后，隨著時間的延長，提取率逐漸降低。綜合提取率、耗能低、成本等各項因素，確定最佳回流時間為60 min。

2.1.3 最佳回流溫度的確定

不同回流溫度的提取效果見圖3。

由圖3可知，50℃～70℃范圍內(nèi)，桂花黃色素提取率隨溫度升高而增大，在70℃時提取率最大；溫度大于70℃時，桂花色素提取率反而下降。溫度過高，易引起溶劑回流率降低；還可引起色素變質(zhì)或者分解。故確定70℃為最佳提取溫度。

圖3 不同回流溫度的提取效果Fig.3 Results of different extraction temperature

2.1.4 最佳料液比的確定

料液比對提取效果的影響見圖4。

圖4 料液比對提取效果的影響Fig.4 Results of different material/liquid ratio

由圖4可以看出，在其他條件相同的情況下，料液比的增加對桂花色素的提取率影響較大，桂花色素的提取率隨乙醇體積的增加而上升，當料液比為1∶25（g/mL）時達到最高；繼續(xù)增加料液比，黃色素的提取率增幅趨于平緩，說明絕大多數(shù)色素已經(jīng)被完全提取。所以從色素提取效果和節(jié)約成本兩方面考慮，確定最佳料液比為 1 ∶20（g/mL）。

2.2 正交試驗結(jié)果

2.2.1 正交試驗的極差和方差的分析

正交試驗及極差分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗及極差分析Table 2 Orthogonal test design and results

續(xù)表2 正交試驗及極差分析Continue table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2極差分析結(jié)果可知，微波預(yù)處理的前提下，各因素對桂花黃色素提取率的影響程度依次為C（回流溫度）＞A（乙醇濃度）＞D（料液比）＞B（回流時間）。根據(jù)正交結(jié)果進行直觀分析和考慮綜合因素，最佳的提取工藝為A2B3C3D2，乙醇濃度80%，回流時間80 min，回流溫度80℃，料液比1∶20（g/mL）。由表4方差分析可知，F(xiàn)比＜F臨界值，即各因素對桂花黃色素的提取率的影響均不顯著。

2.2.2 驗證性試驗

為進一步考察正交試驗優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按照正交試驗最佳條件，進行3次平行試驗，得到平均提取率為18.42%。

2.3 桂花黃色素的抑菌效果

在測試條件下，以牛津杯法測定的桂花黃色素對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌的抑菌效果如表4所示。

表4 不同濃度桂花黃色素提取液的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of different concentration on yellow pigment of Osmanthus fragrans

表4結(jié)果表明桂花黃色素對4種供試菌種具有較好的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為明顯，枯草桿菌的抑菌活性相對較弱，且抑菌效果與黃色素的質(zhì)量濃度成正相關(guān)。

2.4 最低抑菌濃度（MIC）測定

桂花黃色素對供試菌種的最低抑菌濃度見表5。

表5 桂花黃色素對供試菌種的最低抑菌濃度（MIC）Table 5 Minimal inhibitory concentration（MIC）of yellow pigment from Osmanthus fragrans

表5為桂花黃色素對金黃色葡萄球菌MIC的測試結(jié)果，1號試管為空白對照，試管內(nèi)細菌生長旺盛，溶液渾濁度高；2號試管中黃色素色素濃度為0.5 mg/mL，該試管內(nèi)液略有渾濁，表明此濃度下細菌的生長未能被完全抑制；而3號色素試管（濃度為1.0 mg/mL），試管液為澄清，表明此濃度下培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長被完全抑制。故桂花黃色素對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.0 mg/mL。同理知，桂花黃色素對大腸桿菌、枯草桿菌、沙門桿菌的最低抑菌濃度均為1.5 mg/mL。

2.5 桂花黃色素在食品防腐中的應(yīng)用

桂花黃色素的防腐效果見表6。

表6 桂花黃色素的防腐效果Table 6 The antiseptic effect of yellow pigment from Osmanthus fragrans

由表6可知，桂花色素處理后的蘋果汁、土豆及牛肉樣品，色澤，氣味及質(zhì)地變化較小，只有牛肉表面出現(xiàn)少許菌斑。而空白樣品變色、腐爛，出現(xiàn)刺鼻異味，樣品表面微生物生長明顯。由此可見，桂花黃色素對淀粉類、肉類及水果類食品具有一定的防腐作用。

3 結(jié)論

桂花色素色澤鮮艷，易溶于乙醇等極性溶劑，微波輔助提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度80%，回流時間 80 min，回流溫度 80℃，料液比 1∶20（g/mL）。桂花黃色素具有較好的抑菌及防腐性能。桂花黃色素在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊開發(fā)前景，因其不僅可作為天然色素用于食品著色，還可同時實現(xiàn)防腐、抑菌活的雙重功效，大大提高了色素的經(jīng)濟價值，具有良好的應(yīng)用前景。

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Extraction of Yellow Pigment from Osmanthus fragrans by Microwave Pretreatment and Their Antibacterial Activity

CHEN Guang1，SHI Juan2
（1.Hanzhong Central Hospital，Hanzhong 723000，Shaanxi，China；2.School of Chemical and Environmental Sciences，Shaanxi Sci-tech University，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

The extraction process of yellow pigment from Osmanthus fragrans assisted by microwave pretreatment was studied by single factor experiment which controlled the ethanol concentration，extraction time，extraction temperature and solid-to-liquid ratio.And based on single experiment，the orthogonal experiment showed the optimum extraction conditions were ethanol concentration 80%，extraction time 80 min，extraction temperature 80℃ and material to liquid ratio 1 ∶20（g/mL）.In addition，the results of antibacterial experiment showed that the yellow pigment had different inhibition effects on four kinds of bacteria，and inhibition ability on Staphylococcus aureus was the strongest.The MIC of Staphylococcus aureus was 1.0 mg/mL，and Escherichia coli，Bacillus subtilis and Salmonella was 1.5 mg/mL.

Osmanthus fragrans yellow pigment；microwave-assisted pretreatment；extraction；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.004

國家自然科學基金（21373132）；陜西省教育廳2015年科學研究項目（15JK1141）

陳光（1981—），女（漢），本科，研究方向：藥物活性研究。

2017-03-15