應(yīng)瑞峰，黃梅桂，王耀松，李婷婷，范龔健，吳彩娥

（南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210037）

桑黃子實體與桑黃菌絲多糖抗氧化活性研究

應(yīng)瑞峰，黃梅桂，王耀松*，李婷婷，范龔健，吳彩娥

（南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210037）

桑黃是我國一種非常珍貴的功能性真菌，多糖是其的主要生物活性成分，試驗提取桑黃子實體多糖和二種不同生長期的菌絲多糖，對其進行抗氧化試驗，以總抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力、對Fe2+螯合能力、超氧陰離子自由基清除能力測定5種方法評價其抗氧化活性，試驗結(jié)果表明桑黃子實體多糖表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，對比桑黃子實體多糖與桑黃菌絲多糖，子實體多糖抗氧化效果顯著高于菌絲體多糖，不同生長期的菌絲多糖也呈現(xiàn)出不同的抗氧化性，生長期短的菌絲多糖表現(xiàn)出更強的抗氧化性。試驗結(jié)果為今后桑黃產(chǎn)業(yè)提供重要的理論基礎(chǔ)。

桑黃；多糖；菌絲；抗氧化

自古以來桑黃都是一種非常珍貴的功能性真菌，屬于擔子菌亞門層菌綱多孔菌目多孔菌科針層菌屬，有些地方也叫做桑臣、桑耳。桑黃具有多種活性功能，尤其現(xiàn)代科學(xué)研究表明其具有非常突出的抗氧化和抗癌效果，因這一特性桑黃引起了世界各國的關(guān)注，尤其日本、韓國、中國和東南亞等國的科學(xué)家[1-4]。桑黃功能性成分很多，化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)都十分復(fù)雜，不同種屬的桑黃品種、不同的地域和不同的提取方法都會造成其化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)的差異。桑黃的主要化學(xué)成分很多，主要有多糖、萜類、黃酮、甾體的香豆素等[3-4]。研究表明多糖是桑黃的主要生物活性成分，其作用主要為抗氧化和抗癌[5-8]。桑黃多糖可存在于桑黃子實體中、發(fā)酵液和菌絲體中。野生桑黃生長周期長，要長成適合藥用的大小，需要很長的時間，由于野生桑黃稀少，加上近年來市場需求量巨大、價格昂貴，野生桑黃自然分布已經(jīng)急劇減少，特別是東北地區(qū)該資源已經(jīng)破壞性開發(fā)，幾乎已無法恢復(fù)。市場對桑黃巨大的需求與桑黃培育的困難有著較大的沖突，培育高活性桑黃菌絲是一很重要的解決途徑[7-9]。因此，本試驗對桑黃子實體和桑黃菌絲的多糖分離純化及活性成分的抗氧化能力進行研究，期望研究結(jié)果能為桑黃的研究、開發(fā)和綜合利用提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實體與桑黃菌絲，由淳安千島湖桑都食用菌專業(yè)合作社提供；試驗用水為超純水；DPPH：Sigma公司；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所；乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、硫酸亞鐵、水楊酸和雙氧水等皆為分析純；96孔細胞培養(yǎng)板：Costar公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：Gibco公司；DMSO：Sigma 公 司 ；EnoGeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）細胞活力檢測試劑盒：京恩晶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-SM200超聲波微波復(fù)合反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；QT-58A智能紫外檢測儀：上海琪特分析儀器有限公司；TU-1800PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；ChemBase CBSCJ-1FD超凈工作臺；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋SANYO；XD-202熒光倒置生物顯微鏡：南京江南永新光學(xué)有限公司；Thermo MK3酶標儀：美國熱電公司。

1.3 提取方法與試驗條件

桑黃多糖的提取工藝為：桑黃子實體或菌絲→粉碎→超聲波熱水浸提→過濾→80%乙醇醇沉→離心→沉淀復(fù)溶→50%乙醇醇沉→干燥→多糖。

1.4 試驗條件

1.4.1 桑黃多糖及蛋白含量測定

1.4.1.1 多糖含量的測定

本試驗應(yīng)用苯酚-硫酸法測桑黃多糖的含量，經(jīng)過試驗得到苯酚-硫酸法標準曲線方程為：Y=0.010 9X+0.005 2，R2=0.978 9，式中：X 為葡萄糖的濃度，μg/mL；Y為該濃度下對應(yīng)的488 nm處吸光值。樣品溶液稀釋后用同樣的方法測定，根據(jù)計算所得的標準曲線方程求桑黃多糖的濃度。

1.4.1.2 蛋白含量的測定

本試驗應(yīng)用考馬斯亮藍G-250法測蛋白含量，得到考馬斯亮藍G-250法標準曲線方程為Y=0.005 3X+0.018 8，R2=0.994 5，式中：X 為蛋白濃度，μg/mL；Y 為該濃度下對應(yīng)595 nm處吸光值。樣品溶液稀釋后用同樣的方法測定，并根據(jù)標準曲線方程求得其濃度。

1.4.2 抗氧化能力的測定

以總抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力、對Fe2+螯合能力、超氧陰離子自由基清除能力測定5種方法評價其抗氧化活性。

1.4.2.1 總抗氧化能力

在10 mL試管中加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液和3.9mL工作液，充分混勻，于23℃暗處孵育6min，測定混合溶液在734 nm處的吸光值。無水乙醇作空白對照。以無水乙醇調(diào)零。總抗氧化能力按以下公式計算：

1.4.2.2 清除DPPH自由基能力

取2 mL不同濃度的樣品溶液，依次加入2 mL、0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分混勻，靜止30 min后于517nm處測定吸光度值A(chǔ)樣品。以2mL無水乙醇+2mL不同濃度的樣品溶液為對照測定A對照，2 mL DPPH+2 mL蒸餾水為空白測定A空白。樣品清除DPPH自由基的能力計算公式：

1.4.2.3 清除羥基自由基能力

取1 mL、0.75 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（pH值為7.4），再加入1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵，最后再加入不同濃度的樣品，充分混勻后，加入1 mL、0.1%H2O2，于37℃溫水浴中反應(yīng)60 min，測定樣品組在536 nm處的吸光度值A(chǔ)樣品。以蒸餾水代替不同濃度的樣品測定值為A損傷，以蒸餾水代替樣品溶液及H2O2測定值為A未損傷。樣品對羥基自由基的清除率計算公式為：

1.4.2.4 Fe2+螯合能力

在試管中加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL、1 mmol/L FeCl2溶液，充分混勻，靜置15 min，再加入0.2 mL、2.5 mmol/L Ferrozine，加入蒸餾水將試管補足至5 mL，于室溫下靜置20 min后于562 nm處測定吸光度值A(chǔ)樣品。以蒸餾水代替FeCl2測定值為A空白。對Fe2+螯合能力測定的計算公式為：

1.4.2.5 超氧陰離子自由基清除能力測定

稱取樣品分別配制成不同濃度的溶液，配制0.1 mol/L Tris溶液和0.1 mol/L HCl溶液，混勻制得0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液。用10 mmol/L HCl配制配制25 mmol/L的鄰苯三酚溶液測定鄰苯三酚自氧化速率：移取各個濃度的樣品待測液1 mL加入到10 mL透明刻度試管中，再移取4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，振蕩混勻。水浴鍋設(shè)置25℃水浴20 min。加入20 μL，25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，同樣預(yù)溫。立即計時。振蕩搖勻后倒入少量待測夜比色皿內(nèi)潤洗，用紫外分光光度計測定于325 nm吸光度，每隔1 min測定一次。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚作為參比溶液。自氧化速率的計算公式：

測定樣品對鄰苯三酚自氧化的抑制率：在10 mL透明刻度試管中加入4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液。加入各個濃度的樣品待測液1 mL，水浴鍋設(shè)置25℃水浴20 min。加入20 μL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液。立即計時。振蕩搖勻后倒入少量待測夜比色皿內(nèi)潤洗，測定在325 nm處每隔1min其吸光度。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚作為參比溶液。按公式計算超氧陰離子自由基抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃多糖各組分得率及多糖和蛋白含量

多糖各組分得率及多糖和蛋白含量見表1。

表1 多糖各組分得率及多糖和蛋白含量Table 1 The yield of polysaccharide and the content of polysaccharide and proteins

從表1可見，各組分中，桑黃子實體多糖得率最高達到了5.35%，極顯著高于菌絲體，并且其多糖含量也最高達到了67.33 g/100 g，顯著高于桑黃菌絲。桑黃子實體與菌絲多糖含有的蛋白質(zhì)無顯著差異。

2.2 桑黃多糖抗氧化能力測定

2.2.1 總抗氧化能力

桑黃多糖各組分的總抗氧化能力見圖1。

圖1 桑黃多糖各組分的總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of the polysaccharides from Phellinus igniarius

由圖1得出，桑黃多糖、菌絲3個月、菌絲6個月多糖對ABTS自由基清除率都隨濃度的增加而升高。桑黃子實體多糖的影響變化最明顯，濃度在0～4 mg/mL時，ABTS自由基清除率上升較快，4 mg/mL之后ABTS自由基清除率放緩，在8 mg/mL時，ABTS自由基清除率達到92.19%，接近VC。菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對ABTS自由基清除效果都弱于桑黃子實體多糖，菌絲3個月多糖清除效果略強于菌絲6個月多糖。量效關(guān)系得出桑黃子實體多糖清除ABTS自由基的IC50為 1.897 2 mg/mL。

2.2.2 桑黃多糖對DPPH自由基的清除率

桑黃多糖對DPPH的清除率曲線見圖2。

圖2 桑黃多糖對DPPH自由基的清除率曲線Fig.2 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius DPPH radicals

圖2得出，桑黃子實體多糖、菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對DPPH自由基清除率都隨濃度的增加而升高。子實體多糖的影響變化最明顯，濃度在0～200 μg/mL時，DPPH自由基清除率上升較快，200μg/mL之后DPPH自由基清除率放緩，在800 μg/mL時，DPPH自由基清除率達到82.05%。菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對DPPH自由基清除效果弱于桑黃子實體多糖，菌絲3個月多糖對DPPH自由基清除效果效果略強于菌絲6個月多糖。

2.2.3 桑黃多糖對羥基自由基的清除率

桑黃多糖對羥基自由基的清除作用見圖3。

圖3 桑黃多糖對羥基自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of the polysaccharides from Phellinus igniarius on hydroxyl radicals

由圖3得出，桑黃子實體多糖、菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對羥基自由基清除率都隨濃度的增加而升高。桑黃子實體多糖的影響變化最明顯，一直呈現(xiàn)上升趨勢，在2 mg/mL時，羥基自由基清除率達到54%，但相比VC的對照試驗，桑黃子實體多糖對羥基自由基清除效果并不是很明顯。菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對羥基自由基清除效果弱于桑黃子實體多糖，菌絲3個月多糖清除效果略強于菌絲6個月多糖，可以達到18.62%。桑黃子實體多糖的羥基自由基清除能力隨濃度的增加而提高，此結(jié)果驗證了紅外光譜分析中3種桑黃多糖含有不飽和鍵。

2.2.4 桑黃多糖對Fe2+螯合能力

桑黃多糖對Fe2+螯合能力見圖4。

圖4 桑黃多糖對Fe2+離子螯合能力Fig.4 The chelating ability of the polysaccharides from Phellinus igniarius to Fe2+

由圖4得出，桑黃子實體多糖、菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對Fe2+螯合能力都隨濃度的增加而升高，桑黃子實體多糖的影響變化最明顯，一直都呈現(xiàn)出上升的狀態(tài)，在1.6 mg/mL時，F(xiàn)e2+螯合能力達到89.39%，與EDTA的對照試驗相比，桑黃子實體多糖的Fe2+螯合能力雖然不及EDTA，但也展現(xiàn)出很強的能力。菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對Fe2+螯合能力效果均較高，菌絲3個月多糖Fe2+螯合能力略強，可以達到65.25%。量效關(guān)系得出桑黃子實體多糖Fe2+螯合能力的IC50為0.235 4 mg/mL。

2.2.5 桑黃多糖對超氧陰離子自由基的清除率

桑黃多糖對超氧陰離子自由基的清除率見圖5。

圖5 桑黃多糖對超氧陰離子自由基的清除率Fig.5 Superoxide radical scavenging activities of the polysaccharides from Phellinus igniarius

由圖5得出，桑黃子實體多糖、菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對超氧陰離子清除率都隨濃度的增加而升高，桑黃子實體多糖的影響變化最明顯，濃度在0～0.4 mg/mL時，超氧陰離子清除率上升較快，0.4 mg/mL之后超氧陰離子清除率放緩，在3.2 mg/mL時，超氧陰離子清除率達到59.21%。菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖對超氧陰離子清除效果都弱于桑黃子實體多糖，菌絲3個月多糖效果略強于菌絲6個月多糖，可以達到33.27%。量效關(guān)系得出桑黃子實體多糖抑制超氧陰離子的IC50為0.897 2 mg/mL。

由上述抗氧化試驗得出，桑黃子實體多糖具有較好的抗氧化性，菌絲3個月多糖、菌絲6個月多糖也具有抗氧化活性，但效果遠低于桑黃子實體多糖。之前的研究發(fā)現(xiàn)桑黃子實體中多糖、黃酮和三萜的含量會因生長的樹種不同，在活性成分含量上也會存在差異，比如一年生桑黃子實體，其多糖、黃酮類和三萜的含量要高于二年生的桑黃，抗氧化活性也優(yōu)于二年生桑黃[10-11]。本研究對比了菌絲體和子實體中多糖，不僅多糖提取率有所差異，而且其多糖活性也存在很大差異，另外不同生長期的桑黃菌絲體多糖活性也存在顯著差異。雖然桑黃菌絲比較容易培育，但其活性還是遠低于子實體中的多糖，在今后的研究中不但要培育更經(jīng)濟的桑黃菌絲跟重要的是能培育出活性更強的桑黃菌絲。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明桑黃子實體多糖抗氧化效果顯著高于桑黃菌絲體多糖，不同生長期的菌絲多糖也呈現(xiàn)出不同的抗氧化性，生長期短的菌絲多糖表現(xiàn)出更強的抗氧化性。要解決桑黃供需的矛盾，生產(chǎn)廉價量大的桑黃菌絲體是很好的一個解決問題的方法，但目前菌絲體多糖活性不如子實體多糖，今后需培育更高活性的菌絲，此試驗結(jié)果能為今后桑黃產(chǎn)業(yè)提供重要的理論基礎(chǔ)。

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Antioxidant Activity of Polysaccharides from Phellinus Igniarius Fruiting Body and Mycelium

YING Rui-feng，HUANG Mei-gui，WANG Yao-song*，LI Ting-ting，F(xiàn)AN Gong-jian，WU Cai-e
（College of Light Industry of Science and Engineering，Nanjing Forest University，Nanjing 210037，Jiangsu，China）

Phellinus igniarius was a very valuable function fungi in China，polysaccharides were the main bioactive components of Phellinus igniarius.In this experiment，the extractions of polysaccharide from fruiting body and two growth phase of mycelium were studied.The antioxidant activity was evaluated by 5 methods：total antioxidant capacity，scavenging ability of DPPH radical，scavenging effects on hydroxyl radicals，chelating ability to Fe2+，and scavenging ability of superoxide radical，the antioxidant experiments showed that the antioxidant effect of Phellinus igniarius polysaccharide was significantly higher than that of mycelium polysaccharide，different growth period mycelia polysaccharide had different antioxidant activity，polysaccharides within short growing period mycelium exhibited stronger antioxidant activity.The experimental results provided an important theoretical basis for industrial of Phellinus igniarius in the future.

Phellinus igniarius；polysaccharides；mycelium；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.001

國家自然青年科學(xué)基金資助項目（31600153）；南京林業(yè)大學(xué)引進高層次人才和高層次留學(xué)回國人員科研基金（GXL2013026）；大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目

應(yīng)瑞峰（1982—），男（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物。

*通信作者

2017-07-18